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1、(10)授权公告号 CN 101475575 B (45)授权公告日 2010.12.22 CN 101475575 B *CN101475575B* (21)申请号 200910010304.5 (22)申请日 2009.02.05 C07D 491/22(2006.01) A61K 31/529(2006.01) A61K 47/36(2006.01) A61P 25/30(2006.01) A61J 3/00(2006.01) (73)专利权人 王维国 地址 116001 辽宁省大连市中山区秀月街 65 号 5-1 (72)发明人 王维国 (74)专利代理机构 大连科技专利代理有限责任 。
2、公司 21119 代理人 于忠晶 (54) 发明名称 河豚毒素的提取、 及河豚毒素用于杜冷丁类 药物依赖的制剂 (57) 摘要 本发明涉及河豚毒素的提取， 另外还涉及河 豚毒素的制剂。河豚毒素的提取， 第一步原液提 取 ： 取菊黄东方豚卵巢， HAC 溶液浸泡取得原液 ； 第二步树脂交换 ： 树脂为 D152 阳性大孔丙烯酸弱 酸性树脂， 经常法处理转 NH4 型， 双柱两次交换， A 柱为玻璃柱内下层装树脂， 上层装硅藻土 ； B 柱为 玻璃柱内下层装中性氧化铝， 上层装树脂 ； 双柱 交换后再进行第三步洗脱 ： 双柱洗脱后合并交换 和洗脱收集的强毒馏分， 结晶得河豚毒素粗品结 晶。本发明河。
3、豚毒素提取方法提高了产品的收率 和纯度。制剂贮藏期限更长， 用于脱瘾治疗， 具有 起效快， 控制症状彻底， 过度平稳， 易接收等特点。 (51)Int.Cl. 审查员 陈曦 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 9 页 CN 101475575 B1/1 页 2 1. 河豚毒素的提取， 包括原液提取、 树脂交换和洗脱步骤， 第一步原液提取 ： 取菊黄东方豚卵巢， 切成 1-2cm 片状小块， 用 0.1 -0.5乙酸溶液 浸泡、 搅拌， 48 小时后用甩干机甩干得原液， 加热至沸腾， 立即停止加热， 除去凝固蛋白， 原 液冷却后用 50-80 目筛。
4、初滤， 再经白陶土纸浆过滤， 得浅黄色透明原液， 卵渣继续分次 浸泡 24 小时， 重复上述步骤收集滤液， 共取得原液 20L， 用氨水调制 pH5-7， 加 1-5正丁醇 或 1-2甲醛防腐， 常温放置备用 ； 第二步树脂交换 ： 树脂为 D152 阳性大孔丙烯酸弱酸性树脂， 经常法处理转 NH4型， 双柱 两次交换， A 柱为玻璃柱内下层装树脂， 上层装硅藻土 ； B 柱为玻璃柱内下层装中性氧化铝， 上层装树脂 ； A 柱 ： 原液上树脂柱进行交换， 流速 100-120ml/min， 树脂交换后期用小鼠毒性跟踪， 当 小鼠显中毒反应时， 表明树脂交换已达饱和程度， 停止原液上柱， 用去离。
5、子水冲洗至流出液 无色， 茚三酮试验阴性止， 收集有毒馏分流出液 ； B 柱 ： 将 A 柱所收集的有毒馏分， 用氨水调 pH 值为 7， 开始上柱， 流速 30-50ml/min， 当 流出液 pH7 时， 小鼠毒性跟踪显毒性反应时， 停止上柱， 用去离子水 200L 冲洗柱， 收集强毒 馏分 ； 第三步洗脱 ： A 柱 ： 用 12的乙酸液洗脱， 流速 30-40ml/min， 当流出液 pH7， 小鼠毒性跟踪显毒性反 应时， 分步收集有毒馏分， 毒素高峰在 pH6.5-4.5 之间 ； B 柱 ： 将 A 柱树脂洗脱所得的有毒馏分， 用氨水调 pH6-7， 上柱， 用 10乙酸洗脱， 流。
6、速 50ml/min， 流出液 pH 7， 小鼠跟踪显毒性反应时， 分步收集强毒馏分， 弱毒部分做下次浸泡 用， 合并交换和洗脱收集的强毒馏分， 置于 0-5冷藏存放备用。 2. 根据权利要求 1 所述的河豚毒素的提取， 其特征是 ： 还包括结晶步骤， 在洗脱后进 行第四步结晶 ： 将 B 柱树脂交换和洗脱的强毒馏分， 分次真空减压浓缩， -10放置 24 小时 后， 取出融化解冻并加 8氨水调 pH8-9， 震动搅拌， 析出白色沉淀物， 滤取沉淀物， 沉淀物 用蒸馏水反复洗涤 3-5 次， 用 2 -5乙酸液溶解， 滤除不溶物杂质， 溶液中加 8 NH4水调 pH8-9， 0-5 度冷藏放置。
