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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710051329.4 (22)申请日 2017.01.23 (71)申请人 西北农林科技大学 地址 712100 陕西省西安市杨凌示范区邰 城路3号 (72)发明人 姜雨李冉王喜宏曹春娜 (74)专利代理机构 西安通大专利代理有限责任 公司 61200 代理人 范巍 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种利用普通牛Y染色体单核苷酸遗传标记 鉴定公牛品种的方法 (57)摘要 本 发 明 公。
2、 开 了 一 种 利 用普 通 牛( B o s taurus)Y染色体单核苷酸遗传标记鉴定公牛品 种的方法。 本发明利用基因组重测序结果， 对主 要肉牛和奶牛品种的Y染色体DNA序列进行扫描， 发现了荷斯坦牛、 红安格斯牛、 夏洛来牛、 盖普威 牛、 利木赞牛、 西门塔尔牛、 韩牛、 海福特牛品种 特有的Y染色体SNP位点， 根据这些SNP位点在DNA 水平上鉴别不同品种公牛， 能有效用于上述各品 种的引种及分子标记辅助育种， 为快速建立遗传 资源优良的普通牛种群奠定基础。 权利要求书3页 说明书5页 附图2页 CN 106929570 A 2017.07.07 CN 106929570 A。
3、 1.一种利用普通牛Y染色体单核苷酸遗传标记鉴定公牛品种的方法， 其特征在于： 包括 以下步骤： 提取待鉴定公牛的基因组DNA， 对该基因组DNA在牛Y染色体参考基因组序列中各个与 品种鉴定关联的特征SNP所对应的单核苷酸位点的多态性进行遍历检测， 若检测到突变等 位基因， 则根据检出突变等位基因的位点确定待鉴定公牛的品种； 其中， 所述公牛的品种选自荷斯坦牛、 海福特牛、 夏洛莱牛、 红安格斯牛、 盖普威牛、 利 木赞牛、 西门塔尔牛及韩牛中的至少一种； 所述荷斯坦牛的特征SNP分别为SNP1、 SNP2、 SNP3， SNP1、 SNP2、 SNP3分别定位在牛Y染色 体参考基因组第947。
4、9545、 42835264、 10146565位， 对应位的突变等位基因分别为碱基T、 G、 A； 所述红安格斯牛的特征SNP为SNP4， SNP4定位在牛Y染色体参考基因组第42503008位， 突变等位基因为碱基A； 所述夏洛来牛的特征SNP分别为SNP5、 SNP6， SNP5、 SNP6分别定位在牛Y染色体参考基因 组第6993048、 42380924位， 对应位的突变等位基因分别为碱基G、 C； 所述盖普威牛的特征SNP分别为SNP7、 SNP8， SNP7、 SNP8分别定位在牛Y染色体参考基因 组第10598849、 42508257位， 对应位的突变等位基因均为碱基T； 所。
5、述利木赞牛的特征SNP为SNP9， SNP9定位在牛Y染色体参考基因组第9053955位， 突变 等位基因为碱基A； 所述西门塔尔牛的特征SNP为SNP10， SNP10定位在牛Y染色体参考基因组第7966557位， 突变等位基因为碱基G； 所述韩牛的特征SNP分别为SNP11、 SNP12、 SNP13、 SNP14、 SNP15， SNP11、 SNP12、 SNP13、 SNP14、 SNP15分别定位在牛Y染色体参考基因组第9315953、 9483036、 9317944、 6651950、 3752566位， 对应位的突变等位基因分别为碱基T、 A、 G、 C、 C； 所述海福特牛。
6、的特征SNP为SNP16， SNP16定位在牛Y染色体参考基因组第42405900位， 突变等位基因为碱基A。 2.根据权利要求1所述一种利用普通牛Y染色体单核苷酸遗传标记鉴定公牛品种的方 法， 其特征在于： 利用牛Y染色体的遗传变异信息可以准确区分普通牛品种来源信息。 3.根据权利要求1所述一种利用普通牛Y染色体单核苷酸遗传标记鉴定公牛品种的方 法， 其特征在于： 根据对不同品种公牛的个体Y染色体重测序结果， 确定对应品种公牛的特 征SNP在牛Y染色体参考基因组序列中的位点信息。 4.根据权利要求1所述一种利用普通牛Y染色体单核苷酸遗传标记鉴定公牛品种的方 法， 其特征在于： 所述特征SNP。
