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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410529336.7 (22)申请日 2014.10.10 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104342390 A (43)申请公布日 2015.02.11 (83)生物保藏信息 CGMCC No. 9638 2014.09.04 (73)专利权人 中国科学院天津工业生物技术研 究所 地址 300380 天津市滨海新区空港经济区 西七道32号 (72)发明人 张大伟李莎董会娜夏苗苗 房欢周文娟郑平 (74)专利代理机构 天津市杰盈专利代理有限公 司 122。
2、07 代理人 朱红星 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12P 19/42(2006.01) C12R 1/01(2006.01) 审查员 白鸽 (54)发明名称 一种苜蓿中华根瘤菌株及其组合物与应用 (57)摘要 本发明公开了一种能够用于发酵生产维生 素B12的苜蓿中华根瘤菌， 其保藏号CGMCCNo. 9638。 本发明还公开了苜蓿中华根瘤菌发酵生产 维生素B12的生产和制备方法， 包括菌株的发酵 培养条件以及发酵液中维生素B12的提取方法。 将固体培养基上的菌株接种到三角瓶中作为种 子液， 以10%的接种量接种到发酵培养基中30 ， 200rpm发酵培养20。
3、0h后收集发酵液， 添加 转化剂转化为氰基钴胺素。 维生素B12作为调节 机体生长过程中特殊的因子， 被广泛应用在饲 料、 添加剂、 医药、 化妆品等行业， 要求量逐年上 升。 由于菌株发酵过程易于控制， 不受季节等因 素的影响， 原材料要求简单， 发酵生产发展为主 要的生产方式。 权利要求书1页 说明书9页 附图2页 CN 104342390 B 2017.03.15 CN 104342390 B 1.一种苜蓿中华根瘤菌株 （Sinorhizobium medicae） TIB.SM.2013， 从土壤中分离得 到， 由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏， 保藏号CGMCC No。
4、. 9638。 2.权利要求1所述苜蓿中华根瘤菌株 （Sinorhizobium medicae） TIB.SM.2013在用于生 物合成维生素B12方面的应用； 其在发酵液中产生维生素B12的浓度至少为50 mg/L。 3.一种采用权利要求1所述苜蓿中华根瘤菌株 （Sinorhizobium medicae） TIB.SM.2013 生产维生素B12的培养和制备方法， 其特征在于按如下的步骤进行： （1） 将苜蓿中华根瘤菌株斜面菌种接种到装有培养基的三角瓶中， 在28-32 ， 150- 220 rpm摇床振荡条件下， 培养36 h， 制备种子液； （2） 将种子液按5-20%的接种量 （V。
5、/V） 接种至液体发酵培养基， 然后在25-30 培养6-9 天， 得到苜蓿中华根瘤菌发酵液； （3） 在步骤 （2） 获得的发酵液中添加8%亚硝酸钠溶液和冰醋酸1:1 （V/V） ， 沸水浴20-30 min释放菌体中的产物并转化为氰基钴胺素， 10000-12000 rpm离心10 min收集上清液分离 检测产物； 所述培养基按重量由以下组分组成： 6-40份碳源、 5-30份有机氮源、 0.5-10份无机盐， 加水至1000份， 调节pH=6.8-7.0； 所述无机盐是由下述原料组成： 七水硫酸镁0.1-2 g/L、 磷酸氢二钾0.5-3 g/L、 硫酸锌0.2-1 g/L、 硫酸锰0.。
