技术领域
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种葡萄糖基转移酶、其编码基因及其应用。
背景技术
葡萄糖基转移酶(Glycosyltransferase,)可以特异性地将糖基团从活性中间体(例如UDP-糖)转移到受体分子上，具有较好的催化效率和区域选择性，是糖苷类化合物合成与制备的理想催化剂。
葡萄糖基转移酶在自然界尤其是植物中广泛存在，对于植物次级代谢产物的调控有着重要的作用。植物中许多重要天然产物的有效成分都是以其糖苷形式存在的。葡萄糖基转移酶作为实现天然产物糖基化的重要催化剂，其催化机理、构效关系以及选择性机制得以一定程度的研究解析。葡萄糖基转移酶良好的催化特性已经成功应用于部分糖苷类天然产物的生产合成，是一种极具工业应用价值的酶。
藏红花是一种在我国有着悠久药用历史的珍贵天然药物，具有活血化瘀、凉血解毒、解郁安神等功效。现代医学研究发现，藏红花具有治疗心血管疾病及预防动脉粥样化、治疗慢性病毒性肝炎及肝硬化、抗癌活性、抗氧化作用、改善乙醇诱发的学习及记忆障碍和提高机体免疫功能等诸多疗效，并且藏红花酸葡萄糖酯是其活性的最主要的有效成分，并且藏红花资源的稀缺性以及藏红花酸葡萄糖酯极低的含量限制了藏红花的药用开发。人工栽培藏红花产量极低(6kg/hm2左右)，且其采收费时费力；藏红花愈伤组织培养仍存在体系复杂、产量低且产物复杂难以分离等缺陷；化学法合成则存在反应选择性差、副产物多且整体产率低等缺陷。相比之下，酶法合成以其选择性高、反应条件温和、转化率高等特点成为解决藏红花葡萄糖酯合成问题的一个可行方案。目前藏红花和栀子中与藏红花葡萄糖酯合成相关的葡萄糖基转移酶已经得以解析，在藏红花酸转化为藏红花葡萄糖酯的过程中主要有2中糖基转移酶参与，最终形成5种藏红花酸糖酯产物(crocin-1、crocin-2、crocin-3、crocin-4和crocin-5)。藏红花葡萄糖酯的生物合成已经取得一定的进展。Mai Nagatoshi等人利用从栀子G.jasminoides中纯化得到葡萄糖基转移酶成功实现了酶法合成几种藏红花糖葡萄糖酯，但其总产量仅约3μΜ/L(Nagatoshi M,Terasaka K,et al.UGT75L6 and UGT94E5 mediate sequential glucosylation of crocetin to crocin in Gardenia jasminoides.FEBS letters.2012；586(7):1055-61.)；Dufresne等利用藏红花芽诱导出愈伤组织提取物作为催化剂，获得无细胞催化体系进行藏红花酸糖基化反应，单其产物主要为藏红花单葡萄糖酯和藏红花酸单龙胆二糖酯的混合物(Dufresne C,Cormier F,Dorion S,et al.Glycosylation of encapsulated crocetin by a crocus sativusL.cell culture[J].Enzyme and Microbial Technology.1999,24:453)；France等利用藏红花中提取到的粗酶液与藏红花酸进行反应，获得藏红花双葡萄糖酯(F,Cormier F,et al.A highly specific glucosyltransferase is involved in the synthesis of crocetin glucosylesters in Crocus sativus cultured cells.Journal of Plant Physiology.2001；158(5):553-60.)。但是由于植物源的葡萄糖基转移酶难以纯化制备，酶的选择性不高，产物复杂，且其主要为植物膜蛋白，在工程菌株内的异源高效表达非常困难等限制，目前藏红花酸葡萄糖酯的制备还存在较大的问题。
尽管葡萄糖基转移酶的研究已经取得了一定的进展，但是目前关于藏红花酸葡萄糖酯合成的酶的研究还非常少，仅有植物藏红花和栀子中相关的葡萄糖基转移酶的报道，尚未见到能够选择性合成藏红花酸单葡萄糖酯的酶或微生物源葡萄糖基转移酶应用于藏红花酸葡萄糖酯的报道。由于植物葡萄糖基转移酶难以大量表达制备，且其在合成藏红花酸葡萄糖酯的过程中选择性不高，导致产物成分复杂等缺陷的存在，藏红花酸葡萄糖酯的制备仍存在较大的技术瓶颈。近年来，随着功能酶理性挖掘方法及生物信息技术的飞速发展，依托植物糖基转移酶合成藏红花酸糖酯的机制，理性筛选易于大量表达制备且选择性更高的的高效微生物源葡萄糖基转移酶可以为解决藏红花糖酯合成提供可行的方案，对于解决目前不能实现的高效定向制备藏红花酸单葡萄糖酯具有重要意义。
发明内容
