技术领域
本发明属于制药工程技术领域，特别涉及到黑霉菌细胞生物催化制备手性医药中间体(S)-3-羟基-3-（4-溴苯基）丙酸甲酯的技术。
背景技术
手性(S)-3-羟基-3-（4-溴苯基）丙酸甲酯是合成手性药物、精细化学品、农药品和其他特殊材料的重要中间体。生物催化不对称反应具有环境友好、条件温和、选择性高等优点,作为绿色高效制备手性化合物的优先途径,被越来越多地应用于生产一些高附加值的手性化合物。生物催化制备手性(S)-3-羟基-3-（4-溴苯基）丙酸甲酯具有很好的应用前景。
生物催化具有催化效率高、选择性强、条件温和、环境友好等突出优点,是可持续发展过程中替代和拓展传统有机化学合成的重要方法。其中手性拆分和不对称合成是生物催化最具吸引力的应用领域。在作为生物催化剂的六大类酶中,水解酶能够催化动力学拆分外消旋体得到手性产品,在工业生物催化中一直扮演着重要角色。近几年来,氧化还原酶在工业上的应用得到了迅速增长。目前,采用水解酶动力学拆分法、生物还原法和生物氧化法工业制备光学活性手性化合物的比例为4:2:1。
生物还原法相对于动力学拆分法而言,最大的优势在于理论收率可达100%,原子经济性好。然而生物还原反应需要辅酶或辅因子的参与,一定程度上限制了其应用。由于辅酶依赖性的缘故,生物还原反应中多釆用整细胞作为催化剂,实现体内辅酶循环再生的同时免去了酶的分离纯化步骤。
(S)-3-羟基-3-（4-溴苯基）丙酸甲酯是合成手性药物、精细化学品、农药品的重要手性砌块，。现有的方法普遍存在转化率低、反应时间长、需要添加昂贵辅酶、成本高等严重缺陷，难于进行工业化生产。本发明将采用生物细胞催化制备(S)-3-羟基-3-（4-溴苯基）丙酸甲酯。
发明内容
本发明采用黑霉菌细胞催化制备(S)-3-羟基-3-（4-溴苯基）丙酸甲酯，反应式如下：
3-（4-溴苯基）-3-氧代丙酸甲酯（1）经黑霉菌催化反应，得到产物(S)-3-羟基-3-（4-溴苯基）丙酸甲酯（2）。有多种微生物可以催化此反应，经过大量实验筛选，最终确定采用黑霉菌作为催化剂，因为其催化反应的效果最好，反应收率、对映体过量率（ee%）均很高。
许多黑霉菌都可以进行生物催化此反应，然而，其效果不同，相差很大，经实验，本发明选用黑霉菌菌株为ATCC56836，其催化反应效果最佳。
由于绝大多数氧化还原酶是辅酶NAD(P)H依赖型,而细胞本身所含有的辅酶量可能较少,因此,进行氧化还原反应时,为促进辅酶再生，提高反应效率，在反应体系中还添加辅助底物构成转化体系。常用的辅助底物种类较多，不同细胞所需的辅助底物不同，效果差别很大，采用几种辅助底物组合，可以取得较好效果，需进行大量实验才能确定最佳的辅助底物。本发明经过大量实验确定的辅助底物为：木糖20-24g/L、蔗糖25-28g/L、异丙醇7-9%V/V(体积浓度)。
由于底物溶解度较低，所以，加入表面活性剂以增加底物的溶解度。
培养介质：
1、 种子培养基成份为:玉米浆(以干物质计)含量为35-45g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L，硫酸铵0.5-0.7g/L，硫酸镁0.3-0.4g/L，磷酸二氧钾1.8-2.3g/L;配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉。
2、培养液成份：玉米浆(以干物质计)含量为35-45g/L，黄豆粉3-5g/L，酵母浸膏6-9g/L，葡萄糖18-22g/L，麦芽浸膏25-30g，硫酸铵0.5-0.7g/L，硫酸镁0.3-0.4g/L，磷酸二氧钾1.8-2.3g/L，碳酸钙0.7g/L,硫酸亚铁0.18g/L,硫酸锰0.025g/L;pH6.3
2、固体培养基成份：在液体培养基中加入2%的琼脂粉。
黑霉菌细胞制备。黑霉菌经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液；发酵罐加入培养液，121℃高压灭菌30分钟，冷却至25-26℃，将黑霉菌种子液接种至发酵罐，接种比例为10-11％，通气比为0.9-1V/（V分钟），25-26℃培养35-40小时，用过滤式离心机离心得到湿黑霉菌细胞，用作生物催化反应催化剂。