7、的确定标准如下： SNP位点必需雄性特异； 同时， 公牛个体在 SNP位点的基因型均为纯合， 不存在杂合状态。 5.根据权利要求1所述一种利用普通牛Y染色体单核苷酸遗传标记鉴定公牛品种的方 法， 其特征在于： 所述牛Y染色体参考基因组选自Btau5.0.1。 6.根据权利要求1所述一种利用普通牛Y染色体单核苷酸遗传标记鉴定公牛品种的方 法， 其特征在于： 所述遍历检测采用基于测序的基因分型方法或基于探针芯片的基因分型 方法。 7.一种如权利要求1-6中任意一项所述的利用普通牛Y染色体单核苷酸遗传标记鉴定 权利要求书 1/3 页 2 CN 106929570 A 2 公牛品种的方法在公牛引种及分。
8、子标记辅助育种中的应用。 8.公牛的特征SNP在公牛引种及分子标记辅助育种中的应用， 其特征在于： 所述公牛的品种选自荷斯坦牛、 海福特牛、 夏洛莱牛、 红安格斯牛、 盖普威牛、 利木赞 牛、 西门塔尔牛及韩牛中的至少一种； 所述荷斯坦牛的特征SNP分别为SNP1、 SNP2、 SNP3， SNP1、 SNP2、 SNP3分别定位在牛Y染色 体参考基因组第9479545、 42835264、 10146565位， 对应位的突变等位基因分别为碱基T、 G、 A； 所述红安格斯牛的特征SNP为SNP4， SNP4定位在牛Y染色体参考基因组第42503008位， 突变等位基因为碱基A； 所述夏洛来牛。
9、的特征SNP分别为SNP5、 SNP6， SNP5、 SNP6分别定位在牛Y染色体参考基因 组第6993048、 42380924位， 对应位的突变等位基因分别为碱基G、 C； 所述盖普威牛的特征SNP分别为SNP7、 SNP8， SNP7、 SNP8分别定位在牛Y染色体参考基因 组第10598849、 42508257位， 对应位的突变等位基因均为碱基T； 所述利木赞牛的特征SNP为SNP9， SNP9定位在牛Y染色体参考基因组第9053955位， 突变 等位基因为碱基A； 所述西门塔尔牛的特征SNP为SNP10， SNP10定位在牛Y染色体参考基因组第7966557位， 突变等位基因为碱基。
10、G； 所述韩牛的特征SNP分别为SNP11、 SNP12、 SNP13、 SNP14、 SNP15， SNP11、 SNP12、 SNP13、 SNP14、 SNP15分别定位在牛Y染色体参考基因组第9315953、 9483036、 9317944、 6651950、 3752566位， 对应位的突变等位基因分别为碱基T、 A、 G、 C、 C； 所述海福特牛的特征SNP为SNP16， SNP16定位在牛Y染色体参考基因组第42405900位， 突变等位基因为碱基A。 9.公牛的特征SNP作为公牛父系起源标记的应用， 其特征在于： 所述荷斯坦牛的特征SNP分别为SNP1、 SNP2、 SNP。
11、3， SNP1、 SNP2、 SNP3分别定位在牛Y染色 体参考基因组第9479545、 42835264、 10146565位， 对应位的突变等位基因分别为碱基T、 G、 A； 所述红安格斯牛的特征SNP为SNP4， SNP4定位在牛Y染色体参考基因组第42503008位， 突变等位基因为碱基A； 所述夏洛来牛的特征SNP分别为SNP5、 SNP6， SNP5、 SNP6分别定位在牛Y染色体参考基因 组第6993048、 42380924位， 对应位的突变等位基因分别为碱基G、 C； 所述盖普威牛的特征SNP分别为SNP7、 SNP8， SNP7、 SNP8分别定位在牛Y染色体参考基因 组第。
