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1、(10)授权公告号 CN 101724700 B (45)授权公告日 2013.05.15 CN 101724700 B *CN101724700B* (21)申请号 200910242827.2 (22)申请日 2009.12.17 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (73)专利权人 中国农业科学院北京畜牧兽医研 究所 地址 100193 北京市海淀区圆明园西路二号 (72)发明人 王栋 朱化彬 付强 彭秀丽 郝海生 程金华 杜卫华 赵学明 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王朋飞 CN 101591696 。
2、A,2009.12.02, 全文 . CN 101405404 A,2009.04.08, 全文 . (54) 发明名称 myostatin 基因第三外显子单碱基突变的快 速检测方法 (57) 摘要 本发明提供了一种检测牛肌肉生长抑制素 基因 (myostatin) 第三外显子单核苷酸多态性 (SNP) 的快速检测方法， 该方法针对 myostatin 基因第三外显子的 G A 突变， 设计了分别扩增 G938A 单碱基多态位点上游序列和下游序列的两 组 PCR 引物对， 其中各有一条为针对突变位点的 错配引物， 该引物的 3 末端位于突变位点上。利 用所述引物， 不同牛 DNA 样品可以得到。
3、不同扩增 结果， 从而判断牛 myostatin 基因第三外显子的 多态性。 本发明方法成本低廉、 操作简单、 快速、 准 确并适合于推广应用， 对快速准确地进行肉牛的 标记辅助选择， 加快肉牛选育进程及分子生物学 领域快速的 PCR 检测方法研究有着重要意义。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 张艳霞 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书6页 附图1页 (10)授权公告号 CN 101724700 B CN 101724700 B *CN101724700B* 1/1 页 2 1. 一。
4、种检测牛 Myostatin 基因第三外显子 SNP 位点的引物， 其包括分别扩增 G938A 单 碱基多态位点的上游序列和下游序列的两组 PCR 引物对， 其中各有一条为针对突变位点的 错配引物， 该引物的 3 末端位于突变位点上， 所述引物为 ： 向突变位点下游的错配引物 ： MF 5 -GCCAATTACTGCTCTGGCTAATA-3 ， 其下游引物 ： MR 5 -ATGGCTGGAATCTTCCCGTAT-3 ； 向突变位点上游的错配引物 ： WR 5 -GATGCTGTCGTTACCCTCTAAC-3 ， 其上游引物 ： WF 5 -CTTTTGCAGGAATACAACGTCAC。
5、-3 。 2. 含有权利要求 1 所述引物的检测试剂盒。 3. 一种检测牛 Myostatin 基因第三外显子 SNP 位点的方法， 其采用权利要求 1 所述的 引物或权利要求 2 所述的试剂盒扩增牛 DNA 样品， 并检测扩增产物。 4. 如权利要求 3 所述的方法， 其特征在于， 采用权利要求 1 所述引物进行 PCR 扩增后， 进行琼脂糖凝胶电泳检测， 其中， 呈现 185bp 和 262bp 两条带的为纯合突变型， 呈现 122bp 和 262bp 两条带的为纯合野生型， 呈现 122bp、 185bp 和 262bp 三条带的为杂合子。 5. 如权利要求 3 或 4 所述的方法， 其。
6、特征在于， 所述牛 DNA 样品为采用 Proteinase K 裂解法制备得到的毛囊基因组 DNA 样品。 6. 如权利要求 3 或 4 所述的方法， 其特征在于， PCR 反应程序为 ： 94 4min ； 94 5s， 52 53 5s， 72 5s， 30 个循环 ； 72 4min， 降温至 4。 权 利 要 求 书 CN 101724700 B 1/6 页 3 myostatin 基因第三外显子单碱基突变的快速检测方法 技术领域 0001 本发明涉及分子生物学领域， 具体涉及一种检测牛肌肉生长抑制素基因第三外显 子单核苷酸多态性 (SNP) 的快速检测方法。 背景技术 0002 肌。