7、 24 小时， 取出再进行上述重结晶 2-3 次， 得河豚毒素粗品结晶。 3.根据权利要求2所述的河豚毒素的提取， 其特征是 ： 第四步结晶 ： 粗品结晶经高效液 相色谱分离纯化得纯品河豚毒素结晶， 经高效液相色谱分析， 纯度为 99。 4. 根据权利要求 1-3 任一所述的河豚毒素的提取， 其特征是 ： 第二步树脂交换 ： B 柱中 性氧化铝经180度活化处理2小时， 冷却后湿法上柱， 氧化铝先上柱， 然后树脂上柱， 使氧化 铝在柱的下层， 树脂在柱的上层。 权 利 要 求 书 CN 101475575 B1/9 页 3 河豚毒素的提取、 及河豚毒素用于杜冷丁类药物依赖的制 剂 一、 技术领。
8、域 ： 0001 本发明涉及河豚毒素的制法， 另外还涉及河豚毒素用于杜冷丁等麻醉药物的原料 药制剂。 二、 背景技术 ： 0002 河豚毒素 (Tetrodotoxin 简称 TTX) 是从河豚鱼卵巢或肝脏中提取分离的一种非 蛋白小分子化合物， 其分子式 ： C11H17N3O8， 分子量为 319.27。河豚毒素是专一性很强的细胞 膜钠离子通道阻滞剂， 可阻断神经传导， 从而起到镇痛、 戒毒的作用。临床用于内科、 外科、 皮肤科等领域。 0003 河豚毒素的提取分离， 最早为日本田原氏于 1909 年从河豚鱼卵巢中提取得到河 豚毒素粗品结晶， 并确立了其化学结构。 1972年日本学者岸义人小。
9、组化学合成了河豚毒素。 我国 1982 年北京防化院和河北水产研究所， 1984 年大连海洋渔业公司、 青岛、 天津等地相 继在河豚毒素提取分离方面获得成功， 目前各种提取方法大都采用平田后腾法， 即原液提 取 - 树脂交换 - 活性炭吸附 - 粗品结晶 - 苦味酸盐精制。活性炭吸附流程所用活性炭为动 物性活性炭， 分散性吸附法。河豚毒素损耗量很大， 而且用化学法， 苦味酸盐精制， 每 100kg 河豚卵巢河豚毒素收率最多 1.0-1.2g。 0004 河豚毒素的临床应用， 早在 30 年代日本人能三共株式会社已经将河豚毒素纯度 为 0.2-1.0(g/ml) 的粗制品 ( 推算当时商品每支含。
10、量为 35.7mg/ml) 用于镇痛。镇痉、 镇静 的治疗。日本学者项乃羲将河豚毒素注射液 ( 粗品 ) 用于鸦片类吸毒者的脱瘾治疗。阿片 类药依赖是人类在吸食注射毒品后， 会产生一种欣欲、 亢奋的感觉。当染上 毒瘾后会不 惜一切手段寻找毒品， 以满足这种精神和生理上的需要。 戒毒是一个非常痛苦的过程， 许多 吸毒者之所以最后放弃戒毒， 是因为无法忍受停止毒品后出现的戒断反应。 0005 目前市场上用于戒毒药品的主要有美沙酮、 LAAM、 石丙甲羟二羟、 吗啡酮和钠洛 酮， 而目前临床使用的戒毒药美沙酮自身具有成瘾性， 使戒毒者在戒除毒瘾后， 又不觉的染 上了另一种药瘾， 河豚毒素注射液作为新。
11、研究的戒毒药， 却不具有成瘾性， 而且脱瘾时间快 速， 只需要 4-7 天实为可推广的脱瘾药物。 0006 如国际专利 WO95/29903 提供 “氨基氢化喹唑啉化合物及其衍生物戒除药物依赖 的新用途” ， 将河豚毒素溶于 pH4-5 醋酸液， 制成河豚毒素含量为 5-300g/ml 的注射液。 0007 中国专利 CN96119454.5 提供一种用于戒毒镇痛药剂及其制法， 河豚毒素溶于 PH4-5 醋酸溶液中， 制成含量为 0.5-10.0g/ml 加入 0.0125 普鲁卡因复方注射针剂。 0008 中国专利 98102072.0 将河豚毒素溶于 1醋酸液中制成河豚毒素含量为 0.00。