12、10598849、 42508257位， 对应位的突变等位基因均为碱基T； 所述利木赞牛的特征SNP为SNP9， SNP9定位在牛Y染色体参考基因组第9053955位， 突变 等位基因为碱基A； 所述西门塔尔牛的特征SNP为SNP10， SNP10定位在牛Y染色体参考基因组第7966557位， 突变等位基因为碱基G； 所述韩牛的特征SNP分别为SNP11、 SNP12、 SNP13、 SNP14、 SNP15， SNP11、 SNP12、 SNP13、 SNP14、 SNP15分别定位在牛Y染色体参考基因组第9315953、 9483036、 9317944、 6651950、 3752566。
13、位， 对应位的突变等位基因分别为碱基T、 A、 G、 C、 C； 权利要求书 2/3 页 3 CN 106929570 A 3 所述海福特牛的特征SNP为SNP16， SNP16定位在牛Y染色体参考基因组第42405900位， 突变等位基因为碱基A。 权利要求书 3/3 页 4 CN 106929570 A 4 一种利用普通牛Y染色体单核苷酸遗传标记鉴定公牛品种的 方法 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 涉及利用普通牛Y染色体单核苷酸遗传标记(SNP)鉴定 公牛品种的方法， 可用于引种和育种的分子标记辅助鉴别。 背景技术 0002 单核苷酸多态(SNP， single nucleo。
14、tide polymorphism)是同一物种不同个体基 因组DNA的等位序列上单个核苷酸存在差别的现象。 相同长度的单链DNA因其顺序不同或单 个碱基差异， 所形成的构象就会不同。 人类基因组计划已经鉴别出了许多的SNPs， 它是生物 体基因组中存在最为广泛的一类变异， 是由于单个核苷酸的插入、 缺失、 转换和颠换而引起 的。 0003 哺乳动物Y染色体雄性特异区(Male specific region,Y chromosome； MSY)在减 数分裂时不与X染色体发生重组， 因此呈典型的父系遗传， 仅存在于雄性个体。 Y-SNPs标记 已广泛用于世界牛群的遗传多样性和起源研究， 已有发现。
15、普通牛有2种Y染色体单倍型Y1和 Y2(et al.2005； Ginja et al.2010)， 但由于SNP数目非常有限， 不能用于牛品 种区分。 发明内容 0004 针对目前已有研究结果在普通牛(Bos taurus)上仅发现了数目有限的SNP位点， 仅能将普通牛分为Y1和Y2这2个父系起源， 不能精细的区分出各品种的问题， 本发明提供一 种利用普通牛Y染色体单核苷酸遗传标记鉴定公牛品种的方法。 0005 为达到上述目的， 本发明采用了以下技术方案： 0006 (1)从NCBI下载了311头公牛基因组重测序结果(包含海福特牛、 夏洛莱牛、 荷斯坦 牛、 瓦图西长角牛、 红安格斯牛、 安。
16、格斯牛、 曼安茹牛、 西门塔尔牛、 盖普威牛、 利木赞牛、 皮 尔蒙特牛、 萨尔斯牛、 金发阿基塔牛、 德温牛、 韩牛)， 另有30头杂交公牛的基因组重测序结 果做验证， 以20头母牛序列做对照。 0007 (2)基因组比对。 用BWA软件将每一头公牛的重测序结果比对到牛参考基因组 Btau5.0.1； 0008 (3)用Samtools软件找出所有的SNP位点， 再对位于Y染色体上的SNP位点进行过 滤， 标准如下： SNP必需只存在于公牛个体， 所有母牛个体没有； SNP位点公牛个体均为纯合， 保证其位于Y染色体单拷贝区。 0009 (4)筛选各品种特有的单核苷酸突变位点。 发现了荷斯坦奶。
17、牛、 海福特牛、 夏洛莱 牛、 红安格斯牛、 盖普威牛、 利木赞牛、 西门塔尔牛和韩牛等牛品种特有的SNP位点。 部分特 有SNP在对应品种的频率为100， 在其他品种频率基本为0； 部分SNP在对应品种的频率不 到100， 但在其他品种频率为0。 0010 (5)提取待鉴定公牛的基因组DNA， 利用诸如测序法或SNP芯片方法对该基因组DNA 说明书 1/5 页 5 CN 106929570 A 5 在牛Y染色体参考基因组中各个特征SNP所对应的单核苷酸位点的多态性进行遍历检测， 根 据检测结果以及对应品种公牛特有的SNP位点， 确定待鉴定公牛的品种。 0011 本发明的有益效果体现在： 00。