针对目前在糖基化合成藏红花酸葡萄糖酯的过程中存在的植物关键葡萄糖基转移酶难以大量表达、底物浓度低、选择性差等一系列问题，本发明提供了一种选择性好、稳定性好、表达量高的葡萄糖基转移酶，含有编码该葡萄糖基转移酶基因的重组表达载体、重组表达转化体及其高效制备方法，以及该葡萄糖基转移酶在藏红花酸单葡萄糖酯选择性定向合成中的应用。
本发明目的之一，在于提供一种葡萄糖基转移酶，其氨基酸序列表如SEQ ID NO:2所示。本发明提供的SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的葡萄糖基转移酶可以从本实验筛选到的一株来源于污水处理站附近土壤的枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)中分离获得，也可以从重组表达该蛋白质的表达转化体重分离获得，也可以人工获得。
本发明另一目的在于提供一种编码本发明的葡萄糖基转移酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明SEQ ID NO:1所示的基因可以从本实验筛选到的一株来源于污水处理站附近土壤的枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)中分离获得，也可以从所示的重组表达载体中或者重组表达转化体中分离获得，也可以人工获得。
本发明中，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，命名为Bs-GT，全长1218bp。编码序列(CDS)从第一个碱基起至第1218个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAG。其编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。
本发明另一目的在于提供含有所述葡萄糖基转移酶编码基因的重组载体、表达盒或重组菌。所述重组菌是将所述基因插入pet-28a后转化大肠埃希氏菌E.coli-BL21-DE3所得，或是含有所述基因的本领域常规的各种载体以及含有该重组载体的本领域各种常规宿主菌株。本发明构建了葡萄糖基转移酶Bs-GT基因的重组表达载体，并将重组表达载体成功导入大肠埃希氏菌E.coli-BL21-DE3，加入IPTG诱导表达后，经SDS-PAGE验证其在大肠埃希氏菌E.coli-BL21-DE3中成功表达。
本发明还提供所述葡萄糖基转移酶在定向合成藏红花酸单葡萄糖酯中的应用。所述的应用包括如下3种技术方案：
(1)葡萄糖基转移酶酶法定向合成藏红花酸单葡萄糖酯：培养本发明前述的重组表达转化体，获得重组表达的葡萄糖基转移酶。其中，所述的培养重组表达转化体中所用的培养基可为本领域常规的任何可使转化体生长并产生本发明的葡萄糖基转移酶的培养基，优选LB培养基。将培养获得的重组转化体离心收集细胞，并经生理盐水洗涤2次后获得静息细胞。用pH7.5-8.5的PBS缓冲重悬细胞，经超声破碎后离心收集粗酶液，并经镍柱纯化获取纯化后的葡萄糖基转移酶。进而将纯化后的葡萄糖基转移酶与UDP-Glc(5.0-15g/L)和藏红花酸(0.1-1.0g/L)混合到pH7.5-8.0磷酸缓冲溶液或者pH8.0-10.0的Gly-NaOH缓冲溶液(优选pH9.5的Gly-NaOH缓冲液)中，置于25-40℃水浴反应2-4h。
(2)葡萄糖基转移酶-蔗糖合成酶偶联体系定向合成藏红花酸单葡萄糖酯：利用上述获得的纯化后的葡萄糖基转移酶，在pH7.5-8.0磷酸缓冲溶液或者pH8.0-10.0的Gly-NaOH缓冲溶液(优选pH9.5的Gly-NaOH缓冲液)中添加1U的蔗糖合成酶、浓度为0.25-1.0g/L的UDP、蔗糖(100-200g/L)后，置于25-40℃水浴反应2-4h(优选37℃)。
(3)葡萄糖基转移酶重组转化体全细胞催化定向合成藏红花酸单葡萄糖酯：利用上述获得的静息细胞，在pH7.5-8.0磷酸缓冲溶液或者pH8.0-10.0的Gly-NaOH缓冲溶液(优选pH9.5的Gly-NaOH缓冲液)中添加葡萄糖(20-50g/L)和藏红花酸(0.1-1.0g/L)，置于25-40℃(优选37℃)、180rpm摇床振荡反应12-24h。
本发明的有益效果在于：本发明提供的葡萄糖基转移酶具有选择性好、表达量高、催化效率高等显著优势，其催化藏红花酸单葡萄糖酯定向合成的转化率可达70-80％，是目前唯一报道的可以选择性定向合成藏红花酸单葡萄糖酯的葡萄糖基转移酶，具有很好的应用潜力。
附图说明
图1为基因Bs-GT的PCR扩增电泳图，其中：1，DNAMarker；2，基因Bs-GT的PCR扩增产物。
图2为重组葡萄糖基转移酶BS-GT的聚丙烯酰胺凝胶电泳图，其中：1，蛋白Marker；2，Bs-GT粗酶液；3：镍柱纯化后的Bs-GT酶。
图3为藏红花酸及5种藏红花酸糖酯产物结构示意图。
图4为葡萄糖基转移酶催化藏红花酸单葡萄糖酯定向合成示意图。