6、1-3 g/ L、 氯化钴0.3-5 g/L、 5、 6二甲基苯并咪唑0.01-2 g/L； 所述的发酵培养基： 蔗糖60 g/L， 甜菜碱2 g/L、 玉米浆20 g/L、 K2HPO4 1.65 g/L、 MgSO4 1.6 g/L、 ZnSO4 0.8 g/L、 MnSO4 0.8 g/L、 CoCl2 0.6 g/L、 DMB 0.05 g/L， 其余为水， 于110 灭菌15 min， 在250 ml三角瓶中装液量为30 ml。 4.权利要求3所述采用苜蓿中华根瘤菌株生产维生素B12的培养和制备方法， 其特征是 所述碳源为蔗糖、 麦芽糖、 乳糖或甜菜碱。 5.权利要求4所述采用苜蓿中。
7、华根瘤菌株生产维生素B12的培养和制备方法， 其特征是 所述有机氮源为玉米浆、 酵母抽提物、 酵母浸粉、 酵母浸膏、 酵母粉、 酵母自溶粉或玉米浆 粉。 权利要求书 1/1 页 2 CN 104342390 B 2 一种苜蓿中华根瘤菌株及其组合物与应用 技术领域 0001 本发明属于生物资源、 微生物发酵和大分子天然产物生物合成技术领域。 涉及一 株生产维生素B12的菌株， 苜蓿中华根瘤菌 （Sinorhizobium medicae） ， 以及利用该菌株发酵 制备维生素B12的方法， 更具体的说是一种苜蓿中华根瘤菌株及其组合物与应用。 背景技术 0002 维生素B12又叫钴胺素 （Cobal。
8、amin） ， 属于咕啉类化合物， 是目前唯一一个含有金属 离子的维生素类化合物， 从维生素B12的结构可以看出， 其基本结构包括咕啉环和配基。 中心 咕啉环由相连的4个吡咯和1个钴原子组成， 钴螯合在4个吡咯中心。 咕啉环上方的配基种类 不同， 构成不同类型的钴胺素， 一般可以构成四个类型：（1） 当配基为氰基时形成氰基钴胺 素 （Cyanocobalamin） ；（2） 当配基为羟基时形成羟基钴胺素 （Hydroxocobalamin） ；（3） 当配 基为脱氧腺苷时形成脱氧腺苷钴胺素 （Adenosylcobalamin） ；（4） 当配基为甲基时形成甲基 钴胺素 （Methylcoba。
9、lamin） 。 0003 0004 一般药品中钴胺素的存在形式为氰基钴胺素， 但是， 在体内能够发挥作用的钴胺 素为腺苷钴胺素， 氰基钴胺素需要转化为腺苷钴胺素之后才能发挥治疗作用。 因此， 对于一 些较严重的患者， 需要直接注射避光保存的腺苷钴胺素达到快速治疗的效果。 0005 维生素B12合成方法包括人工合成法和微生物发酵法， 人工合成过程中存在着不可 逾越的问题， 因此， 科学家们又开始探索维生素B12在微生物体内的合成过程， 来解决维生素 B12的生产问题。 生产菌株主要有厌氧发酵菌株费氏丙酸杆菌、 谢氏丙酸杆菌等， 好氧发酵菌 株脱氮假单胞菌、 沼泽红假单胞菌、 粗糙诺卡氏菌等。 。
10、微生物合成维生素B12有两条途径： 一 种是好氧途径； 另一种是厌氧途径。 好氧途径首先合成咕啉环， 然后将钴原子螯合到环内； 而厌氧途径是将钴原子螯合到卟啉环中后， 再结合其他原子形成含有钴原子的咕啉环。 其 说明书 1/9 页 3 CN 104342390 B 3 它合成过程中， 厌氧途径和好氧途径相同， 只是每种途径催化的酶不同。 0006 微生物法、 比色测定法、 间接测定法、 高效毛细管电泳法、 薄层层析法和高效液相 色谱法检测发酵液中B12的含量。 但微生物法检测耗时长， 灵敏度低， 不利于发酵过程中检 测； 比色法仅适于分析药品等成分比较简单的样品， 但对于发酵或者成分复杂的样品。
11、存在 干扰作用； 间接法通过钴含量的变化推算维生素B12的含量， 虽然检测方法准确快速， 但是样 品本身含有钴， 因而会造成很大误差； 高效毛细管电泳法由于检测限低， 会导致食品等含有 微量维生素B12的检测有局限性； 薄层层析法由于上样量不能统一， 所以在定量检测中具有 局限性； 高效液相色谱法可以检测含量较低， 成分复杂的样品中维生素B12的含量， 具有简 便、 快速、 准确的优点。 发明内容 0007 本发明的目的在于克服现有资源的不足， 一方面提供一株土壤中分离得到苜蓿中 华根瘤菌TIB.SM.2013保藏号CGMCC No. 9638。 0008 本发明的另一个方面是提供一种维生素B。