18、12 本发明通过筛选不同品种公牛Y染色体上特有的SNP位点， 利用这些SNP位点可以 有效区分不同品种来源的公牛， 可以用于种公牛品种鉴定、 引种及分子标记辅助育种， 为快 速建立遗传资源优良的普通牛种群奠定基础。 附图说明 0013 图1为本发明鉴定公牛品种的技术流程图(测序法)； 0014 图2为本发明鉴定公牛品种的技术流程图(SNP芯片法)。 具体实施方式 0015 下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。 0016 本发明提供一种利用普通牛Y染色体单核苷酸遗传标记(SNP)鉴定普通牛品种的 方法。 0017 首先， 本发明利用DNA测序技术及生物信息学分析方法， 结合311头公牛。
19、基因组重 测序结果(包含海福特牛、 夏洛莱牛、 荷斯坦牛、 瓦图西长角牛、 红安格斯牛、 安格斯牛、 曼安 茹牛、 西门塔尔牛、 盖普威牛、 利木赞牛、 皮尔蒙特牛、 萨尔斯牛、 金发阿基塔牛、 德温牛、 韩 牛)， 另有30头杂交公牛的基因组重测序结果做验证， 以20头母牛序列做对照。 用BWA软件将 每一头公牛的重测序结果比对到牛参考基因组Btau5.0.1(NCBI版本号GCF_000003205.7)； 用Samtools软件找出所有的SNP位点， 再对位于Y染色体上的SNP位点进行过滤， 标准如下： 1)SNP必需只存在于公牛个体， 所有母牛个体没有； 2)SNP位点公牛个体均为纯合。
20、， 保证其位 于Y染色体单拷贝区。 筛选各品种特有的单核苷酸突变位点(即特征SNP)。 发现了荷斯坦奶 牛、 海福特牛、 夏洛莱牛、 红安格斯牛、 盖普威牛、 利木赞牛、 西门塔尔牛和韩牛特有的SNP位 点(即特征SNP)， 参见表1。 部分特征SNP在对应品种的频率为100， 在其他品种频率基本为 0； 部分特征SNP在对应品种的频率不到100， 但在其他品种频率为0。 0018 表1不同公牛品种SNPs位点及其频率统计 说明书 2/5 页 6 CN 106929570 A 6 0019 0020 表1中： 0021 荷斯坦牛： 有3个特有的SNP位点(即SNP1、 SNP2、 SNP3)，。
21、 在荷斯坦牛中频率均为 100(46/46)， 在其他牛品种频率基本为0。 (除了1头(1/265)非洲的瓦图西长角牛中也存 在) 0022 红安格斯牛： 有1个特有的SNP位点(即SNP4)， 在红安格斯牛中的频率为97(28/ 29)， 在其他牛品种频率为0。 0023 夏洛来牛： 有2个特有的SNP位点(即SNP5、 SNP6)， 在夏洛来牛中频率为100(26/ 26)， 在其他牛品种频率基本为0。 (除了1头(1/285)非洲的瓦图西长角牛中也存在) 0024 盖普威牛： 有2个特有的SNP位点(即SNP7、 SNP8)， 在盖普威牛中频率为100(28/ 28)， 在其他牛品种频率。
22、基本为0。 (除了1头(1/283)非洲的瓦图西长角牛中也存在) 0025 利木赞牛： 有1个特有的SNP位点(即SNP9)， 在利木赞牛中频率为100(25/25)， 在 其他牛品中频率为0。 0026 西门塔尔牛： 有1个特有的SNP位点(即SNP10)， 在西门塔尔牛中频率为100(31/ 31)， 在其他牛品种频率为0。 0027 韩牛： 有5个特有的SNP位点(即SNP11、 SNP12、 SNP13、 SNP14、 SNP15)， 在韩牛中频率 均为100(30/30)， 在其他牛品种频率均为0。 0028 海福特牛： 有1个特有的SNP位点(即SNP16)， 在海福特牛频率为10。
