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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201611175664.7 (22)申请日 2016.12.16 (71)申请人 中国科学院深圳先进技术研究院 地址 518000 广东省深圳市南山区西丽大 学城学苑大道1068号 (72)发明人 金宗文袁静罗擎颖杨偲 (74)专利代理机构 北京超凡志成知识产权代理 事务所(普通合伙) 11371 代理人 孙海杰 (51)Int.Cl. C12N 9/02(2006.01) C12N 15/70(2006.01) (54)发明名称 基于Gluc荧光素酶的二硫键蛋白及制备方 法 。
2、(57)摘要 本发明公开了一种基于Gluc荧光素酶的二 硫键蛋白及制备方法， 方法包括在Gluc荧光素酶 基因的C端引入SEP-tag， 将连接有SEP标签的 Gluc荧光素酶基因插入表达载体的多克隆位点， 得到荧光素酶Gluc-SEP基因表达载体， 将该表达 载体转化到同时具有trxB-/gor-抗性基因和 DsbC氧化还原基因的大肠杆菌菌株， 得到含有该 表达载体的表达菌株， 培养该表达菌株， 表达得 到基于Gluc荧光素酶的二硫键蛋白。 该方法解决 了荧光素酶光学稳定性差， 荧光猝灭迅速的问 题。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图4页 CN 106754772 A 2017.。
3、05.31 CN 106754772 A 1.一种基于Gluc荧光素酶的二硫键蛋白的制备方法， 其特征在于， 该方法包括在Gluc 荧光素酶基因的C端引入SEP-tag， 将连接有SEP标签的Gluc荧光素酶基因插入表达载体的 多克隆位点， 得到荧光素酶Gluc-SEP基因表达载体， 将该荧光素酶Gluc-SEP基因表达载体 转化到同时具有trxB-/gor-抗性基因和DsbC氧化还原基因的大肠杆菌菌株， 得到含有该荧 光素酶Gluc-SEP基因表达载体的重组表达菌株， 培养该重组表达菌株， 表达得到基于Gluc 荧光素酶的二硫键蛋白。 2.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述方。
4、法还包括在连接有SEP标签的 Gluc荧光素酶基因的N端引入纯化标签。 3.根据权利要求2所述的制备方法， 其特征在于， 所述纯化标签包括His6、 GST、 Strep或 CBD。 4.根据权利要求1或2所述的制备方法， 其特征在于， 所述表达载体为pET系列表达载 体， 所述pET系列表达载体包括pET28a、 pET21a、 pET25b、 pET27b或pET30a。 5.根据权利要求1或2所述的制备方法， 其特征在于， 所述多克隆位点为BamH I和Sal I 酶切位点、 BamH I和Hind III酶切位点、 BamH I和Not I酶切位点、 BamH I和Xho I酶切位 点。
5、、 Nde I和Sal I酶切位点、 Nde I和Hind III酶切位点、 Nde I和Not I酶切位点或Nde I和 Xho I酶切位点。 6.根据权利要求1或2所述的制备方法， 其特征在于， 所述同时具有trxB-/gor-抗性基因 和DsbC氧化还原基因的大肠杆菌菌株包括SHuffle T7 B E.coli菌株或SHuffle T7 K12 E.coli菌株。 7.根据权利要求1或2所述的制备方法， 其特征在于， 所述方法中用IPTG诱导连接有SEP 标签的Gluc荧光素酶基因的表达， 其中， IPTG的浓度为1mmol/L， 诱导温度为35-37， 诱导 时间为5-8h； 或诱导。