12、12的生物合成制备方法， 通过利用苜蓿中 华根瘤菌TIB.SM.2013保藏号CGMCC No. 9638， 液体长时间发酵而制备维生素B12。 0009 为实现上述目的本发明公开了如下的技术内容： 0010 一种苜蓿中华根瘤菌株 （Sinorhizobium medicae） TIB.SM.2013， 从土壤中分离得 到， 由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏， 保藏号CGMCC No. 9638， 其详 细的技术内容如下： 0011 （1） 本申请人于2013年6月在天津市三叶草种植土样中分离、 筛选到一株高效的菌 株TIB.SM.2013。 经过形态观察， 生理生化试验和16。
13、SrDNA鉴定， 属于苜蓿中华根瘤菌株 （Sinorhizobium medicae） 。 申请人于2014年9月4日将该菌株送交中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心保藏， 保藏号CGMCC No. 9638。 保藏日期： 2014年9月4日； 单位地 址： 北京市朝阳区北辰西路1号院。 0012 （2） 苜蓿中华根瘤菌株 （Sinorhizobium medicae） TIB.SM.2013的细菌学特征及生 理生化指标： 0013 该苜蓿中华根瘤菌TIB.SM.2013保藏号CGMCC No. 9638。 在蔗糖琼脂培养基上 生长较慢， 于30 有氧条件下生长5天， 菌落直径为3-5。
14、 mm， 呈为红褐色， 椭圆， 菌落光滑； 菌落形态特征参见图1。 该菌株呈短杆状， 中间具有颗粒， 长3-8 m， 无孢子。 0014 本发明所提供的苜蓿中华根瘤菌TIB.SM.2013， 保藏号CGMCC No. 9638。 G+C mol的%含量为63.20%， 该菌株的适宜生长温度是28-30 ， 液体长时间发酵时可以生物合 成维生素B12。 0015 本发明进一步公开了苜蓿中华根瘤菌株 （Sinorhizobium medicae） TIB.SM.2013， 保藏号CGMCC No.9638， 在制备生物合成维生素B12方面的应用。 其在发酵液中产生维生素 B12的浓度至少为50mg。
15、/L。 0016 本发明所述的苜蓿中华根瘤菌株 （Sinorhizobium medicae） TIB.SM.2013， 其基因 组DNA的G+C mol的%含量为63.20%； 其中G： C的摩尔比为1： 2.3。 0017 本发明更进一步公开了一种组合物， 它包括苜蓿中华根瘤菌发酵液、 苜蓿中华根 瘤菌株 （Sinorhizobium medicae） TIB.SM.2013， 保藏号CGMCC No. 9638， 组合物包括： 维生 说明书 2/9 页 4 CN 104342390 B 4 素B12、 玉米浆、 蔗糖、 DMB、 S-腺苷甲硫氨酸等。 0018 本发明同时也公开了苜蓿中华。
16、根瘤菌株 （Sinorhizobium medicae） TIB.SM.2013， 保藏号CGMCC No. 9638生产维生素B12的培养和提取方法， 其特征在于按如下的步骤进行： 0019 （1） 将苜蓿中华根瘤菌株斜面菌种接种到装有培养基的三角瓶中， 在28-32 ， 150-220 rpm摇床振荡条件下， 培养36 h， 制备种子液； 0020 （2） 将种子液按5-20%的接种量 （V/V） 接种至发酵培养基， 然后在25-30 培养6-9 天， 得到苜蓿中华根瘤菌发酵液； 0021 （3） 在步骤 （2） 获得的发酵液中添加8%亚硝酸钠溶液和冰醋酸1:1 （V/V） ， 沸水浴 2。
17、0-30 min释放菌体中的产物并转化为氰基钴胺素， 10000-12000 rpm离心10 min收集上清 液分离检测产物 0022 所述培养基按重量由以下组分组成： 0023 6-40份的碳源、 5-30份的有机氮源、 0024 0.5-10份的无机盐， 加水至1000份， 调节pH=6.8-7.0。 0025 所述碳源为蔗糖、 麦芽糖、 乳糖或甜菜碱。 所述有机氮源为玉米浆、 酵母抽提物、 酵 母浸粉、 酵母浸膏、 酵母粉、 酵母自溶粉或玉米浆粉。 0026 所述无机盐是由下述重量份数的原料组成： 0027 七水硫酸镁MgSO4 0.1-2 g/L、 磷酸氢二钾0.5-3 g/L、 硫酸。