生物催化转化。底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液，pH为6.3，加入底物3-（4-溴苯基）-3-氧代丙酸甲酯，使底物浓度为80-90g/L。其他成份：玉米浆(以干物质计)含量为19-20g/L，吐温8019-20g/L、木糖20-24g/L、蔗糖25-28g/L、异丙醇7-9%V/V(体积浓度)，121℃高压灭菌30分钟；冷却至25-26℃时，加入湿黑霉菌细胞使其浓度为81-85g/L，通气比为0.13-0.14V/（V分钟），进行生物催化反应，反应时间为73-76小时；反应结束后，滤出细胞，用乙酸乙酯萃取反应液，蒸出乙酸乙酯，得到产物(S)-3-羟基-3-（4-溴苯基）丙酸甲酯，反应转化率98-99％，产品收率96-97％，对映体过量率98.5-99％。
本发明所开展工作包括菌株选择、催化反应条件优化（反应温度、通气量、pH）、反应介质选择和浓度优化，包括底物浓度、辅助底物组合、表面活性剂种类及浓度等。
实施例1
种子培养基成份为:玉米浆(以干物质计)含量为35-45g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L，硫酸铵0.5-0.7g/L，硫酸镁0.3-0.4g/L，磷酸二氧钾1.8-2.3g/L;配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉。
培养液成份为：玉米浆(以干物质计)含量为35-45g/L，黄豆粉3-5g/L，酵母浸膏6-9g/L，葡萄糖18-22g/L，麦芽浸膏25-30g，硫酸铵0.5-0.7g/L，硫酸镁0.3-0.4g/L，磷酸二氧钾1.8-2.3g/L，碳酸钙0.7g/L,硫酸亚铁0.18g/L,硫酸锰0.025g/L;pH6.3
湿黑霉菌细胞制备过程如下：黑霉菌ATCC56836经斜面、摇瓶培养，得到种子液。1L发酵罐加入培养液；发酵罐加入培养液，121℃高压灭菌30分钟，冷却至25-26℃，将黑霉菌种子液接种至发酵罐，接种比例为接种比例为10-11％，通气比为0.9-1V/（V分钟），25-26℃培养35-40小时，用过滤式离心机离心得到湿黑霉菌细胞，用作生物催化反应催化剂。
生物催化转化：0.5L底部通气搅拌反应器中加入磷酸盐缓冲液，pH为6.3，加入底物3-（4-溴苯基）-3-氧代丙酸甲酯，使其浓度为80g/L，玉米浆(以干物质计)含量为19g/L，吐温8020g/L、木糖24g/L、蔗糖25g/L、异丙醇9%V/V(体积浓度)，121℃高压灭菌30分钟；冷却至26℃时，加入湿黑霉菌细胞使其浓度为81g/L，通气比为0.13V/（V分钟），进行生物催化反应，反应时间为76小时；反应结束后，滤出细胞，用乙酸乙酯萃取反应液，蒸出乙酸乙酯，得到产物(S)-3-羟基-3-（4-溴苯基）丙酸甲酯，反应转化率99％，产品收率97％，对映体过量率98.5％。
实施例2
种子培养基成份为:玉米浆(以干物质计)含量为35-45g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L，硫酸铵0.5-0.7g/L，硫酸镁0.3-0.4g/L，磷酸二氧钾1.8-2.3g/L;配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉。
培养液成份为：玉米浆(以干物质计)含量为35-45g/L，黄豆粉3-5g/L，酵母浸膏6-9g/L，葡萄糖18-22g/L，麦芽浸膏25-30g，硫酸铵0.5-0.7g/L，硫酸镁0.3-0.4g/L，磷酸二氧钾1.8-2.3g/L，碳酸钙0.7g/L,硫酸亚铁0.18g/L,硫酸锰0.025g/L;pH6.3
湿黑霉菌细胞制备过程如下：黑霉菌ATCC56836经斜面、摇瓶培养，得到种子液。5L发酵罐加入培养液；发酵罐加入培养液，121℃高压灭菌30分钟，冷却至25-26℃，将黑霉菌种子液接种至发酵罐，接种比例为10-11％，通气比为0.9-1V/（V分钟），25-26℃培养35-40小时，用过滤式离心机离心得到湿黑霉菌细胞，用作生物催化反应催化剂。