12、1-0.45g/ml 注射液针剂。 0009 中国专利 CN1459286A 提供一种 “用于戒毒、 镇痛的河豚毒素呼吸道给药制剂” ， 将 原料药制成气雾剂、 喷雾剂。 0010 中国专利 CN1353990A 提供 “用于镇痛、 麻醉或治疗药物依赖性的制剂” 河豚毒素 说 明 书 CN 101475575 B2/9 页 4 含量为 5-100g/ml 的注射液针剂。 0011 中国专利 200410102449.2 提供 “河豚毒素衍生物的制备和戒毒、 镇痛用途” 将河 豚毒素溶于酒石酸中， 制成含量为 1-10g/ml 的注射液。 0012 上述发明对河豚毒素临床应用研究起到积极作用。7。
13、0 年代末期以来， 吸扎毒的 现行在我国又死灰复燃， 阿片类物质依赖已成为严重社会问题， 我们北方地区主要以杜冷 丁依赖比较多， 杜冷丁属于中枢性镇痛麻醉药物， 较强的成瘾性， 一旦成瘾有较强的心里渴 求， 获得欢快振奋感， 称之心里依赖， 逐渐发展躯体依赖。对于杜冷丁依赖患者的治疗往往 以其他成瘾性小的 A 片类物质进行递减替代疗法。这种疗法以小毒替代大毒的现象。有很 大的弊端， 如美沙酮。他是中枢吗啡多体激动剂， 也易产生依赖性， 而且疗程时间较长。因 而寻找一种起效快、 控制症状彻底过度平稳， 无毒副作用的药物势在必行。 而河豚毒素注射 液， 有较强的镇痛作用， 抑制或减轻戒断症状的出现。
14、。目前文献中报导河豚毒素注射液 ( 水 针剂 ) 和河豚毒素注射 ( 冻干剂 ) 一般都是由原药和稳定剂组成， 稳定剂有枸橼酸盐或右 旋糖酐双糖类。但上述配方的制剂稳定性很差， 较长时间存放后， 易产生差向异构化， 使河 豚毒素随时间的增长而逐步降低其含量， 影响药效的发挥， 治疗效果差。 三、 发明内容 ： 0013 本发明的目的是克服上述不足问题， 提供一种河豚毒素的提取， 提取方法简单易 操作， 收率大大提高。另外提供一种河豚毒素用于杜冷丁类药物依赖的制剂， 稳定性最佳， 储存期限长， 疗效好。 0014 本发明为实现上述目的所采用的技术方案是 ： 河豚毒素的提取， 包括原液提取、 树 。
15、脂交换和洗脱步骤， 0015 第一步原液提取 ： 取菊黄东方豚卵巢， 切成 1-2cm 片状小块， 用 0.1 -0.5 HAC 溶液浸泡、 搅拌， 48 小时后用甩干机甩干得原液， 加热至沸腾， 立即停止加热， 除去凝固蛋 白， 原液冷却后用50-80目筛初滤， 再经白陶土纸浆过滤， 得浅黄色透明原液， 卵渣继续 分次浸泡 24 小时， 重复上述步骤收集滤液， 共取得原液 20L， 用氨水调制 PH5-7， 加 1-5正 丁醇或 1-2甲醛防腐， 常温放置备用 ； 0016 第二步树脂交换 ： 树脂为D152阳性大孔丙烯酸弱酸性树脂， 经常法处理转NH4型， 双柱两次交换， A 柱为玻璃柱内。
16、下层装树脂， 上层装硅藻土 ； B 柱为玻璃柱内下层装中性氧 化铝， 上层装树脂 ； 0017 A 柱 ： 原液上树脂柱进行交换， 流速 100-120ml/min， 树脂交换后期用小鼠毒性跟 踪， 当小鼠显中毒反应时， 表明树脂交换已达饱和程度， 停止原液上柱， 用去离子水冲洗至 流出液无色， 茚三酮试验阴性止， 收集有毒馏分流出液 ； 0018 B柱 ： 将A柱所收集的有毒馏分， 用氨水调PH值为7， 开始上柱， 流速30-50ml/min， 当流出液 PH7 时， 小鼠毒性跟踪显毒性反应时， 停止上柱， 用去离子水 (200L) 冲洗柱， 收集 强毒馏分 ； 0019 第三步洗脱 ： 0。
17、020 A 柱 ： 交换后的 A 柱用 12的 HAC 液洗脱， 流速 30-40ml/min， 当流出液 PH7， 小鼠 毒性跟踪显毒性反应时， 分步收集有毒馏分， 毒素高峰在 PH6.5-4.5 之间 ； 0021 B 柱 ： 将 A 柱树脂洗脱所得的有毒馏分， 用氨水调 PH6-7， 上柱， 用 10 HAC 洗脱， 说 明 书 CN 101475575 B3/9 页 5 流速50ml/min， 流出液P H 7， 小鼠跟踪显毒性反应时， 分步收集强毒馏分， 弱毒部分做下次 浸泡用， 合并交换和洗脱收集的强毒馏分， 置于 0-5冷藏存放备用。 0022 所述河豚毒素的提取还包括结晶步骤，。