7、肉生长抑制素 (myostatin) 又称生长分化因子 8(growthdifferentiation factor 8， GDF-8)， 是转化生长因子(transforminggrowth factor TGF-)超家族 的成员， 研究结果表明， 其功能为骨骼肌生长发育的负调控因子， 因此 GDF-8 的突变是造成 牛双肌的原因。比利时蓝牛的双肌个体在外显子 3 缺失 11bp(937-947)， 造成移码突变， 导 致从缺失后的 14 个密码子开始停止翻译， 结果 C- 端仅 7 个氨基酸被翻译， 之后的 102 个氨 基酸 (274-375) 全部丢失， 故翻译出的蛋白不能正常发挥其生。
8、物学功能。在皮埃蒙特牛中， 位于外显子 3 的 938 位 G A 突变， 导致所编码的氨基酸由保守半胱氨酸变成酪氨酸， 结果 肌肉生长抑制素的功能全部或几乎全部丧失 ( 孟和等， 2004 ； 史明艳等， 2005) ； 由于突变导 致的对肌肉生长基因抑制的消失使得具有该突变个体的肌肉生长异常发达， 肉牛育种中该 基因多态性的检测就显得尤为重要。 0003 目前针对 myostatin 基因第三外显子多态性除了直接测序外， 已建立了 3 种检测 方法 ： 0004 1)PCR-SSCP 法 0005 该方法是 PCR 技术与 SSCP 技术的结合， 其原理是根据单链 DNA 在非变性条件下 。
9、具有特定的构象， 而当 DNA 序列甚至单个碱基改变时， 这种特定构象就被改变， 在进行非变 性聚丙烯酰胺凝胶电泳时， 长度相等构象不同的单链 DNA 表现为不同的电泳迁移率， 从而 间接地对基因多态性进行检测分析 ( 薛燕等， 2005 ； 王威等， 2006)。该方法无需知道待检 测 DNA 片段序列上多态性的有无， 只要对目标序列进行 PCR 扩增， 然后 PCR 产物经变性处理 变为单链 DNA， 再经 SSCP 分析即可判定基因的多态性。能检测出 DNA 片段长度相同碱基序 列不同的所有突变位点 ； 但是检测结果重复性差、 存在假阳性和假阴性、 不能直接鉴定目标 位点的碱基多态类型，。
10、 必须借助于同位素或银染等显色技术进行检测分析， 耗时长、 操作繁 琐、 成本较高 (Sheffield V C et al， 1993 ； 薛燕等， 2005)。 0006 2) 聚 合 酶 链 反 应 - 限 制 性 片 段 长 度 多 态 性 (polymerase chainreaction-restriction fragment length polymorphism， PCR-RFLP) 方法 0007 该技术是根据限制性内切酶可以特异性地识别和切割DNA特异位点(4-6bp)的特 点， 利用 DNA 序列上碱基的突变即替换或插入、 缺失可以产生或消除一个特定酶切位点， 从 而使。
11、酶切产物发生片段大小的改变。所以， 目标位点进行 PCR 扩增后， 会由于 SNP 位点的存 在， 在目标产物中产生或消除了某个限制性内切酶位点， 通过选用特定的限制性内切酶对 PCR 扩增产物进行酶切和电泳检测， 而实现目标位点基因型多态性的鉴定分析。 0008 PCR-RFLP 法适用于一些小样本已知突变位点的检测， 具有操作简便、 特异性高、 重 复性好等优点， 但是酶切位点的选择难度较大、 酶切位点的有无和内切酶的价格也是实践 说 明 书 CN 101724700 B 2/6 页 4 中应该重点考虑的问题 ( 杨卫华等， 2002 ； 王威等， 2006)。 0009 3) 创造酶切位。
12、点方法 (Created Restriction Site PCR， CRS-PCR) 0010 根据单碱基突变位点的碱基替代情况设计 PCR 引物， 将突变位点附近的碱基 ( 如 前一位碱基 ) 设计为引物 3端， 在引物序列中人为引入错配碱基， 使得引物 3端和单碱 基突变的一种突变型在 PCR 扩增后形成一个酶切位点， 可以被相应的内切酶切割开来， 而 另外一个基因型却不能被所选用的内切酶切割开， 这样 PCR 扩增产物经酶切电泳后即可进 行基因多态性的分析鉴定。 0011 研究表明CRS-PCR法是检测已知突变位点SNP的有效方法， 灵活性较大， 可以进行 基因型的鉴定， 拓宽了 RF。