23、0(27/27)， 在 其他牛品种频率均为0。 0029 根据以上研究结果， 可以利用表1中所列SNP位点区分不同品种来源的公牛， 以下 举例说明(血样采集自陕西杨凌西北农林科技大学畜牧教学试验基地、 陕西杨凌秦宝牧业 有限公司， 2013年5月-2015年12月)。 说明书 3/5 页 7 CN 106929570 A 7 0030 例1、 利用普通牛Y染色体单核苷酸遗传标记(SNP)鉴定公牛品种的方法： DNA测序 法 0031 以鉴定荷斯坦公牛为例， 利用牛Y染色体参考基因组序列， 选择SNP1、 SNP2和SNP3 的一个或多个， 两侧各延伸一定长度， 以此为模板设计PCR扩增引物。 。
24、以待测公牛基因组DNA 为模板， 母牛DNA为隐性对照， 进行PCR扩增， 对扩增产物进行测序。 然后利用DNASTAR软件将 测序结果与参考基因组序列比对确认选择的SNP位点是参考碱基还是突变碱基， 若为突变 碱基则该牛为荷斯坦公牛， 否则不是荷斯坦公牛， 具体步骤如下， 参见图1： 0032 1)提取待测牛的基因组DNA； 0033 2)扩增引物设计 0034 利用牛Y染色体参考基因组序列， 选择SNP1、 SNP2和SNP3的一个或多个， 两侧各延 伸一定长度， 以此为模板， 使用Primer5.0等软件设计PCR扩增引物。 0035 3)PCR扩增 0036 以待测牛的基因组DNA为模。
25、板， 母牛DNA为隐性对照， 进行PCR扩增。 母牛应不出现 扩增条带， 公牛有一条明亮的扩增条带。 0037 4)PCR产物纯化 0038 PCR扩增完成之后进行琼脂糖凝胶电泳， 然后进行PCR产物的切胶回收及纯化： 在 紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶， 放入1.5mL离心管中， 然后用PCR产物回 收纯化试剂盒纯化PCR产物， 按照试剂盒说明书操作。 0039 5)测序与分析 0040 把以上待测牛PCR扩增产物送测序公司进行DNA测序。 将测序结果与参考序列进行 比对， 若SNP的对应位点为突变碱基则该牛为荷斯坦公牛， 否则不是荷斯坦公牛， 从而实现 鉴定该公牛的品种。 00。
26、41 实验结果表明， 该方法鉴定的准确性或一致性达到97。 0042 例2、 利用普通牛Y染色体单核苷酸遗传标记(SNP)鉴定公牛品种的方法： SNP芯片 法 0043 参见图2， 具体步骤如下： 0044 1)根据表1中每个SNP位点分别设计一段50bp的单链探针引物。 0045 2)将这些引物按一定次序固定在芯片上。 0046 3)将待测牛样本基因组DNA进行全基因组扩增。 0047 4)将扩增产物用随机内切酶酶切片段化。 0048 5)将DNA片段与芯片进行杂交， 使基因组DNA酶切产物与探针特异性结合。 0049 6)加入两种荧光标记的双脱氧三磷酸核苷酸(ddATP， ddGTP)进行。
27、单碱基延伸， 只 有与gDNA互补结合的探针才能得到延伸。 0050 7)芯片清洗后进行扫描。 0051 8)检测每个位点的荧光强度和波长， 判定SNP分型结果。 0052 实验结果表明， 该方法鉴定的准确性或一致性达到95， 且利用该方法， 可一次性 检测多个待测样本， 鉴定是否属于荷斯坦牛、 红安格斯牛、 夏洛莱牛、 盖普威牛、 利木赞牛、 西门塔尔牛、 韩牛或海福特牛。 0053 总之， 本发明是一种在DNA水平上鉴别不同品种公牛的方法， 适用于快速鉴定荷斯 说明书 4/5 页 8 CN 106929570 A 8 坦牛、 红安格斯牛、 夏洛来牛、 盖普威牛、 利木赞牛、 西门塔尔牛、 韩牛、 海福特牛等品种的公 牛， 能有效用于上述各品种的引种及分子标记辅助育种， 也可用于上述牛品种的父系起源 标记， 为快速建立遗传资源优良的普通牛种群奠定基础。 说明书 5/5 页 9 CN 106929570 A 9 图1 说明书附图 1/2 页 10 CN 106929570 A 10 图2 说明书附图 2/2 页 11 CN 106929570 A 11 。