18、 在洗脱后进行第四步结晶 ： 将 B 柱树脂交 换和洗脱的强毒馏分， 分次真空减压浓缩， -10放置 24 小时后， 取出融化解冻并加 8氨 水调 PH8-9， 震动搅拌， 析出白色沉淀物， 滤取沉淀物， 沉淀物用蒸馏水反复洗涤 3-5 次， 用 2 -5 HAC 液溶解， 滤除不溶物杂质， 溶液中加 8 NH4水调 PH8-9， 0-5 度冷藏放置 24 小 时， 取出再进行上述重结晶 2-3 次， 得河豚毒素粗品结晶。 0023 所述第四步结晶 ： 粗品结晶经高效液相色谱分离纯化得纯品河豚毒素结晶， 经高 效相色谱分析， 纯度为 99。 0024 所述第二步树脂交换 ： B 柱中性氧化铝经。
19、 180 度活化处理 2 小时， 冷却后湿法上 柱， 氧化铝先上柱， 然后树脂上柱， 使氧化铝在柱的下层。 0025 本发明制得的河豚毒素用于杜冷丁类药物依赖的制剂， 1ml 制剂中含有河豚毒素 0.01-0.49g/ml， 含有河豚毒素 20-40 倍重量份的稳定剂硫酸软骨素。 0026 所述 1ml 制剂由下述原料配制而成 ： 0027 河豚毒素 0.48g 0028 0.5枸橼酸 0.002ml 0029 硫酸软骨素 9.6g 0030 注射用水 余量。 0031 所述用于杜冷丁类药物依赖的制剂的制备方法 ： 取河豚毒素溶于 0.5枸橼酸溶 液中， 硫酸软骨素溶于注射用水， 两溶液混合后。
20、加入注射用水， 调 PH 值 4-6， 充分搅拌均匀， 经除菌过滤、 超滤， 在无菌条件下计量灌装入安瓶中， 半开塞送冷冻干燥机 -40 度预冷， 打 开冷井制冷， 温度降至 -55 度时启动真空泵， 真空泵在 5 帕以下， 维持 24 小时， 然后升温在 30 度维持 14 小时压塞、 扎盖。 0032 本发明河豚毒素提取方法经过反复研究， 克服了活性炭仍有部分不可逆的吸附作 用的不足问题， 不采用活性炭吸附的流程， 直接用两次树脂交换， 两次树脂交换的 A 柱内径 大于 B 柱， 高度小于 B 柱， A 柱内装树脂， 在树脂上层加硅藻土， 在原液树脂交换中往往会在 柱的上部有菌团的形成， 。
21、使原液通过树脂柱流速减慢， 甚至树脂柱有阻塞现象的发生， 本发 明A柱树脂上层加硅藻土后， 可随时分步清除菌团， 提高了流速。 B柱内上层装树脂， 树脂下 层装中性氧化铝， 中性氧化铝对生物碱的分离， 具有较好的分离作用， 提高了河豚毒素的分 离效果， 从而提高了产品的收率和纯度， 减除了活性炭吸附工艺流程， 提高了收率 5-10。 0033 本发明河豚毒素用于杜冷丁类药物依赖的制剂， 有效剂量选用合理， 配料稳定剂 硫酸软骨素， 起到稳定作用更显著， 与同类产品相比贮藏期限更长， 保证产品疗效。本发明 制剂用于脱瘾治疗， 具有起效快， 控制症状彻底， 过度平稳， 易接收等特点， 是一种杜冷丁。
22、类 药物依赖脱瘾治疗较理想的药物。 四、 具体实施方式 ： 0034 下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明， 但本发明不限于具体实施 例。 0035 实施例 1 说 明 书 CN 101475575 B4/9 页 6 0036 河豚毒素的提取， 包括原液提取、 树脂交换和洗脱步骤， 0037 第 一 步 原 液 提 取 ： 取 菊 黄 东 方 豚 卵 巢 100kg， 切 成 1-2cm 片 状 小 块， 用 0.1 -0.5 HAC 溶液 100L 浸泡、 搅拌， 48 小时后用甩干机甩干得原液， 直火加热至沸腾， 立即停止加热， 除去凝固蛋白， 原液冷却后用 50-80 目尼龙网初。
23、滤， 再经白陶土纸浆过 滤， 得浅黄色透明原液， 卵渣继续分次浸泡 24 小时， 重复上述步骤收集滤液， 共取得原液 20L， 用氨水调制 PH5-7， 加 1-5正丁醇或 1-2甲醛防腐， 常温放置备用 ； 0038 第二步树脂交换 ： 树脂为D152阳性大孔丙烯酸弱酸性树脂， 经常法处理转NH4型， 双柱两次交换， 树脂交换柱分为 A、 B 两柱， A 柱为玻璃制内径 9cm、 高 100cm， 柱内下层装入 树脂 5kg， ， 将 0.3-0.5kg 硅藻土装入树脂上层。B 柱为玻璃制内径 7cm、 高 120cm， 柱内装树 脂 3.5kg， 中性氧化铝 750g， 中性氧化铝经 18。