13、LP 方法的适用范围 ； 但是错配引物选择余地较小， 难度较大， 同时 错配碱基的选择要考虑形成酶切位点后对应的限制性内切酶是否容易购买和成本问题， 酶 切后短片段较小， 长片段与非酶切产物的差异较小， 基因型区分较难， 操作较繁琐， 耗时较 长 ( 赵春江等， 2003 ； 张忠彬等， 2004 ； Kwok S et al， 1990)。 0012 因此， 建立一种准确、 快速、 经济的检测牛 myostatin 基因外显子多态性的分子方 法是非常必要的。 发明内容 0013 本发明的目的在于提供一种进行牛 myostatin 基因第三外显子多态性简便、 快 捷、 低成本检测方法。 001。
14、4 本发明提供的检测 SNP 位点的方法， 使用分别扩增突变位点的上游序列和下游序 列的两组 PCR 引物对， 采取双重 PCR 方法对核酸样品进行扩增， 检测扩增产物。其中这两组 PCR 引物中各有一条为针对突变位点不同类型的错配引物， 该引物的 3 末端位于突变位点 上。也就是说， 用于扩增 SNP 位点下游序列引物对的上游引物， 以及用于扩增 SNP 位点上游 序列引物对的下游引物的 3 末端均位于突变位点上， 但是针对的是该位点不同类型的碱 基。为了便于检测， 这两组引物对的扩增产物的链长不相同。 0015 按照上述思路， 针对牛myostatin基因第三外显子SNP多态性位点， 本发。
15、明提供了 一种检测牛 myostatin 基因第三外显子 SNP 位点的引物， 其包括分别扩增 G938A 单碱基多 态位点的上游序列和下游序列的两组 PCR 引物对， 其中各有一条为针对突变位点不同类型 的错配引物， 该引物的 3 末端位于突变位点上。 0016 本发明针对该位点， 分别向上游和向下游设计了多个特异引物对， 经过多轮筛选 和反复试验， 发现以下两组引物对组合显著优于其他引物对， 这两组引物对的核苷酸序列 如下 ： 0017 向突变位点下游的错配引物 ： MF 5 -GCCAATTACTGCTCTGGCTAATA-3 ， 0018 其下游引物 ： MR 5 -ATGGCTGGA。
16、ATCTTCCCGTAT-3 ； 0019 向突变位点上游的错配引物 ： WR 5 -GATGCTGTCGTTACCCTCTAAC-3 ， 0020 其上游引物 ： WF 5 -CTTTTGCAGGAATACAACGTCAC-3 。 0021 myostatin 基因第三外显子突变位点被设置为错配引物的 3 末端， 同时调整了 3 端至 5 端第 5 和第 6 两个碱基， 这两个碱基的错配增加了对 myostatin 基因多态位点的特 异检测效果。 本发明没有再另设内标引物， 但在设计的引物中可以组合成内标引物使用， 即 内标引物实际隐含在上述引物之中。 说 明 书 CN 101724700 。
17、B 3/6 页 5 0022 本发明进一步提供一种用于上述 PCR 扩增的优化 PCR 反应程序， 该反应程序为 ： 94 4min ； 94 5s， 52 53 5s， 72 5s， 30 个循环 ； 72 4min， 降温至 4。 0023 本发明采用双引物 PCR 技术结合 PCR 错配技术建立了检测牛 myostatin 基因第三 外显子多态性简便、 快捷、 低成本的分子生物学检测方法， 为利用分子标记进行肉牛的标记 辅助选择提供了有效的技术手段。 0024 本发明针对 myostatin 基因的三个外显子设计了三对引物以南阳牛、 皮南牛、 皮 埃蒙特牛、 荷斯坦牛为实验材料对这三个外。
18、显子的多态性进行了筛选。对各物种血样基因 组 DNAPCR 扩增后直接进行序列测定， 测定结果表明， 在具有双肌性状的皮南牛种群和皮埃 蒙特牛中只有第三外显子具有 G938A 单碱基多态， 所以以 myostatin 基因第三外显子的突 变型为模板设计一对引物 M， 再以野生型为模板设计一对引物 W， 错配引物的 3 端被设计 在突变位点上， 引物 MF 和 MR 及 WF 和 WR 所对应的产物长度分别为 185bp 和 122bp。同时 MR 和 WF 组合也能产生特异的扩增产物， 该产物可以作为 PCR 反应的内标， 其产物长度为 262bp。将该扩增产物直接进行 1.2琼脂糖凝胶电泳检。