18、锌0.2-1 g/L、 0028 硫酸锰0.1-3 g/L、 氯化钴0.3-5 g/L、 5、 6二甲基苯并咪唑0.01-2 g/L。 0029 本发明更加详细的描述如下： 0030 一种维生素B12的制备方法， 包括： 0031 (a)在液体培养基中培养苜蓿中华根瘤菌TIB.SM.2013； 和 （b） 将培养的苜蓿中华 根瘤菌TIB .SM .2013在其生长期内接种至发酵培养基， 由此通过苜蓿中华根瘤菌 TIB.SM.2013使发酵培养基发酵。 优选地， 苜蓿中华根瘤菌TIB.SM.2013获自琼脂固体培养 基菌种。 还优选地， 培养的苜蓿中华根瘤菌TIB.SM.2013按5-15%的接。
19、种量 （V/V） 接种至发酵 培养基。 进一步优选地， 步骤 （a） 的培养在约20-32 、 优选约25-30 进行至少5天， 例如 约5-10天， 优选约5-8天， 更优选5-6天.步骤 （b） 的培养在约20-32 、 优选约25-30 进行 至少5天， 例如约7-20天， 优选约8-15天， 更优选约10-12天。 更近一步地， 培养在摇床上进 行。 仍进一步地， 所述摇床的转速被设定为约150-220 rpm。 通过该方法， 发酵液中维生素B12 的浓度至少为50 mg/L， 优选至少为70 mg/L， 更优选至少为80 mg/L， 还更优选至少为100 mg/L， 进一步优选至少为。
20、120 mg/L， 140 mg/L， 160 mg/L或180 mg/L。 0032 更具体地维生素B12的制备方法包括如下步骤： 0033 （1） 将苜蓿中华根瘤菌斜面菌种接种到装有培养基的三角瓶中， 在20-32 、 优选 28-32 摇床150-220 rpm振荡条件下， 培养至少1天， 例如约1-10天， 优选约1-5天， 更优选 1-2天， 制备种子液； 0034 （2） 将种子液按5-20%的接种量 （V/V） 接种至发酵培养基， 发酵培养基在250 ml三 角瓶中的装液量为30-60 ml， 然后在25-32 、 优选28-30摇床150-220 rpm培养至少5 天， 例如约。
21、6-15天， 优选约7-12天， 更优选约9-12天， 得到苜蓿中华根瘤菌发酵液； 0035 （3） 发酵结束后， 向发酵液中添加8%亚硝酸钠溶液和冰醋酸1:1 （V/V） ， 沸水浴20- 30 min释放菌体中的产物并转化为氰基钴胺素， 10000-12000 rpm离心10 min收集上清液 说明书 3/9 页 5 CN 104342390 B 5 分离检测维生素B12； 0036 所述的液体种子培养基的组成为： 甜菜碱0.1-10 g/L （优选1-6 g/L） 、 玉米浆10- 50 g/L （优选15-30 g/L） 、 K2HPO4 0.5-3 g/L （1-2 g/L） 、 蔗。
22、糖10-100 g/L （优选50-80 g/ L） ， MgSO4 1-4 g/L （优选1-2 g/L） ， 其余为水， pH=6.8-7.2， 于250 ml三角瓶中装液量为30- 60 ml。 0037 进一步地， 所述苜蓿中华根瘤菌TIB.SM.2013种子培养基优选为5天。 所述的发酵 培养基的组成为： 碳源 10-80 g/L(优选10-70 g/L)， 氮源5-70g/L(优选5-30 g/L)， 无机盐 1.0-8 g/L(优选 1.5-5 g/L)， 其余为水。 进一步地， 所述发酵培养基的碳源可以包括但不 限于以下的一种或几种： 蔗糖、 麦芽糖、 乳糖、 甜菜碱、 果糖、。
23、 山梨醇； 优选为： 蔗糖10-80 g/ L、 甜菜碱0.1-10 g/L、 麦芽糖10-30 g/L、 乳糖20-40 g/L、 果糖10-80 g/L、 山梨醇2-40 g/ L。 0038 所述发酵培养基氮源可以包括但不限于以下的一种或几种： 玉米浆、 酵母抽提物、 酵母浸粉、 酵母浸膏、 酵母粉、 酵母自溶粉、 玉米浆粉； 玉米浆10-80 g/L、 玉米浆粉10-60 g/ L、 酵母自溶粉20-80 g/L。 0039 所述的发酵培养基的无机盐包括： MgSO4、 K2HPO4、 ZnSO4、 MnSO4、 CoCl2、 DMB （5、 6二 甲基苯并咪唑） 。 更近一步地， 所。