24、0 度活化 2 小时湿法上柱， 首先将 750g 中性氧 化铝上柱， 然后装入树脂 3.5kg 使氧化铝在 B 柱的下层， 树脂在 B 柱的上层 ； 0039 A 柱 ： 原液上树脂柱进行交换， 流速 100ml/min， 树脂交换后期用小鼠毒性跟踪， 当 小鼠显中毒反应时， 表明树脂交换已达饱和程度， 停止原液上柱， 用去离子水冲洗至流出液 无色， 茚三酮试验阴性止， 收集有毒馏分流出液 ； 0040 B 柱 ： 将 A 柱所收集的有毒馏分 7.5L， 用氨水调 PH 值为 7， 开始上柱， 流速 50ml/ min， 当流出液 PH7 时， 小鼠毒性跟踪显毒性反应时， 停止上柱， 用去离子。
25、水 (200L) 冲洗柱， 收集强毒馏分 ； 0041 第三步洗脱 ： 0042 A柱 ： 用12的HAC液洗脱， 流速40ml/min， 当流出液PH7， 小鼠毒性跟踪显毒性反 应时， 分步收集有毒馏分 100ml/ 份， 毒素高峰在 PH6.5-4.5 之间， 其收集有毒馏分 7.5L ； 0043 B 柱 ： 将 A 柱树脂洗脱所得的有毒馏分， 用氨水调 PH6-7， 上柱， 用 10 HAC 洗脱， 流速 50ml/min， 流出液 P H 7， 小鼠跟踪显毒性反应时， 分步收集强毒馏分 100ml/ 份， 弱毒 部分做下次浸泡用， 共收集强毒馏分 3.2L， 置于冰箱 0-5冷藏存放。
26、备用 ； 0044 第四步结晶 ： 将 B 柱树脂交换和洗脱的强毒馏分， 分次真空减压浓缩至 200ml， -10放置 24 小时后， 取出融化解冻并加 8 NH4水调 PH8-9， 震动搅拌， 析出白色沉 淀物， 滤取沉淀物， 沉淀物用蒸馏水反复洗涤 5 次， 用 2 -5 HAC 液溶解， 滤除不溶物杂 质， 溶液中加 8 NH4水调 PH8-9， 0-5 度冷藏放置 24 小时， 取出后再进行上述重结晶 3 次， 得河豚毒素粗品结晶 3.82g， 粗品结晶经高效液相色谱 (HPLC) 分离纯化得纯品河豚毒素结 晶 2.38g， 经高效相色谱 (HPLC) 分析， 纯度为 99。 0045。
27、 实施例 2 0046 采用实施例 1 制得的河豚毒素用于杜冷丁类药物依赖的制剂， 由下述原料按重量 份比配制而成 1000 支注射制剂， 每支 1ml ： 0047 河豚毒素 480g 0048 0.5枸橼酸 2ml 0049 硫酸软骨素 960g 0050 注射用水 余量。 0051 具体制备方法为 ： 取河豚毒素溶于 0.5枸橼酸溶液中， 硫酸软骨素溶于注射用 水， 两溶液混合后加入注射用水， 调 PH 值 4-6， 充分搅拌均匀， 经除菌过滤、 超滤， 在无菌条 件下计量灌装入安瓶中， 半开塞送冷冻干燥机 -40 度预冷， 打开冷井制冷， 温度将至 -55 度 说 明 书 CN 101。
28、475575 B5/9 页 7 时启动真空泵， 真空泵在真空度5帕以下， 维持24小时， 然后升温在30度维持14小时压塞、 扎盖。 0052 表 1 ： 不同河豚毒素注射液和河豚毒素冻干剂在常温下稳定性试验 0053 时 间 河豚毒素醋酸液 ( 水针 ) 河豚毒素含量 河豚毒素枸椽酸液 ( 水针 ) 河豚毒素含量 河豚毒素硫酸软骨素 ( 冻干剂 ) 河豚毒素含量 初 始 100-110 100-110 100-110 0 月 100 100 100 1 月 96.51 97.16 99.86 2 月 90.22 92.15 99.83 3 月 86.3 88.2 99.81 4 84.5 8。
29、4.12 99.82 月 5 月 80.12 82.30 99.80 6 月 77.40 80.14 99.80 0054 河豚毒素注射液(水针剂)和河豚毒素冻干剂， 在常温下进行稳定性试验， 按时取 样， HPLC 检测河豚毒素含量。 0055 稳定性试验表明 ： 河豚毒素醋酸液和枸橼酸液注射液随着储藏时间增长， 河豚毒 素含量逐渐下降， 河豚毒素加硫酸软骨素作为稳定剂， 其含量随时间增长基本无大变化， 因 此硫酸软骨素作为稳定剂阻止了河豚毒素差向异构化， 在常温条件下保持稳定。 0056 一、 河豚毒素 (TTX) 急性毒性实验 ： 0057 选取 18-22 克小白鼠 50 只， 随机分。