生物催化转化：5L底部通气搅拌反应器中加入磷酸盐缓冲液，pH为6.3，加入底物3-（4-溴苯基）-3-氧代丙酸甲酯，使其浓度为90g/L，玉米浆(以干物质计)含量为20g/L，吐温8019g/L、木糖20g/L、蔗糖28g/L、异丙醇7%V/V(体积浓度)，121℃高压灭菌30分钟；冷却至25℃时，加入湿黑霉菌细胞使其浓度为83g/L，通气比为0.14V/（V分钟），进行生物催化反应，反应时间为73小时；反应结束后，滤出细胞，用乙酸乙酯萃取反应液，蒸出乙酸乙酯，得到产物(S)-3-羟基-3-（4-溴苯基）丙酸甲酯，反应转化率98％，产品收率96％，对映体过量率99％。
实施例3
种子培养基成份为:玉米浆(以干物质计)含量为35-45g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L，硫酸铵0.5-0.7g/L，硫酸镁0.3-0.4g/L，磷酸二氧钾1.8-2.3g/L;配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉。
培养液成份为：玉米浆(以干物质计)含量为35-45g/L，黄豆粉3-5g/L，酵母浸膏6-9g/L，葡萄糖18-22g/L，麦芽浸膏25-30g，硫酸铵0.5-0.7g/L，硫酸镁0.3-0.4g/L，磷酸二氧钾1.8-2.3g/L，碳酸钙0.7g/L,硫酸亚铁0.18g/L,硫酸锰0.025g/L;pH6.3
湿黑霉菌细胞制备过程如下：黑霉菌ATCC56836经斜面、摇瓶培养，得到种子液。10L发酵罐加入培养液；发酵罐加入培养液，121℃高压灭菌30分钟，冷却至25-26℃，将黑霉菌种子液接种至发酵罐，接种比例为10-11％，通气比为0.9-1V/（V分钟），25-26℃培养35-40小时，用过滤式离心机离心得到湿黑霉菌细胞，用作生物催化反应催化剂。
生物催化转化：10L底部通气搅拌反应器中加入磷酸盐缓冲液，pH为6.3，加入底物3-（4-溴苯基）-3-氧代丙酸甲酯，使其浓度为84g/L，玉米浆(以干物质计)含量为19g/L，吐温8020g/L、木糖22g/L、蔗糖26g/L、异丙醇8%V/V(体积浓度)，121℃高压灭菌30分钟；冷却至26℃时，加入湿黑霉菌细胞使其浓度为84g/L，通气比为0.13V/（V分钟），进行生物催化反应，反应时间为73小时；反应结束后，滤出细胞，用乙酸乙酯萃取反应液，蒸出乙酸乙酯，得到产物(S)-3-羟基-3-（4-溴苯基）丙酸甲酯，反应转化率98.5％，产品收率96.5％，对映体过量率99％。
实施例4
种子培养基成份为:玉米浆(以干物质计)含量为35-45g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L，硫酸铵0.5-0.7g/L，硫酸镁0.3-0.4g/L，磷酸二氧钾1.8-2.3g/L;配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉。
培养液成份为：玉米浆(以干物质计)含量为35-45g/L，黄豆粉3-5g/L，酵母浸膏6-9g/L，葡萄糖18-22g/L，麦芽浸膏25-30g，硫酸铵0.5-0.7g/L，硫酸镁0.3-0.4g/L，磷酸二氧钾1.8-2.3g/L，碳酸钙0.7g/L,硫酸亚铁0.18g/L,硫酸锰0.025g/L;pH6.3
湿黑霉菌细胞制备过程如下：黑霉菌ATCC56836经斜面、摇瓶培养，得到种子液。10L发酵罐加入培养液；发酵罐加入培养液，121℃高压灭菌30分钟，冷却至25-26℃，将黑霉菌种子液接种至发酵罐，接种比例为10-11％，通气比为0.9-1V/（V分钟），25-26℃培养35-40小时，用过滤式离心机离心得到湿黑霉菌细胞，用作生物催化反应催化剂。
生物催化转化：20L底部通气搅拌反应器中加入磷酸盐缓冲液，pH为6.3，加入底物3-（4-溴苯基）-3-氧代丙酸甲酯，使其浓度为86g/L，玉米浆(以干物质计)含量为20g/L，吐温8019g/L、木糖23g/L、蔗糖27g/L、异丙醇9%V/V(体积浓度)，121℃高压灭菌30分钟；冷却至25℃时，加入湿黑霉菌细胞使其浓度为85g/L，通气比为0.14V/（V分钟），进行生物催化反应，反应时间为75小时；反应结束后，滤出细胞，用乙酸乙酯萃取反应液，蒸出乙酸乙酯，得到产物(S)-3-羟基-3-（4-溴苯基）丙酸甲酯，反应转化率99％，产品收率96.5％，对映体过量率99％。