24、述的发酵培养基优选为： 0040 蔗糖20-80 g/L， 甜菜碱0.1-10 g/L、 玉米浆10-50 g/L； 0041 K2HPO4 0.5-3 g/L、 MgSO4 0.1-2 g/L、 ZnSO4 0.2-1 g/L； 0042 MnSO4 0.1-3 g/L、 CoCl2 0.3-5 g/L、 DMB 0.01-2 g/L， 其余为水。 0043 利用本发明方法生产维生素B12， 发酵液中维生素B12的含量至少为30 mg/L， 优选 至少为70 mg/L， 更优选至少为100 mg/L， 进一步优选至少为120 mg/L、 130 mg/L、 140 mg/ L、 160 mg。
25、/L或180 mg/L。 为了减少维生素B12转化过程中的损失， 可以在发酵液中加入亚硝 酸钠溶液增加转化率。 所述发酵液中固液分离方法可以是过滤或离心。 0044 本发明还涉及包括苜蓿中华根瘤菌和发酵液的组合物， 所述发酵液包括维生素 B12， 其中维生素B12在所述发酵液中的浓度至少为30 mg/L， 优选至少为70 mg/L， 更优选至 少为100 mg/L， 进一步优选至少为120 mg/L、 130 mg/L、 140 mg/L、 160 mg/L或180 mg/L。 所 述苜蓿中华根瘤菌为本发明所述的苜蓿中华根瘤菌TIB.SM.2013保藏号CGMCC No. 9638。 0045。
26、 本发明与现有技术相比所具有的积极效果在于： 0046 与目前的微生物发酵方法相比， 这种发酵生产方式简单易于操作； 菌株易于培养， 原料来源广泛， 成分简单， 价廉易得， 没有季节性限制； 产品稳定性好， 易于运输储存， 优化 培养基成分和培养条件提高发酵产量， 弥补目前维生素B12产量过低， 人工合成过程成本过 高的不足， 能够使维生素B12广泛应用在食品、 染料、 化妆品等领域。 附图说明 0047 图1 是苜蓿中华根瘤菌TIB.SM.2013的菌落形态以及发酵液； 其中a为苜蓿中华根 瘤菌形态及大小； b为发酵液； 0048 图2为苜蓿中华根瘤菌生长趋势图； 0049 图3为维生素B1。
27、2产量变化趋势图。 说明书 4/9 页 6 CN 104342390 B 6 具体实施方式 0050 本发明的以下实施例仅用来说明实现本发明的具体实施方式， 这些实施方式不能 理解为是对本发明的限制。 其它的任何在未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、 修饰、 替代、 组合、 简化， 均视为等效的置换方式， 落在本发明的保护范围之内。 0051 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊要求， 均为常规方法。 0052 下述实施例中所使用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0053 实施例1： 0054 根瘤菌合成维生素B12的发酵： 0055 液体种子培养基： 甜菜碱 （。
28、天津士兰科技有限公司） 2 g/L、 玉米浆 （天津市冠前化 工经销部） 20 g/L、 K2HPO4（天津光复化学试剂） 1.65 g/L、 蔗糖 （国药控股天津有限公司） 60 g/L， MgSO4 （天津光复化学试剂） 1.6 g/L， 其余为水， pH=6.8-7.2， 于110 灭菌15 min， 在 250 ml三角瓶中装液量为30 ml。 0056 发酵培养基： 蔗糖 （国药控股天津有限公司） 60 g/L， 甜菜碱 （天津士兰科技有限 公司） 2 g/L、 玉米浆 （天津市冠前化工经销部） 20 g/L、 K2HPO4（天津光复化学试剂） 1.65 g/ L、 MgSO4（天津。