30、为 5 组， 每组 10 只。将 TTX 分别配成浓度为 说 明 书 CN 101475575 B6/9 页 8 2g/ml、 1g/ml、 0.78g/ml、 0.4g/ml、 0.2g/ml的溶液。 每只小白鼠肌肉注射TTX溶 液 0.4g/10 克， 左右后腿各一半， 饲养观察 10 天， 记录动物死亡数。结果 1g/ml 浓度下 肌肉注射的小鼠全部死亡， 而 0.4g/ml 以下浓度肌肉注射小鼠全部未死亡， LD50 浓度范 围在 1g/ml 到 0.4g/ml 之间。 0058 选取 18-22 克的小白鼠 150 只， 随机分为 5 组， 每组 30 只， 雌雄各半。TTX 溶液给。
31、 药剂量分为 20g/ml、 18g/kg、 16.2g/kg、 14.58g/kg、 12.56g/kg， 小白鼠肌肉注射 后， 饲养观察 10 天， 记录动物死亡数， 随时挑出死亡动物。统计结果如表 2 ： 0059 表 2 ： TTX 肌肉注射 LD50 实验结果 ： 0060 给药剂量 ( g/ml) 动物数 ( 个 ) 死亡率 ( ) 概率单位 20 30 100 15.435 18 30 100 15.435 16.2 30 70 11.183 14.58 30 33.3 9.751 12.56 30 6.67 6.962 0061 求得 LD50 15.18+1.085g/kg 。
32、0062 二、 河豚毒素注射液 30 天亚急性毒性试验方法和结果 ： 0063 选取健康 SD 大白鼠 120 只， 随机分成四组， 每组 30 只， 雌雄各半并分笼饲养， 每天 定时给水换饲料， 搞好动物饲养卫生。连续 30 天肌肉注射 TTX 注射液， 于四肢肌肉依次注 射。TTX 注射液高、 中、 低三个剂量组剂量分别为 5.2g/kg、 3g/kg、 2.2g/kg。对照组 注射等量盐水 0.2ml/100g， 给药期间， 每 3 天称动物体重一次， 观察记录动物的活动状况及 尿液粪便情况。给药 30 天后， 取血 30 天后， 取血液测试红细胞、 白细胞及血红蛋白量并进 行白细胞分类。
33、计数。测试血液谷丙转氨酶 (SGPT)， 谷草转氨酶 (SGOT) 活性及血液尿素氮 (BUN) 含量， 来评价动物肝、 肾功能的状况， 对动物进行大体解剖， 称取心、 肝、 脾、 肺、 肾等主 要脏器重量， 并对心、 肝、 肺、 肾、 脑、 子宫、 睾丸等几种主要脏器进行组织学切片， 光学显微 镜观察。评价器官有无病理变化。 0064 1、 给药过程中动物活动状况及体重变化 ： 0065 TTX 注射液高、 中、 低剂量组肌注 30 天， 中、 低剂量组动物活动正常， 尿液和粪便与 对照组比较无显著性差异。动物体重与对照组比较也无显著变化 ； TTX 注射液高剂量组在 肌注 3 天， 有一只。
34、雌性鼠死亡， 肌注第 7 天有一只雄性鼠死亡。观察死亡症状， 是属于毒性 致死， 主要器官无明显变化。 0066 2、 对血液血象的影响 0067 TTX 注射液高、 中、 低三个剂量组连续给药 30 天后动物血液红细胞数、 白细胞及血 红蛋白含量与对照组比较无显著差异。 说 明 书 CN 101475575 B7/9 页 9 0068 3、 对白细胞分类的影响 0069 TTX 注射液三个剂量组分别连续给药 30 天， 对各种类型白细胞无显著性影响。 0070 4、 对血液 SGPTSGOTBUN 等生化指标的影响 0071 TTX 注射液高、 中、 低三个剂量组连续给药 30 天， 血液中。