6、温度为14-18， 诱导时间为10-14h。 8.根据权利要求1或2所述的制备方法， 其特征在于， 所述方法中还包括将得到的基于 Gluc荧光素酶的二硫键蛋白进行纯化的步骤。 9.由权利要求1至8任一项所述的制备方法制得的基于Gluc荧光素酶的二硫键蛋白， 其 特征在于， 所述基于Gluc荧光素酶的二硫键蛋白的二级结构具有大于80的 -螺旋结构。 10.根据权利要求9所述的二硫键蛋白， 其特征在于， 所述基于Gluc荧光素酶的二硫键 蛋白具有下述一种或几种特性： 光谱最高发射峰为480nm， 或 光衰减的半衰期为6min， 或 在60孵育30min后活性保持在85以上， 或 从25到95过程中。
7、， 二级结构组成没有变化。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106754772 A 2 基于Gluc荧光素酶的二硫键蛋白及制备方法 技术领域 0001 本发明涉及蛋白制备技术领域， 尤其是涉及一种基于Gluc荧光素酶的二硫键蛋白 及制备方法。 背景技术 0002 医学影像技术是探究体内细微生命的重要方法， 它可实现分子水平上高靶向地对 活体内疾病的发生、 生长进行治疗， 是一种新的健康医疗模式。 医学影像技术主要包括核磁 共振MRI、 CT、 医学超声以及光学成像等。 生物发光成像(Bioluminescence imaging)是光学 成像中的一种重要的成像手段， 它具有无需光源激发， 无。
8、散射、 穿透率高、 极低的背景干扰 和极高信噪比等优点。 其在有氧的条件下， 以荧光素酶作为体内报告源， 通过与底物作用而 发光。 近年来已被广泛应用于生命科学、 医学研究及药物研发等领域。 0003 作为报告基因， 荧光素酶需要具备某些特定的条件， 如具有明显的光谱特征， 高量 子产率且底物在细胞内无累积等。 Gaussia luciferase(Gluc)是从夏威夷的一种海洋桡足 类动物中获取的荧光素酶， 它具有2个独特的domain区域， 且都有生物发光活性， 由185个氨 基酸组成， 大小19.9KDa且以肠腔素作为底物。 因其超高的荧光强度， 良好的酶稳定性和分 泌活性， 被广泛用于。
9、开发生物发光成像检测系统对基因分子事件、 蛋白质相互作用、 细胞生 命活动、 动物生理病理等生物学过程实时监控。 而且， Gluc中含有11个半胱氨酸， 占氨基酸 数量的5.95， 研究更显示， Gluc中的10个半胱氨酸通过共价键可以形成5对二硫键， 其中 一对二硫键处于2个domain区域之间， 而其他二硫键都在domain区域内部中形成， 因此， Gluc也被称之为二硫键蛋白(Disulfide bonded protein)。 Gluc作为一种二硫键蛋白， 其 面临的最大困难是如何在大肠杆菌表达中形成可溶并完全正确折叠的二硫键蛋白， 因为二 硫键的正确折叠对于蛋白质的稳定性， 活性等具。
10、有至关重要的影响。 而大肠杆菌中蛋白的 高效表达往往难以预期， 特别是对于Gluc这样一种高度含有二硫键的蛋白质， 更是不可控。 因此， Gluc荧光素酶在应用中也存在一些局限性， 主要包括信号猝灭， 在体外吸收蓝光会迅 速光衰减等， 这使其应用遇到了极大的瓶颈。 0004 因此， 如何优化其光学稳定性， 建立对个体的长时间、 可重复性、 可稳定控制的跟 踪成像体系是亟待解决的问题。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种基于Gluc荧光素酶的二硫键蛋白的制备方法， 该方法 解决了荧光素酶光学稳定性差， 荧光猝灭迅速的问题， 还解决了由于Gluc荧光素酶含有多 组二硫键导致其在大肠杆菌中。
11、表达时， 难以实现可溶性和二硫键的正确折叠从而使其在实 际生物发光成像应用中受到限制的问题。 0006 本发明的另一个目的在于提供由上述制备方法制得的基于Gluc荧光素酶的二硫 键蛋白， 该二硫键蛋白具有高的光稳定性。 0007 为解决上述技术问题， 本发明采用如下技术方案： 说明书 1/6 页 3 CN 106754772 A 3 0008 一种基于Gluc荧光素酶的二硫键蛋白的制备方法， 该方法包括在Gluc荧光素酶基 因的C端引入SEP-tag， 将连接有SEP标签的Gluc荧光素酶基因插入表达载体的多克隆位点， 得到荧光素酶Gluc-SEP基因表达载体， 将该表达载体转化到同时具有tr。