图5为重组葡萄糖基转移酶酶法催化藏红花酸单葡萄糖酯定向合成反应时间进程曲线。
图6为重组葡萄糖基转移酶-蔗糖合成酶双酶偶联法催化藏红花酸单葡萄糖酯定向合成反应时间进程曲线。
图7为重组葡萄糖基转移酶全细胞催化藏红花酸单葡萄糖酯定向合成反应时间进程曲线。
图8为重组葡萄糖基转移酶全细胞催化的反应产物HPLC检测图。
图9为重组葡萄糖基转移酶全细胞催化的反应产物LC-MS检测图。
具体实施方式
实施例一
本实施例说明本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的筛选步骤
初筛采用如下方法：以10％DMSO作为筛选压力从南京周边污水处理厂附近的土壤中筛选耐有机溶剂的微生物。具体筛选培养基的配方为：酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 1g/L，溶剂为10％DMSO水溶液。培养温度为30℃，培养时间为24-48h，摇床转速为200rpm。此方法可筛选到耐有机溶剂的微生物。
将初筛获得的菌株进行复筛，具体方法如下：将菌株接种到复筛培养基内培养，具体培养基的配方为：酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 1g/L，溶剂为pH7.0的10％DMSO水溶液。培养温度为30℃，摇床转速为180rpm，培养时间为12-24h。发酵结束后，取发酵液于12000rpm离心1min，弃上清，取菌体溶于pH8.0磷酸缓冲液，并加入0.1g/L的藏红花酸，置于30℃摇床振荡反应12h。反应结束后，取反应液于12000rpm离心1min，收集上清，并通过HPLC检测筛选结果，挑选可以将藏红花酸糖基化的菌株进行菌种鉴定。经16S rRNA序列分析，发明人筛选到的菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。
实施例二
本实施例说明本发明的葡萄糖基转移酶Bs-GT编码基因的分离克隆程序。
采用酚-氯仿抽提法提取菌体总DNA。根据枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis全基因测序结果进行分析，获得一个编码葡萄糖基转移酶的基因，根据该基因核苷酸序列设计引物SF和SR。
SF(SEQ ID NO:3)序列为：
CGCGGCAGCCATATGGCTAGCGCTAATGTATTAATGATCGGT
SF(SEQ ID NO:4)序列为：
TGCGGCCGCAAGCTTGTCGACCTATGCATTTGCTGATTGAG
其中，引物SF下划线部分为NheⅠ酶切位点，引物SR下划线部分为SalⅠ酶切位点。
以本实验筛选到的一株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)基因组为模板，进行PCR扩增。PCR体系为：2×Taq Plus Master Mix 25μL，引物SF和SR各2μL，DNA模板2μL和ddH2O 19μL。PCR扩增步骤为：(1)95℃，预变形5min；(2)95℃，变形30S；(3)52℃，退火30S；(4)72℃，延伸2min；步骤(2)～(4)重复30次；(5)72℃彻底延伸10min，冷却至4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的条带(图1)。获得一条完整的葡萄糖基转移酶基因序列，全长1218bp，命名为Bs-GT，其碱基序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。
实施例三
本实施例说明重组表达载体和重组表达转化体的制备。
将实施例一所得的葡萄糖基转移酶基因片段在37℃用限制性内切酶Nhe Ⅰ和Sal Ⅰ进行双酶切12h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段。将目标片段在T4连接酶的作用下，与同样经Nhe Ⅰ和Sal Ⅰ进行双酶切后的质粒pET28a，在16℃下过夜连接得到重组表达质粒pET-Bs-GT。
将上述重组表达质粒转化到大肠杆菌E.coli-BL21-DE3感受态细胞中，在含有卡那霉素的抗性平板上对阳性重组体进行筛选，挑选单克隆，菌落PCR验证阳性的克隆子，经DNA测序验证后，即获得阳性重组转化体大肠杆菌E.coli-BL21-DE3-/pET-Bs-GT。
实施例四
本实施例说明重组葡萄糖基转移酶的诱导表达与纯化过程。