19、测， 检测结果每一个泳道均可检测 到 262bp 产物条带， 对于突变纯合个体可以检测到 185bp 和 262bp 两条产物带， 对于野生纯 合个体可以检测到 122bp 和 262bp 两条产物带， 对于杂合个体可以检测到 122bp、 185bp 和 262bp 两条产物带， 所以， 对本扩增产物只进行琼脂糖凝胶电泳既可以得到对被检测个体基 因型的准确判断， 引物序列及相关信息见表 2。 0025 对测序个体的 PCR 扩增结果与测序结果完全符合， 说明所设计的引物可以用于对 具有该多态的遗传种群进行相应的检测分析。 0026 应用本发明引物建立的牛 myostatin 基因第三外显子多。
20、态性检测方法， 包括样品 采集、 基因组 DNA 制备、 PCR 扩增和凝胶电泳四个环节。针对样品采集， 既可以采集精液， 又 可以采集血液和毛囊等组织样， 而且仅需微量组织样便可以获得适合PCR扩增的DNA。 在基 因组DNA制备这个环节， 本发明采用Proteinase K裂解法制备毛囊基因组DNA， 该环节仅需 要一个小时， 与传统的酚仿抽提法相比， 该方法操作简单、 成本低廉、 所需时间短。 本发明结 合了双引物 PCR 技术和错配 PCR 技术， 仅需要一次 PCR 反应和琼脂糖检测就能判定被检测 个体的基因型。本发明同时参考了两温度梯度 PCR 技术， 通过改变传统 PCR 的技术。
21、参数， 而 实现 50 分钟左右完成 PCR 扩增。 0027 此外， 本发明所用的试剂可以是国产试剂， 检测仪器也可以是常规仪器。 0028 本发明提供了一种成本低廉、 操作简单、 快速、 准确并适合推广的针对牛 myostatin 基因第三外显子多态性的检测方法， 对利用 myostatin 的多态性进行肉牛的标 记辅助选择有着重要意义。 附图说明 0029 图 1 为针对南阳牛、 皮埃蒙特牛、 皮南肉牛、 荷斯坦牛 4 个品种 16 个测序个体的检 测结果。其中 ck、 w、 m 分别为阴性对照、 野生型对照和突变杂合子对照， M 为分子量标记， 14为荷斯坦牛检测结果， 均为野生纯合性。
22、， 58为皮南牛个体， 5号泳道为杂合子个体， 其他为突变纯合子个体， 9 12 为皮埃蒙特牛个体， 均为突变纯合子个体， 13 16 南阳牛 个体均为野生纯合子个体。此检测结果与测序结果完全相符 ； 0030 图 2 为针对皮南牛群体 13 个个体的检测结果。其中， 1、 2 分别为突变纯合型和杂 说 明 书 CN 101724700 B 4/6 页 6 合型个体对照， 泳道3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 13、 14、 15均为杂合子个体， 而11、 12为野生型纯合 子， 本次检测没有发现突变纯合子个体。16 为阴性对照 ； M 为 Marker 由广州东盛生物科技 有。
23、限公司提供， 从下至上的条带依次为 100bp、 200bp、 300bp、 400bp、 500bp 和 600bp ； 三条目 标电泳条带由下至上分别为 122bp、 185bp 和 262bp。 具体实施方式 0031 下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解， 这些实施例仅用于说明 本发明， 而不能限制本发明的保护范围。 0032 实施例 1myostatin 基因第三外显子 SNP 位点的检测 0033 材料与方法 0034 1、 样品采集 0035 本例采用皮埃蒙特牛和南阳牛杂交后代皮南牛作为研究对象， 用于群体 SNPs 检 测。另外， 选择了三个具有典型代表性的品种 ：。
24、 南阳牛、 皮埃蒙特牛和荷斯坦牛用于筛选 SNPs。 其中， 皮南牛和南阳牛的样品采自河南省南阳地区新野县牛场 ； 皮埃蒙特牛和荷斯坦 牛的样品采自中国农业科学院畜牧研究所昌平养殖场。所有试验样品均为毛囊， 采集后冰 箱冷冻保存， 各样品详细的检测内容见表 1。 0036 表 1 ： 实验动物样品来源及用途 0037 0038 2、 Proteinase K 裂解法制备毛囊基因组 DNA 0039 将 Proteinase-K(20mg/mL) 稀释至 2g/L ： 取 10L Proteinase K(20mg/L)， 加 90LddH2O。 0040 配制 1mL Proteinase-K。