12、xB-/gor-抗性基因 和DsbC氧化还原基因的大肠杆菌菌株， 得到含有该表达载体的表达菌株， 培养该表达菌株， 表达得到基于Gluc荧光素酶的二硫键蛋白。 0009 优选地， 所述方法还包括在连接有SEP标签的Gluc荧光素酶基因的N端引入纯化标 签。 0010 优选地， ， 所述表达载体为pET系列表达载体， 所述pET系列表达载体包括pET28a、 pET21a、 pET25b、 pET27b或pET30a。 0011 优选地， 所述纯化标签包括His6、 GST、 Strep或CBD。 0012 优选地， 所述多克隆位点为BamH I和Sal I酶切位点、 BamH I和Hind I。
13、II酶切位 点、 BamH I和Not I酶切位点、 BamH I和Xho I酶切位点、 Nde I和Sal I酶切位点、 Nde I和 Hind III酶切位点、 Nde I和Not I酶切位点或Nde I和Xho I酶切位点。 0013 优选地， 所述同时具有trxB-/gor-抗性基因和DsbC氧化还原基因的大肠杆菌菌株 包括SHuffle T7B E.coli菌株或SHuffle T7K12E.coli菌株。 0014 优选地， 所述方法中用IPTG诱导连接有SEP标签的Gluc荧光素酶基因的表达， 其 中， IPTG的浓度为1mmol/L， 诱导温度为35-37， 诱导时间为5-8h。
14、； 或诱导温度为14-18， 诱导时间为10-14h。 0015 优选地， 所述方法中还包括将得到的基于Gluc荧光素酶的二硫键蛋白进行纯化的 步骤。 0016 由所述制备方法制得的基于Gluc荧光素酶的二硫键蛋白的二级结构具有大于 80的 -螺旋结构。 0017 优选地， 所述二硫键蛋白具有下述一种或几种特性： 0018 光谱最高发射峰为480nm， 或 0019 光衰减的半衰期为6min， 或 0020 在60孵育30min后活性保持在85以上， 或 0021 从25到95过程中， 二级结构组成没有变化。 0022 本发明的有益效果如下： 0023 本发明在Gluc的C端引入一个SEP-t。
15、ag(GDDDGDDD GDDD)促进了大部分的二硫键 的正确折叠， 将C端带有SEP-tag的Gluc基因转入到同时具有trxB-/gor-抗性基因和DsbC氧 化还原基因的大肠杆菌菌株中， 有效减少了因大肠杆菌在表达过程中逐渐形成的缺氧环境 而使二硫键正确折叠的氧化环境缺失的问题， 构建的表达菌株进行蛋白表达后， 得到的蛋 白荧光活性非常强， 并且圆二色谱CD热力学研究显示其二级结构的热稳定非常好， 从常温 到95的高温， 其二级结构没有发生任何改变。 附图说明 0024 图1为实施例3和对比例1的荧光光谱发射峰的比较图； 0025 图2实施例3和对比例1的荧光活性比较图； 0026 图3。
16、为实施例3和对比例1的荧光活性衰减动力学的比较图； 说明书 2/6 页 4 CN 106754772 A 4 0027 图4为实施例3和对比例1的热稳定性比较图； 0028 图5为实施例3和对比例1的圆二色谱峰比较图； 0029 图6A为对比例1的圆二色谱热力学稳定性图； 0030 图6B为实施例3的圆二色谱热力学稳定性图。 具体实施方式 0031 下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、 完整地描述， 显然， 所描述的实施 例是本发明一部分实施例， 而不是全部的实施例。 基于本发明中的实施例， 本领域普通技术 人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例， 都属于本发明保护的范围。。