35、 SGPT、 SGOT、 活性和 BUN 含 量与对照组比较， 无显著性差异， 实验结果表明， 在现有剂量下， TTX 注射液对肝、 肾功能无 显著性影响。 0072 5、 动物大体解剖及主要脏器的影响 0073 TTX 注射液高、 中、 低三个剂量组连续肌注 30 天后， 经对动物大体解剖观察， 动物 主要脏器包括心、 肝、 肺、 肾、 脑、 子宫、 睾丸、 胃肠， 均未见异常症理现象。 0074 实验证明， TTX 注射液肌注 30 天， 在一定剂量范围内不会产生慢性毒性反应。 0075 三、 TTX 注射液成瘾性试验 ： 0076 1、 小鼠竖尾试验 0077 体 重 14-16 克 小。
36、 鼠 40 只，随 机 分 成 四 组 分 别 给 SC 吗 啡 15-20mg/kg， TTX0.1-2.6g/kg。观察 24 小时内小鼠活动情况， 吗啡组小鼠出现 S 形竖尾反应、 兴奋、 跑 动， 而TTX组小鼠无竖尾反应， 外观和未注射前几乎无区别。 8小时后重复以上试验， 吗啡组 小鼠竖尾现象更为明显。而 TTX 组仍无竖尾现象。证明 TTX 不属于吗啡类药物， 无成瘾性。 0078 另取小鼠 40 只， 随即分组， 分别 SC 吗啡和 TTX， 然后进行交叉试验。吗啡组从 20mg/kg 逐渐增至 25 天后的 45mg/kg， TTX 组从 0.1g/kg 增至 2.6g/kg。
37、， 吗啡组均有竖 尾现象， 而 TTX 组则无。25 天后原吗啡组小鼠改用 TTX2.6g/kg， 动物无竖尾， 而将 TTX 组 改用吗啡 45mg/kg 则小鼠出现竖尾现象。 0079 2、 小鼠跳跃反应试验 0080 采用纯种小鼠 30 只， 每组 10 只， A 组 SC 吗啡 2.5mg/kg， B 组 TTX0.5g/kg 和等体 积生理盐水 NS(C 组 )， 第一天注射 5 次， ( 注射时间为 9:00、 10:00、 11:00、 13:00、 15:00) 第 二天注射2次(注射时间为9:00、 11:00)， 剂量递增。 在末次给药2小时iP烯丙吗啡50mg/ kg， 。
38、观察小鼠 10 分钟内小鼠跳跃反应， 可见吗啡组在 iP 烯丙吗啡后出现跳跃反应。 0081 采用纯种小鼠体重 10-24 克， 分别分为 A、 B、 C 组， 每组 30 只， A 组每天皮下注射盐 酸吗啡剂量为 80mg/kg， 连续注射 20 天， B 组每天皮下注射 TTX0.5g/kg， 连续注射 20 天， C组为生理盐水对照组， 于最后一次给药后6小时， 给各组小鼠注射烯丙吗啡50mg/kg， 然后 将小鼠入塑料筒 (25*5cm) 观察小鼠反应， 并记录 60 分钟内小鼠的跳跃反应。吗啡组小鼠 (A) 在给药后显得很兴奋， 跑动频繁， 竖尾现象明显， 注射烯丙吗啡后， 小鼠出现。
39、明显跳跃反 应。TTX 组 (B) 小鼠给药后， 外观同时对照， 无竖尾反应， 在注射烯丙吗啡后均不见跳跃反 应。试验结果表明， TTX 明显区别于盐酸吗啡组， 说明 TTX 无药物依赖性。 0082 3、 猴成瘾试验 0083 恒河猴 8 只体重 2.58-4.85kg， 取 4 只每日各注射 TTX( 皮下 ) 两次， 剂量由 0.5g/kg 开始， 在 50 天内逐渐增至最大耐受量 7.5g/kg， 然后按此剂量分别维持到 52 天、 68 天、 和第 94 天， 4 只猴的累计注射剂量分别为 1.8、 4.2、 6.1、 7.3g/kg。第 64 天和 93 天， 分别停止给猴注射 T。
40、TX， 观察 24 小时， 结果猴的外观行为、 食欲与停药前无异常， 在 给药第 28 天、 54 天、 58 天和 69 天分别停药， 20 小时后皮下注射烯丙吗啡 5-10mg/kg， 均未 见猴外观出现戒断症状。另 4 只猴分别皮下注射吗啡两次， 始量为 6mg/kg， 于第 2 天递增 说 明 书 CN 101475575 B8/9 页 10 至 28mg/kg， 然后按此剂量维持， 30 天后猴已对吗啡产生依赖， 停止注射吗啡 48 小时后， 猴 子外观出现明显戒断综合症， 表现有 ： 在笼内烦躁不安， 翻滚， 时而趴卧笼底， 乱抓， 嚎叫、 呕 吐， 全身发抖等。此时给猴注射 ( 。