25、 裂解液 ： 取 100L 10PCR buffer， 加 20LMgCl2(25mM)， 加 10L 蛋白酶 K(2mg/mL)， 加 870L ddH2O。 0041 制备步骤如下 ： 将 4 根带有毛囊的毛发置于 0.5ml 离心管底部， 加入 20l 配制 现成的 Proteinase K 裂解液。在 PCR 仪上设置一个单循环程序 ： 65 30min， 95 15min， 4 10min。程序结束后， 进行瞬时离心， 立即进行 PCR 扩增或 -20长期保存备用。 0042 3、 PCR 0043 3.1 引物的设计 0044 表 2 列出了本发明所涉及的引物， 以及引物的序列、 。
26、长度、 退火温度以及特异性扩 增产物的长度。其中 MF 和 WR 在双重 PCR 扩增过程中也可以得到特异扩增产物， 这就是本 发明的关键所在 ： 及不用另行设内标， 内标在双重引物的设计过程中就已隐含在其中， 引物 由上海英骏生物技术有限公司合成。 0045 表 2 引物 M、 W 序列及相关信息 说 明 书 CN 101724700 B 5/6 页 7 0046 0047 注 ： F 代表上游引物， R 代表下游引物。内标引物扩增产物长度为 262bp。 0048 3.2PCR 反应体系 0049 经过优化， 本发明采用 20l 反应体系， 各反应成分的组成如下 ： 0050 表 3PCR。
27、 反应体系 0051 0052 本发明所用的dNTP、 Taq酶和10PCR buffer都由广州东盛生物科技有限公司提 供。 0053 3.3PCR 反应程序 ： 94， 4min 94， 5S ； 52， 5S ； 72， 5S 循环 35 次 72， 4min。 0054 4、 结果与分析 0055 采用 2琼脂糖凝胶电泳， 110V， 电泳结束后 ( 约 20min 左右 )， 凝胶成像系统进行 检测分析。M 为 Marker 由广州东盛生物科技有限公司提供， 从下至上的条带依次为 100bp、 200bp、 300bp、 400bp、 500bp 和 600bp ； 三条目标电泳条带。
28、由下至上分别为 122bp、 185bp 和 262bp ； 结果表明， 对 4 个品种 16 头测序个体的检测结果与测序结果完全相符， 所有的荷斯 坦牛和南阳牛均为野生型纯合个体， 一头皮南牛为杂合个体， 其余 4 头为突变纯合个体， 4 头皮埃蒙特牛个体均为突变纯合个体。检测结果如图 1 所示。 0056 采用上述建立起来的方法进行皮南牛群体该基因单碱基突变的检测分析， 如图 2 所示， 对 13 个皮南牛个体的检测结果表明， 电泳结果可以对被检个体进行清晰的基因型判 说 明 书 CN 101724700 B 6/6 页 8 定， 其中 1、 2 分别为突变纯合型和杂合型个体阳性对照， 泳。
29、道 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 13、 14、 15 均为杂合子个体， 而11、 12为野生型纯合子， 本次检测没有发现突变纯合子个体。 16为阴性 对照。 0057 序列表 0058 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 0059 myostatin 基因第三外显子单碱基突变的快速检测方法 0060 KHP09113606.4 0061 4 0062 PatentIn version 3.5 0063 1 0064 23 0065 DNA 0066 人工序列 0067 1 0068 gccaattact gctctggcta ata 23 0069 2 0070 21 0071 DNA 0072 人工序列 0073 2 0074 atggctggaa tcttcccgta t 21 0075 3 0076 22 0077 DNA 0078 人工序列 0079 3 0080 gatgctgtcg ttaccctcta ac 22 0081 4 0082 23 0083 DNA 0084 人工序列 0085 4 0086 cttttgcagg aatacaacgt cac 23 说 明 书 CN 101724700 B 1/1 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101724700 B 。