17、 0032 本发明的发明人通过对Gluc荧光素酶结构的理性分析， 得出大肠杆菌中表达的 Gluc荧光素酶之所以稳定性差， 光信号衰减快， 主要有两方面的原因： 0033 1.Gluc作为一种二硫键蛋白， 难以在大肠杆菌表达中形成可溶并完全正确折叠的 二硫键蛋白； 0034 2.如何提供二硫键正确折叠所需要的氧化环境； 0035 而传统的提高Gluc荧光素酶稳定性和荧光强度的策略主要是通过构建随机突变 体文库， 从中筛选优势性能的Gluc荧光素酶突变体， 工作量大， 比较繁琐并且盲目性较大。 0036 所以， 本发明的发明人基于对Gluc荧光素酶结构的理性分析， 0037 通过在Gluc的C端引。
18、入一个SEP-tag(GDDDGDDDGDDD)； 然后选择同时具有trxB-/ gor-抗性基因和DsbC氧化还原基因的大肠杆菌菌株提供二硫键正确折叠所需要的氧化环 境而解决了上述问题。 0038 本发明的上述方法构思也适用于其他二硫键蛋白， 如vtPA N-HIS、 AppA、 Cel9A、 PhoA、 Chitinase和CelZ等。 0039 实施例1 0040 荧光素酶Gluc-SEP基因表达载体的构建 0041 1.引物 0042 正向引物： 0043 5 -CGCGGATCCATGAAGCCCACCGAGAACAACGAA-3 ； (SEQ ID NO： 1) 0044 反向引物。
19、： 0045 5 -ACGCCGTCGACGTCGTCGTCTCCGTCGTCGTCTCCGTCACCACCGGCCCCCTTGATCTT-3 (SEQ ID NO： 2) 0046 2.Gluc荧光素酶基因的PCR扩增 0047 PCR反应体系： 0048 5 L 10High Figelity PCR buffer， 15mM MgCl2,1mM dNTP Mix,0.3 M正向引 物， 0.3 M反向引物， 10pg模板量， 1.25U High Fidelity PCR Enzyme Mix,最后补充双蒸水 至总体系为50 L； 0049 PCR反应条件： 0050 94预变性3min。
20、， 94变性30s， 58退火30s， 72延伸40s， 反应循环25次， 最后 72终延伸10min。 0051 3.荧光素酶Gluc-SEP基因表达载体的构建 说明书 3/6 页 5 CN 106754772 A 5 0052 将上述步骤2获得的含有Gluc荧光素酶基因的PCR扩增产物用限制性内切酶BamH I和Sal I进行双酶切， 酶切产物与用同样酶切的载体pET28a用T4DNA连接酶进行连接， 得到 荧光素酶Gluc-SEP基因表达载体； 0053 插入的荧光素酶Gluc基因的序列如下： 0054 ATGAAGCCCACCGAGAACAACGAAGACTTCAACATCGTGGCC。
21、GTGGCCAGCAACTTCGCGACCACGGATCTCGATGC TGACCGCGGGAAGTTGCCCGGCAAGAAGCTGCCGCTGGAGGTGCTCAAAGAGATGGAAGCCAATGCCCGGAAAGCTG GCTGCACCAGGGGCTGTCTGATCTGCCTGTCCCACATCAAGTGCACGCCCAAGATGAAGAAGTTCATCCCAGGACGC TGCCACACCTACGAAGGCGACAAAGAGTCCGCACAGGGCGGCATAGGCGAGGCGATCGTCGACATTCCTGAGATTCC TGGGTTCAAGGACTTGGAGCCCATGGAGCA。
22、GTTCATCGCACAGGTCGATCTGTGTGTGGACTGCACAACTGGCTGCC TCAAAGGGCTTGCCAACGTGCAGTGTTCTGACCTGCTCAAGAAGTGGCTGCCGCAACGCTGTGCGACCTTTGCCAGC AAGATCCAGGGCCAGGTGGACAAGATCAAGGGGGCCGGTGGTGAC； (SEQ ID NO： 3) 0055 标签SEP-tag的基因序列如下： 0056 GGAGACGACGACGGAGACGACGAC。 (SEQ ID NO： 4) 0057 实施例2 0058 Gluc-SEP-Shuffle表达菌株的制备 0059。