将实施例二所得的重组大肠杆菌E.coli-BL21-DE3-/pET-Bs-GT，接种至含卡那霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，pH7.0)中，37℃振荡培养过夜，按2％(v/v)的接种量接入装有40mL LB培养基的250mL三角瓶中，置于37℃、180rpm摇床培养，当培养液OD600达到0.6时，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG作为诱导剂，16℃诱导24h后，将培养液离心，收集细胞，并利用生理盐水洗涤两次，得静息细胞。将所得的静息细胞悬浮于pH8.0的缓冲液中，在冰浴中超声破碎，离心收集上清液，即为重组葡萄糖基转移酶的粗酶液。粗酶液用Ni-NTA Agarose亲和柱层析除去不带6His标记的杂蛋白，并用肠激酶切除组氨酸标签，得到了电泳纯葡萄糖基转移酶。聚丙烯酰胺凝胶电泳分析图见图2。
实施例五
本实施例说明重组葡萄糖基转移酶酶法催化藏红花酸单葡萄糖酯定向合成方法。
反应条件：温度为37℃，采用pH9.5的Gly-NaOH缓冲液，其中UDP-Glc为5-15g/L，藏红花酸终浓度为0.1-1.0g/L，水浴反应2-4h，定时取样检测，结果如图5。
实施例六
本实施例说明重组葡萄糖基转移酶酶法催化藏红花酸单葡萄糖酯定向合成方法。
反应条件：温度为25℃，采用pH8.0-10.0的Gly-NaOH缓冲液，其中UDP-Glc为5g/L，藏红花酸终浓度为0.1g/L，水浴反应2h，反应转化率为80％。
实施例七
本实施例说明重组葡萄糖基转移酶酶法催化藏红花酸单葡萄糖酯定向合成方法。
反应条件：温度为40℃，采用pH7.5-8.0磷酸缓冲溶液，其中UDP-Glc为15g/L，藏红花酸终浓度为1.0g/L，水浴反应4h，反应转化率为70％。
实施例八
本实施例说明重组葡萄糖基转移酶与蔗糖合成酶双酶偶联催化藏红花酸单葡萄糖酯定向合成方法。
反应条件：温度为37℃，采用pH8.5的Gly-NaOH缓冲液，其中UDP终浓度为0.25-1g/L，蔗糖终浓度为100-200g/L，藏红花酸终浓度为0.1-1.0g/L，水浴反应2-4h，定时取样检测，结果如图6。
实施例九
本实施例说明重组葡萄糖基转移酶与蔗糖合成酶双酶偶联催化藏红花酸单葡萄糖酯定向合成方法。
反应条件：温度为25℃，采用pH7.5-8.0磷酸缓冲溶液，其中UDP终浓度为0.25g/L，蔗糖终浓度为100g/L，藏红花酸终浓度为0.1g/L，水浴反应2h，反应转化率为75％。
实施例十
本实施例说明重组葡萄糖基转移酶与蔗糖合成酶双酶偶联催化藏红花酸单葡萄糖酯定向合成方法。
反应条件：温度为40℃，采用pH8.0-10.0的Gly-NaOH缓冲溶液，其中UDP终浓度为1g/L，蔗糖终浓度为200g/L，藏红花酸终浓度为1.0g/L，水浴反应4h，反应转化率为70％。
实施例十一
本实施例说明重组葡萄糖基转移酶转化体全细胞催化藏红花酸单葡萄糖酯定向合成方法。
反应条件：温度为37℃，采用pH9.5的Gly-NaOH缓冲液，其中葡萄糖终浓度为20-50g/L，藏红花酸终浓度为0.1-1.0g/L，180rpm摇床内振荡反应12-24h，定时取样检测，结果如图7。
在本优选的条件下，将藏红花酸糖基化产物经HPLC和LC-MS，确认产物为藏红花酸单葡萄糖酯。检测图谱如图8、9所示。
实施例十二
本实施例说明重组葡萄糖基转移酶转化体全细胞催化藏红花酸单葡萄糖酯定向合成方法。
反应条件：温度为25℃，采用pH7.5-8.0磷酸缓冲溶液，其中葡萄糖终浓度为20g/L，藏红花酸终浓度为0.1g/L，180rpm摇床内振荡反应12h，反应转化率为80％。
实施例十三
本实施例说明重组葡萄糖基转移酶转化体全细胞催化藏红花酸单葡萄糖酯定向合成方法。
反应条件：温度为40℃，采用pH8.0-10.0的Gly-NaOH缓冲溶液，其中葡萄糖终浓度为50g/L，藏红花酸终浓度为1.0g/L，180rpm摇床内振荡反应24h，反应转化率为72％。
实施例十四
本实施例说明本发明提供的葡萄糖基转移酶相较于类似葡萄糖基转移酶在合成藏红花酸单葡萄糖酯能力上的差异。
按实施例十一所述的反应条件，分别加入本发明提供的葡萄糖基转移酶Bs-GT和来源于其他枯草芽孢杆菌(Sequence ID:CP011051.1,CP010434.1,CP002183.1)的具有相似核苷酸序列的葡萄糖基转移酶,并取样检测其催化藏红花酸合成藏红花酸单葡萄糖酯的能力，结果如表1所示。
表1.不同枯草芽孢杆菌来源葡萄糖基转移酶合成藏红花酸单葡萄糖酯结果
菌株 Sequence ID 转化率 本发明枯草芽孢杆菌 70-80％ Bacillus subtilis strain T30 CP011051.1 2-5％ Bacillus subtilis subsp.spizizenii strain NRS 231 CP010434.1 0％ Bacillus subtilis subsp.spizizenii str.W23 CP002183.1 0％