29、光复化学试剂） 1.6 g/L、 ZnSO4（天津光复化学试剂） 0.8 g/L、 MnSO4 （天津光 复化学试剂） 0.8 g/L、 CoCl2（天津光复化学试剂） 0.6 g/L、 DMB （国药控股天津有限公司） 0.05 g/L， 其余为水。 于110 灭菌15 min， 在250 ml三角瓶中装液量为30 ml。 0057 向每瓶液体种子培养基中接种从菌种固体培养基上挑取的约1 cm2大小的苜蓿中 华根瘤菌TIB.SM.2013菌苔， 在30摇床200 rpm培养36 h， 得到种子液。 将种子液按体积比 10%的接种量接入发酵培养基， 30 摇床200 rpm培养8天， 即得苜蓿。
30、中华根瘤菌 TIB.SM.2013保藏号CGMCC No. 9638， 菌体发酵液， 维生素B12在菌体及上清液中积累。 0058 实施例2： 0059 维生素B12的提取： 向菌体发酵液10 ml中加入8%亚硝酸钠和醋酸各2.5 ml混匀， 沸 水浴30 min， 菌体内的维生素B12从胞内转移到细胞外并转化为氰基钴胺素， 得到含有维生 素B12的混合液。 0060 实施例3： 0061 高效液相色谱法检测维生素B12的含量， 具体方法如下： 0062 维生素B12混合液的前处理： 将由实施例2处理得到的维生素B12混合液静置或离 心， 取上清液， 经孔径为0.22 m的滤膜过滤， 透过液即。
31、为维生素B12待测样。 0063 标准品溶液的准备： 精确称取维生素B12标准品 （Sigma， 纯度98%） 10 mg， 于25 ml 容量瓶中用纯水配制成浓度为400 mg/L的标准品贮备液。 再用纯水将贮备液分别稀释成浓 度为40 mg/L、 80 mg/L、 120 mg/L、 160 mg/L、 200 mg/L的标准品溶液。 0064 定性与定量检测： 相同色谱条件下， 对维生素B12标准品与待测样品进行HPLC测定， 将样品色谱图与维生素B12标准溶液色谱图进行对照， 根据保留时间确定样品中维生素B12 的峰。 以标准品维生素B12的浓度与相应的峰面积绘制标准曲线， 在标准品与。
32、样品进样量相 同的情况下， 用外标法定量， 计算出样品中维生素B12的含量， 待测样中维生素B12的浓度即 为发酵液中维生素B12的浓度。 0065 HPLC检测条件： Agilent 1260 高效液相色谱仪， Agilent 518925-902 C18 色谱 说明书 5/9 页 7 CN 104342390 B 7 柱 （250 mm4.6 mm， 粒径5 m） ； 流动相为V （乙腈） ： V （纯水） =15:85， 用醋酸调节流动相的pH 至3.0； 流速0.8 ml/min， 柱温25 ， 进样量15 L， 紫外检测波长361 nm。 0066 每克菌体干重的维生素B12含量的计。
33、算公式： 0067 0068 实施例4： 0069 不同发酵碳源对维生素B12产率的影响 0070 将所述发酵培养基的碳源分别替换为葡萄糖、 麦芽糖、 蔗糖、 果糖、 山梨醇、 乳糖、 玉米粉， 按照实施例1的方法进行发酵培养， 发酵结束后测定发酵液中维生素B12的含量。 蔗 糖作为碳源时， 维生素B12的产量最高， 可作为苜蓿中华根瘤菌TIB.SM.2013菌株液体发酵生 产维生素B12的优选碳源， 其次为麦芽糖。 0071 实施例5： 0072 不同发酵氮源对维生素B12产率的影响 0073 将所述发酵培养基的氮源分别替换为玉米浆、 酵母抽提物、 酵母浸粉、 酵母浸膏、 酵母粉、 酵母自溶。
34、粉、 玉米浆粉、 牛肉膏、 蛋白胨、 酪蛋白冻、 胰蛋白胨、 硫酸铵、 碳酸铵， 按照 实施例1的方法进行发酵培养， 发酵结束后玉米浆作为氮源时， 维生素B12的产量大幅度提 高， 可作为苜蓿中华根瘤菌TIB.SM.2013菌株液体发酵生产维生素B12的优选氮源， 其次为酵 母粉。 0074 实施例6： 0075 发酵培养基中碳源与氮源的含量对维生素B12产率的影响 说明书 6/9 页 8 CN 104342390 B 8 0076 0077 实施例7： 0078 苜蓿中华根瘤菌TIB.SM.2013的优化发酵培养基配方 0079 苜蓿中华根瘤菌TIB.SM.2013经优化发酵培养基碳源、 氮。