23、 将实施例1的荧光素酶Gluc-SEP基因表达载体在42热处理转化到大肠杆菌感受 态细胞DH5 ， 经37培养复苏并涂布到LB平板(含有25 g/ml卡那霉素)筛选， 挑取菌落进行 菌落PCR和双酶切鉴定阳性克隆， 筛选到的阳性菌株经培养后提取质粒， 最后进行基因测序 鉴定； 之后将测序鉴定正确的质粒热处理转化到SHuffle T7B E.coli表达菌株， 并进行甘 油菌保种冻存以备用。 0060 实施例3 0061 Gluc-SEP-Shuffle蛋白的表达及纯化 0062 首先将冻存的甘油菌Gluc-SEP-SHuffle接种到LB液体培养基(含有25 g/ml氨苄 青霉素)中， 37，。
24、 225rpm培养过夜活化菌株， 其次按1:100的比例将活化的菌液接种到新鲜 的LB液体培养基(含有100 g/ml氨苄青霉素)中， 培养至OD600达到0.4-0.6， 即为菌种的生 长对数期， 然后加入诱导剂异丙基- -D-1-硫代半乳糖苷IPTG(终浓度为1mM)在37诱导蛋 白表达7h， 4下11000rpm离心10min收集菌体， 弃去上清LB培养基， 加入一定量的结合缓冲 液(20mM Na3PO4， 0.5M NaCl， 40mM咪唑溶液， pH 7.4)悬浮菌体， 利用超声波破碎菌体， 超声 3sec， 间隔4sec， 超声直至溶液完全澄清透明后于4离心高速分离去除不溶性蛋白。
25、， 获得 上清可溶性蛋白； 利用Ni柱中的填料硫酸镍与表达载体上的组氨酸标签融合蛋白能特异性 结合的原理去除杂蛋白， 再用咪唑洗脱液(20mM Na3PO4， 0.5MNaCl， 150mM咪唑溶液， pH 7.4) 的竞争性结合到Ni柱填料， 将组氨酸融合蛋白从柱子上洗脱下来， 得到的蛋白经透析去除 咪唑得到Gluc荧光素酶目的蛋白(Gluc-SEP-Shuffle蛋白)。 0063 对比例1 0064 1.Gluc-SEP-BL21(DE3)表达菌株的制备 0065 将实施例1的荧光素酶Gluc-SEP基因表达载体在42热处理转化到大肠杆菌感受 态细胞DH5 ， 经37培养复苏并涂布到LB。
26、平板(含有25 g/ml卡那霉素)筛选， 挑取菌落进行 菌落PCR和双酶切鉴定阳性克隆， 筛选到的阳性菌株经培养后提取质粒， 最后进行基因测序 说明书 4/6 页 6 CN 106754772 A 6 鉴定； 之后将测序鉴定正确的质粒热处理转化到BL21(DE3)大肠杆菌， 并进行甘油菌保种冻 存以备用； 0066 2.Gluc-SEP-BL21(DE3)蛋白的表达及纯化 0067 首先将冻存的甘油菌Gluc-SEP-BL21(DE3)接种到LB液体培养基(含有25 g/ml氨 苄青霉素)中， 37， 225rpm培养过夜活化菌株， 其次按1:100的比例将活化的菌液接种到新 鲜的LB液体培养。
27、基(含有100 g/ml氨苄青霉素)中， 培养至OD600达到0.4-0.6， 即为菌种的 生长对数期， 然后加入诱导剂异丙基- -D-1-硫代半乳糖苷IPTG(终浓度为1mM)在25诱导 蛋白表达4h， 4下11000rpm离心10min收集菌体， 弃去上清LB培养基， 加入一定量的结合缓 冲液(20mM Na3PO4， 0.5M NaCl， 40mM咪唑溶液， pH7.4)悬浮菌体， 利用超声波破碎菌体， 超声 3sec， 间隔4sec， 超声直至溶液完全澄清透明后于4离心高速分离去除不溶性蛋白， 获得 上清可溶性蛋白； 利用Ni柱中的填料硫酸镍与表达载体上的组氨酸标签融合蛋白能特异性 结。