实验结果表明，本发明提供的葡萄糖基转移酶的重组转化体具有催化藏红花酸糖基化生成藏红花酸葡萄糖酯的能力，在优选的条件下，最大摩尔转化率可以达到70-80％，并且产物单一，无副产物的产生。该高效率、高选择性、高表达量的葡萄糖基转移酶在藏红花酸葡萄糖酯的合成中具有巨大的应用潜力。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 一种葡萄糖基转移酶及在合成藏红花酸葡萄糖酯中的应用
<130> xb17041702
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1218
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1218)
<400> 1
atg gct aat gta tta atg atc ggt ttt ccc ggt gaa gga cat att aat 48
Met Ala Asn Val Leu Met Ile Gly Phe Pro Gly Glu Gly His Ile Asn
1 5 10 15
ccg tct atc ggt gta atg aag gag ctg aaa tca cgg gga gaa cat att 96
Pro Ser Ile Gly Val Met Lys Glu Leu Lys Ser Arg Gly Glu His Ile
20 25 30
act tac tac gca gtg aag gaa tac aaa gaa aaa att gca gct ctt gat 144
Thr Tyr Tyr Ala Val Lys Glu Tyr Lys Glu Lys Ile Ala Ala Leu Asp
35 40 45
att gag ttt cgt gag tat cat gat ttt cga gaa gat tac ttc gga aaa 192
Ile Glu Phe Arg Glu Tyr His Asp Phe Arg Glu Asp Tyr Phe Gly Lys
50 55 60
aac gca aca gga gat gaa gaa aga gat ttc gca gaa atg atc tgc gcc 240
Asn Ala Thr Gly Asp Glu Glu Arg Asp Phe Ala Glu Met Ile Cys Ala
65 70 75 80
ttt ttg aaa ggc tgt agg gat att gcg act cat att tat gat gaa gtc 288
Phe Leu Lys Gly Cys Arg Asp Ile Ala Thr His Ile Tyr Asp Glu Val
85 90 95
aaa cat gaa tcg tat gat tat gtc ata tat gat cac cat tta ctg gcc 336
Lys His Glu Ser Tyr Asp Tyr Val Ile Tyr Asp His His Leu Leu Ala
100 105 110
ggt aaa atc att gcc aac ctg ctg aag ctg ccg aga ttt tca ttg tgt 384
Gly Lys Ile Ile Ala Asn Leu Leu Lys Leu Pro Arg Phe Ser Leu Cys
115 120 125
act acc ttt gca atg gat gag gaa ttt cta aag gaa ata atg ggt tct 432
Thr Thr Phe Ala Met Asp Glu Glu Phe Leu Lys Glu Ile Met Gly Ser
130 135 140
tac atg aaa ggg tca att gaa gaa tcg tca cat tat gaa tct tac cag 480
Tyr Met Lys Gly Ser Ile Glu Glu Ser Ser His Tyr Glu Ser Tyr Gln
145 150 155 160
cag ctt gta gaa aca tta aat gct gat ttt caa aca gcg atc aaa aag 528
Gln Leu Val Glu Thr Leu Asn Ala Asp Phe Gln Thr Ala Ile Lys Lys
165 170 175
cca ttt gac gtt ttt tcc tca gat ggg gat ttg acg att gtc ttt aca 576
Pro Phe Asp Val Phe Ser Ser Asp Gly Asp Leu Thr Ile Val Phe Thr
180 185 190