35、源的种类及碳源与氮源 的含量， 得到优化培养基配方， 配方如下： 0080 发酵培养基： 蔗糖60 g/L， 甜菜碱2 g/L、 玉米浆20 g/L、 K2HPO4 1.65 g/L、 MgSO4 1.6 g/L、 ZnSO4 0.8 g/L、 MnSO4 0.8 g/L、 CoCl2 0.6 g/L、 DMB0.05 g/L， 其余为水。 于 110 灭菌15 min， 在250 ml三角瓶中装液量为30 ml。 0081 实施例8： 0082 苜蓿中华根瘤菌TIB.SM.2013基因组DNA的G+C mol%含量的测定 0083 根据原核生物基因组特点， 对苜蓿中华根瘤菌进行全基因组测序，。
36、 对测序结果进 行图像识别 （Base calling）， 初步质量分析， 使用二代测序数据质量统计软件 NGSQCToolkit （v2.3） 去除低质量及接头序列等， 过滤参数-cutOffQualScore30。 说明书 7/9 页 9 CN 104342390 B 9 0084 处理过程分为如下几个步骤： 0085 （1） 去除引物及接头序列； 0086 （2） 仅保留质量值高于 30 的位点占编码框总长 70%以上的编码序列; 0087 （3） 去除未识别碱基总数占 编码总长度5%以上的 reads; 0088 0089 基因测序数据统计 0090 实施例9 0091 菌株的分离， 。
37、筛选和鉴定 0092 （1） 菌株分离： 0093 样品采集： 采集花生、 红豆、 绿豆、 黄豆、 大豆、 三叶草、 苜蓿生长土样分离根瘤菌。 每种植物采集样品10份， 分别取根系200 g以及土壤500 g。 将所采集的植物根瘤菌表面灭 菌并压碎。 沾取汁液， 在YMA结晶紫平板培养基上划线， 30 条件下培养。 待长出菌斑后， 挑 取菌斑于YMA刚果红培养基进行划线， 再从YMA刚果红培养基中挑取不吸色的单菌落划线培 养， 在培养过程中观察根瘤菌菌落的生长情况。 重复上述操作， 直到分离到较纯的单菌落， 将其保存于甘油中备用。 0094 （2） 优良菌株的筛选 0095 将纯化后的菌种按照。
38、实施例 （1） 的培养方法在多孔板中发酵培养， 按照实施例 （2） 方法提取维生素B12， 根据实施例 （3） 检测方法， 筛选出一株维生素B12生产菌株。 0096 （3） 菌株的鉴定： 0097 BTB反应鉴定根瘤菌生长速度： 若YMA培养基变黄， 则为产酸菌株， 属于快生根瘤 菌； 若培养基变蓝， 则菌株产碱， 属于慢生型根瘤菌。 0098 石蕊牛奶反应和BTB反应作用相同： 若培养基变红， 则为产酸菌株， 属于快生根瘤 菌； 若培养基变蓝， 则菌株产碱， 属于慢生型根瘤菌。 0099 3-酮基乳糖反应鉴定土壤杆菌和根瘤菌： 根瘤菌不能利用3-酮基乳糖、 柠檬酸和 淀粉。 0100 提取。
39、菌株DNA,根据数据库中保守区序列， 扩增16SrDNA片段， 经鉴定该菌株为苜蓿 中华根瘤菌 （Sinorhizobium medicae） TIB.SM.2013。 0101 实施例10 0102 一种包括苜蓿中华根瘤菌发酵液、 苜蓿中华根瘤菌株 （Sinorhizobium medicae） TIB.SM.2013， 保藏号CGMCC No. 9638的组合物， 其中维生素B12 50 mg/L、 玉米浆3 g/L； 蔗 糖5 g/L、 DMB 0.5 mg/L； S-腺苷甲硫氨酸2 g/L。 说明书 8/9 页 10 CN 104342390 B 10 0103 实施例11 0104 。
40、苜蓿中华根瘤菌株 （Sinorhizobium medicae） TIB.SM.2013的安全性评价 0105 选用健康昆明白小鼠50只， 雌雄各半。 按照性别各分为5组， 每组5只。 将提取的维 生素B12粉末对小鼠一次性饲喂， 剂量为1 mg、 2 mg、 3 mg、 4 mg， 清水为对照组。 饲喂后连续 观察14天， 观察小鼠有无中毒情况表现及死亡发生。 经观察各剂量对雌性和雄性小鼠均未 产生毒性表现及死亡情况， 表明菌株TIB.SM.2013 发酵提取的维生素B12可以安全使用。 说明书 9/9 页 11 CN 104342390 B 11 图1 图2 说明书附图 1/2 页 12 CN 104342390 B 12 图3 说明书附图 2/2 页 13 CN 104342390 B 13 。