28、合的原理去除杂蛋白， 再用咪唑洗脱液(20mM Na3PO4， 0.5MNaCl， 150mM咪唑溶液， pH 7.4) 的竞争性结合到Ni柱填料， 将组氨酸融合蛋白从柱子上洗脱下来， 得到的蛋白经透析去除 咪唑得到Gluc荧光素酶目的蛋白(Gluc-SEP-BL21(DE3)蛋白)。 0068 取实施例3和对比例1的Gluc荧光素酶目的蛋白进行生物发光分析: 0069 Gluc荧光素酶生物发光的反应是以肠腔素(coelenterazine)作为催化底物的， 底 物的贮存液采用乙醇配至浓度为0.5mg/ml， 并贮存在-80冰箱备用。 0070 光谱分析： 2种Gluc荧光素酶目的蛋白的光谱分。
29、析都采用Tecan Infinite M1000 PRO多功能酶标仪检测， 并使用Corning黑色透明底96孔板进行反应， 其中反应总体系为200 L， 加入荧光素酶的量为0.2 M， 底物量为5.9 M， 其余的用1PBS缓冲液进行补充。 检测的 参数设定为扫描范围为200-400nm， 间隔时间为800ms， 峰宽为20nm。 0071 生物发光活性分析： 2种Gluc荧光素酶目的蛋白的生物发光活性分析都采用 Perkin Elmer VICTOR X4多标记微孔板检测仪进行检测， 并使用Greine白色96孔板进行反 应， 其中反应总体系为200 L， 加入荧光素酶的量为1pmol， 。
30、底物量为5.9 M， 其余的用1PBS 缓冲液进行补充。 检测的滤光片设定为480/40nm。 同时分别取等量的酶液于60孵育30min 后测定其生物发光热稳定性。 0072 结论： 0073 图1中是实施例3和对比例1的荧光光谱发射峰的比较， 其中Gluc-SEP-SHuffle的 发射峰在480nm， Gluc-SEP-BL21(DE3)的发射峰在477nm， 通过比较得知Gluc-SEP-SHuffle 具有较高的荧光强度。 0074 图2中是实施例3和对比例1的荧光活性比较； 其中Gluc-SEP-Shuffle具有比Gluc- SEP-BL21(DE3)高达2倍的活性。 0075 图。
31、3中是实施例3和对比例1的荧光活性衰减动力学的比较； 其中Gluc-SEP- Shuffle的半衰期高达6min， 而Gluc-SEP-BL21(DE3)的半衰期不到1min。 0076 图4中是实施例3和对比例1的热稳定性比较； 其中Gluc-SEP-SHuffle在60孵育 30min后活性能保留80以上， 而Gluc-SEP-BL21(DE3)的活性只能保留60。 0077 对实施例3和对比例1的Gluc荧光素酶目的蛋白的二级结构进行圆二色谱CD分析: 0078 2种Gluc荧光素酶目的蛋白的二级结构都采用Jasco J-815圆二色谱进行分析， 采 用的比色皿的光学量程为1mm， 所有。
32、的样品都经过提前预处理更换缓冲液为圆二色谱检测 说明书 5/6 页 7 CN 106754772 A 7 缓冲液20mM磷酸钠溶液(pH为7.2-7.4)， 所检测的蛋白浓度稀释到0.2mg/ml。 设定圆二色谱 参数为： 扫描范围250-190nm， 灵敏度100mdeg， 数据间距0.5nm， 连续的扫描模式， 扫描速度 100nm/min， 间隔时间1s， 峰宽1nm， 测定3次平均。 圆二色谱热力学分析选用不同的温度分别 为25、 45、 65、 85和95。 在测定样品前首先测定圆二色谱缓冲液的背景值， 并设置 扣除缓冲液背景， 最后才进行样品分析。 所有的数据经过一个圆二色谱分析网。
33、(http:/ dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/home.shtml)进行处理， 其中分析模式选择SELCONS和 set 4， 最后计算Gluc荧光素酶的二级结构组成。 0079 结论： 0080 图5中是实施例3和对比例1的圆二色谱峰比较； 其中Gluc-SEP-SHuffle表现了极 强的信号值。 0081 图6A是对比例1的圆二色谱热力学稳定性图， 图6B是实施例3的圆二色谱热力学稳 定性图， 温度设定为25到95； 比较图6A和6B， 从光谱图看变化不大。 0082 实施例3和对比例1的二级结构组成比较， 如表1所示， 0083 表1 0084 0085。