tca agg gaa ttt cag cca atg gct gat caa ttc ggc gat cgg tat gta 624
Ser Arg Glu Phe Gln Pro Met Ala Asp Gln Phe Gly Asp Arg Tyr Val
195 200 205
ttt gtc ggt cct tcc att aca gaa agg gcc gga aac aac gat ttc cca 672
Phe Val Gly Pro Ser Ile Thr Glu Arg Ala Gly Asn Asn Asp Phe Pro
210 215 220
ttt gat cag att gac aat gaa aac gtg ctg ttt att tca atg gga acc 720
Phe Asp Gln Ile Asp Asn Glu Asn Val Leu Phe Ile Ser Met Gly Thr
225 230 235 240
att ttt aac aat caa aag cag ttt ttt aat caa tgt ctc gag gta tgt 768
Ile Phe Asn Asn Gln Lys Gln Phe Phe Asn Gln Cys Leu Glu Val Cys
245 250 255
aaa gac ttt gac gga aaa gtt gtg ctt tcc atc ggc aaa cat att aaa 816
Lys Asp Phe Asp Gly Lys Val Val Leu Ser Ile Gly Lys His Ile Lys
260 265 270
gca aat gag cta aac gac att ccg gag aat ttc att gta cgc ccg tat 864
Ala Asn Glu Leu Asn Asp Ile Pro Glu Asn Phe Ile Val Arg Pro Tyr
275 280 285
gtc cca cag ctt gag atc ctg aaa aga gcc agc tta ttt gta acc cac 912
Val Pro Gln Leu Glu Ile Leu Lys Arg Ala Ser Leu Phe Val Thr His
290 295 300
ggg gga atg aat agc aca agt gaa ggt ttg tat ttt gaa acc ccg ctc 960
Gly Gly Met Asn Ser Thr Ser Glu Gly Leu Tyr Phe Glu Thr Pro Leu
305 310 315 320
gta gtc att ccg atg ggt gct gac caa ttt gct gta gga aat caa gtg 1008
Val Val Ile Pro Met Gly Ala Asp Gln Phe Ala Val Gly Asn Gln Val
325 330 335
gaa aaa ata ggc gca gga aaa gtg ctg aaa aaa gaa caa tta tca gaa 1056
Glu Lys Ile Gly Ala Gly Lys Val Leu Lys Lys Glu Gln Leu Ser Glu
340 345 350
ggc ctt ctg aaa gaa aca att cat gaa gtg atg aac aat ccc gca tat 1104
Gly Leu Leu Lys Glu Thr Ile His Glu Val Met Asn Asn Pro Ala Tyr
355 360 365
gct gaa aag gca aaa gac att ggc caa tca ttg aaa gcg gca ggc gga 1152
Ala Glu Lys Ala Lys Asp Ile Gly Gln Ser Leu Lys Ala Ala Gly Gly
370 375 380
tct aaa aag gcg gcc gac agc att ctt gaa gtt gtg aaa ctc aaa act 1200
Ser Lys Lys Ala Ala Asp Ser Ile Leu Glu Val Val Lys Leu Lys Thr
385 390 395 400
caa tca gca aat gca tag 1218
Gln Ser Ala Asn Ala
405
<210> 2
<211> 405
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis
<400> 2
Met Ala Asn Val Leu Met Ile Gly Phe Pro Gly Glu Gly His Ile Asn
1 5 10 15