41、皮下 ) 烯丙吗啡， 上述症状更为明显， 此时给猴皮下注射 TTX0.5-2.5g/kg， 上述症状明显减弱或消失。这表明 TTX 具有抵抗吗啡戒断综合症的药 的作用。 0084 四、 河豚毒素治疗杜冷丁类药物依赖临床治疗观察 ： 0085 1、 对象和方法 ： 0086 所有观察对象是自愿戒毒患者。30 例均符合 CCMD-2R， DSM-III， 精神活性物质所 致精神障碍 - 阿片依赖诊断标准。男性 20 人， 女性 10 人， 年龄 20-30 岁 12 人、 31-40 岁 16 人， 40 岁以上 2 人。使用方法 ： 肌肉静注 22 人， 杜冷丁和海洛因混合使用者 8 人。吸毒时。
42、 间 1 年以下 10 人， 1-2 年 6 人， 2 年以上 14 人。瘾量 1000mg 以下 8 人， 1000-3000mg 以上 19 人， 3000mg 以上 3 人。详见表 3。 0087 河豚毒素注射液每支含量 0.48g/ml。用药方法 ： 根据扎毒的时间长短及戒断症 状反应的轻重， 及瘾量的大小， 采取不同的给药方法及药用量。一般采取每晚一次性给 1ml 河豚毒素制剂肌肉注射给药， 河豚毒素注射液加 50葡萄糖 20ml 静脉注射， 个别的戒断症 状重的采取二次 / 日的给药方法， 或辅助给小剂量的镇静药， 如安定和抗焦虑剂多虑平等。 0088 2、 观察方法 ： 0089。
43、 进行病史调查， 体格检查。 0090 治疗前后各查一次血尿便常规、 肝功、 心电图， 尿液毒物检测， 纳洛酮促瘾试验。 0091 戒断症状观察量表， 参考北京药物依赖研究中心所制定的阿片依赖戒断反应观察 量表。 0092 不良反应观察 ： 除每日测量体温， 呼吸、 心率、 血压外还要观察治疗药物不良反应。 0093 纳洛酮促瘾试验治疗前和治疗后各做一次。 0094 3、 观察结果 ： 0095 治疗时尿液毒物检测 30 例全部阳性， 给河豚毒素注射液后均转为阴性。 0096 治疗时纳洛酮促瘾试验 30 例均呈阳性， 用河豚毒素注射液治疗七天后， 经复查均 呈阴性。 0097 戒断症状变化情况。
44、 ： 0098 (1)、 精神状态及行为活动方面 ： 焦虑不安， 好争吵闹事， 困倦失眠， 消失时间 ： 最 短 1 天， 最后 6-7 天， 平均 1-9 天。 0099 (2) 躯体症状 ： 头痛、 肌肉痛、 骨痛、 消失时间 ： 最短 1 天， 最长 3 天， 平均 1-2 天。 0100 (3) 植物神经系统症状 ： 哈欠、 出汗、 汗毛竖立。 0101 交感神经系统症状， 流涕、 流泪， 食欲不振、 恶心呕吐、 腹泻、 胃肠痛 ( 副交感神经 系统 )， 消失时间最短 1-2 天， 最长 7-8 天， 平均 4-8 天。 0102 观察表明 ： 河豚毒素对缓解肌肉痛、 骨痛、 有明显。
45、的镇痛作用。辅助镇静药安定片 和小剂量的抗焦虑药， 能抑制和缩短焦虑、 不安， 失眠等症状的出现， 对其他戒断症状 ： 寒 战， 乏力、 食欲不振、 恶心、 呕吐、 也有改善的作用。( 详见表 4) 0103 不良反应观察 ： 出有个别病人在肌肉注河豚毒素注射液后感觉面部疼痛和恶心， 改静脉注射后症状小时。再未见其他不良反应。 说 明 书 CN 101475575 B9/9 页 11 0104 4、 讨论 ： 通过 30 例杜冷丁依赖患者应用河豚毒素制剂注射脱瘾治疗， 收到很好效 果。它具有脱瘾快、 治疗时间短戒断瘾小时快， 病人无痛苦、 无明显副作用。 0105 表 3 ： 观察对象特点与基。
46、本数据 0106 性别 男 22 人 女 8 人 用毒 方法 肌注 22 人 肌注和静注 10 人 用毒 种类 杜冷丁 23 人 杜冷丁和海洛因 7 人 年龄 20-30 岁 12 人 31 岁 -40 岁 16 人 40 岁以上 2 人 脱瘾 年限 一年以下 11 人 1-2 年 9 人 2 年以上 10 日瘾量 1000mg 以下 9 人 1000-3000mg19 人 3000mg 以上 2 人 0107 表 4 ： 戒断症状变化情况 0108 戒断症状 消失时间平均天 数 消失时间最长天 数 消失时间最短天 数 精神症状 4-9 天 8 天 2 天 植物神经症 状 1-8 天 7 天 1 天 躯体症状 3 天 6 天 1 天 说 明 书 。