34、 表1中Gluc-SEP-SHuffle从常温25到高温95， 二级结构没有任何改变， 是由大 部分 -螺旋(包括58.2 -螺旋， 22.2的扭曲 -螺旋)、 无序状(14.4)和少数转角 (5.2)结构组成的； 而Gluc-SEP-BL21(DE3)二级结构发生了极大的变化， 特别是没有完全 正确折叠的部分 -折叠在加热中可以逐渐形成 -螺旋结构直至稳定。 其中 R为 -螺旋， D为 扭曲 -螺旋结构， R为 -折叠结构， D为扭曲 -折叠结构， T为转角结构， U为无序结构。 0086 最后应说明的是： 以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案， 而非对其限制； 尽 管参照前述各实施例对本。
35、发明进行了详细的说明， 本领域的普通技术人员应当理解： 其依 然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改， 或者对其中部分或者全部技术特征进 行等同替换； 而这些修改或者替换， 并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术 方案的范围。 说明书 6/6 页 8 CN 106754772 A 8 中国科学院深圳先进技术研究院 基于Gluc荧光素酶的二硫键蛋白及制备方法 4 PatentIn version 3.5 1 33 DNA 人工序列 1 cgcggatcca tgaagcccac cgagaacaac gaa 33 2 59 DNA 人工序列 2 acgccgtcga cgtcgtc。
36、gtc tccgtcgtcg tctccgtcac caccggcccc cttgatctt 59 3 507 DNA 人工序列 3 atgaagccca ccgagaacaa cgaagacttc aacatcgtgg ccgtggccag caacttcgcg 60 accacggatc tcgatgctga ccgcgggaag ttgcccggca agaagctgcc gctggaggtg 120 ctcaaagaga tggaagccaa tgcccggaaa gctggctgca ccaggggctg tctgatctgc 180 ctgtcccaca tcaagtgcac gc。
37、ccaagatg aagaagttca tcccaggacg ctgccacacc 240 tacgaaggcg acaaagagtc cgcacagggc ggcataggcg aggcgatcgt cgacattcct 300 gagattcctg ggttcaagga cttggagccc atggagcagt tcatcgcaca ggtcgatctg 360 tgtgtggact gcacaactgg ctgcctcaaa gggcttgcca acgtgcagtg ttctgacctg 420 ctcaagaagt ggctgccgca acgctgtgcg acctttgcca gcaagatcca gggccaggtg 480 gacaagatca agggggccgg tggtgac 507 4 24 DNA 人工序列 4 ggagacgacg acggagacga cgac 24 序列表 1/1 页 9 CN 106754772 A 9 图1 图2 说明书附图 1/4 页 10 CN 106754772 A 10 图3 图4 说明书附图 2/4 页 11 CN 106754772 A 11 图5 图6A 说明书附图 3/4 页 12 CN 106754772 A 12 图6B 说明书附图 4/4 页 13 CN 106754772 A 13 。