Pro Ser Ile Gly Val Met Lys Glu Leu Lys Ser Arg Gly Glu His Ile
20 25 30
Thr Tyr Tyr Ala Val Lys Glu Tyr Lys Glu Lys Ile Ala Ala Leu Asp
35 40 45
Ile Glu Phe Arg Glu Tyr His Asp Phe Arg Glu Asp Tyr Phe Gly Lys
50 55 60
Asn Ala Thr Gly Asp Glu Glu Arg Asp Phe Ala Glu Met Ile Cys Ala
65 70 75 80
Phe Leu Lys Gly Cys Arg Asp Ile Ala Thr His Ile Tyr Asp Glu Val
85 90 95
Lys His Glu Ser Tyr Asp Tyr Val Ile Tyr Asp His His Leu Leu Ala
100 105 110
Gly Lys Ile Ile Ala Asn Leu Leu Lys Leu Pro Arg Phe Ser Leu Cys
115 120 125
Thr Thr Phe Ala Met Asp Glu Glu Phe Leu Lys Glu Ile Met Gly Ser
130 135 140
Tyr Met Lys Gly Ser Ile Glu Glu Ser Ser His Tyr Glu Ser Tyr Gln
145 150 155 160
Gln Leu Val Glu Thr Leu Asn Ala Asp Phe Gln Thr Ala Ile Lys Lys
165 170 175
Pro Phe Asp Val Phe Ser Ser Asp Gly Asp Leu Thr Ile Val Phe Thr
180 185 190
Ser Arg Glu Phe Gln Pro Met Ala Asp Gln Phe Gly Asp Arg Tyr Val
195 200 205
Phe Val Gly Pro Ser Ile Thr Glu Arg Ala Gly Asn Asn Asp Phe Pro
210 215 220
Phe Asp Gln Ile Asp Asn Glu Asn Val Leu Phe Ile Ser Met Gly Thr
225 230 235 240
Ile Phe Asn Asn Gln Lys Gln Phe Phe Asn Gln Cys Leu Glu Val Cys
245 250 255
Lys Asp Phe Asp Gly Lys Val Val Leu Ser Ile Gly Lys His Ile Lys
260 265 270
Ala Asn Glu Leu Asn Asp Ile Pro Glu Asn Phe Ile Val Arg Pro Tyr
275 280 285
Val Pro Gln Leu Glu Ile Leu Lys Arg Ala Ser Leu Phe Val Thr His
290 295 300
Gly Gly Met Asn Ser Thr Ser Glu Gly Leu Tyr Phe Glu Thr Pro Leu
305 310 315 320
Val Val Ile Pro Met Gly Ala Asp Gln Phe Ala Val Gly Asn Gln Val
325 330 335
Glu Lys Ile Gly Ala Gly Lys Val Leu Lys Lys Glu Gln Leu Ser Glu
340 345 350
Gly Leu Leu Lys Glu Thr Ile His Glu Val Met Asn Asn Pro Ala Tyr
355 360 365
Ala Glu Lys Ala Lys Asp Ile Gly Gln Ser Leu Lys Ala Ala Gly Gly
370 375 380
Ser Lys Lys Ala Ala Asp Ser Ile Leu Glu Val Val Lys Leu Lys Thr
385 390 395 400
Gln Ser Ala Asn Ala
405
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1
<400> 3
cgcggcagcc atatggctag cgctaatgta ttaatgatcg gt 42
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1
<400> 4
tgcggccgca agcttgtcga cctatgcatt tgctgattga g 41