技术领域
本发明属于植物转基因技术领域，涉及一种获得转基因棉花的方法，具体涉及一 种以棉花茎尖为受体、通过农杆菌介导获得转基因棉花植株的新方法。
背景技术
棉花是一种重要的经济作物，在国民经济中占有重要地位。棉花转基因技术在遗 传改良方面已取得重大进展，成为生物技术在作物遗传改良中成功应用的范例。目前， 转基因植物的遗传转化方法以农杆菌介导转化法应用最为广泛。由农杆菌介导基因转 化技术具有不受季节限制、目的基因多为单拷贝或低拷贝、插入边界多为T-DNA左右 边界，重排率低、容易排除冗余的质粒DNA序列、容易获得无选择标记的转基因植 株等优点而倍受青睐。自从1987年Umbeck等首次报道了通过农杆菌介导法将NPT II 基因导入棉花，1994年陈志贤等也利用此法获得导入2，4-D抗性基因的陆地棉植株， 随之Bt基因、CPTI基因也相继导入棉花，这种由农杆菌介导基因转化技术迅速发展 起来。
根据棉花遗传转化受体的类型，棉花以农杆菌介导的细胞核遗传转化主要技术体 系有：以胚性愈伤组织为受体的转化体系、以下胚轴为受体的转化体系、以茎尖分生 组织为受体的转化体系。以胚性愈伤组织和下胚轴为受体的两种转化体系都必须要经 过体细胞胚胎发生和植株再生，由于在诱导愈伤组织过程中要经过分化、再分化过程， 能产生很多遗传变异和体细胞变异，植株再生困难，转化周期长，目前报道最短的植 株再生所用的时间在五个月以上；基因型对棉花体细胞胚胎发生和植株再生具有决定 性作用，同一棉属不同棉种之间、同一棉种不同品种之间体细胞胚胎发生和植株再生 的能力不同，只有少数品种离体培养的材料可以诱导出胚性愈伤组织，限制了遗传转 化的品种范围。
以茎尖分生组织为受体的农杆菌转化法不经过脱分化、再分化过程，遗传变异和 体细胞变异程度低；受棉花基因型限制的影响较小，许多未能实现体细胞胚胎发生和 植株再生的棉花品种也可以成功进行遗传转化。自从Renfroe等报道利用棉花茎尖分 生组织获得再生植株以来，国内外很多学者都利用茎尖或茎尖分生组织获得了转基因 再生植株。但通常转化率低，且由于不定芽起源于多细胞，嵌合体比较多等因素的限 制影响再生苗的获得。
发明内容
本发明的目的是提供一种获得转基因棉花的方法。
本发明提供的获得转基因棉花的方法，包括如下步骤：
(1)切除棉花子叶苗的子叶、叶柄和部分下胚轴，下胚轴保留0.8-3cm的长度(可 为0.8-2cm，如0.8-1.5cm，1.5-2cm)，得到待侵染组织；然后25-30℃(如25-28℃， 28-30℃)、相对湿度40％-60％(如40％-50％，50％-60％)、暗培养2-3天(如2-2.5天， 2.5-3天)；所述子叶苗为子叶半展开、下胚轴伸长至4-6cm(如4-5cm，5-6cm)的无 菌苗；
(2)将暗培养后的待侵染组织双面划伤，划伤范围为从茎尖顶部至下胚轴基部， 伤口深0.8-1.2mm(如0.8-1mm，1-1.2mm)；
(3)将划伤的待侵染组织在溶液A中浸染15-45分钟(如15-30分钟，30-35分 钟)；所述溶液A中含有携带外源基因的重组农杆菌；
(4)侵染完成后共培养2-4天(如2-3天，3-4天)，然后进行抗性筛选，得到抗 性棉花苗；
(5)将抗性棉花苗嫁接在棉花砧木上，得到转基因棉花。
相对湿度，表示空气中的绝对湿度与同温度下的饱和绝对湿度的比值，得数 是一个百分比(也就是指在一定时间内，某处空气中所含水汽量与该气温下饱和水 汽量的百分比)。
步骤(3)中，所述溶液A的pH为5.3-5.8(如5.3-5.6，5.6-5.8)，由溶质和水组 成；所述溶液A的溶质及其浓度如下：乙酰丁香酮40-120μl·L-1(如40-80μl·L-1， 80-120μl·L-1)，2-N-吗啉乙烷磺酸(MES)65-85mM(如65-75mM，75-85mM)、葡萄 糖2-3％(w/w，质量百分含量)(如2-2.5％，2.5-3％)、激动素(KT)0.08-0.12mg·L-1(如0.08-0.1mg·L-1，0.1-0.12mg·L-1)、含有外源基因的重组农杆菌OD600＝0.6-0.8。
步骤(4)中，所述抗性筛选可在筛选培养基上进行。所述筛选培养基具体可由 MS基本培养液、琼脂、甘氨酸、激动素(KT)、卡那霉素(Kan)和头孢霉素(Cef) 组成；筛选培养基中，琼脂的终浓度为7.5g·L-1，甘氨酸的终浓度为2mg·L-1，激动素 的终浓度为0.1mg·L-1，卡那霉素的终浓度为50-100mg·L-1(如50-75mg·L-1， 75-100mg·L-1)，头孢霉素的终浓度为250-500mg·L-1(如250-375mg·L-1，375-500mg·L-1)。
步骤(4)中，所述共培养可在共培养基上进行。所述共培养基具体可由MS基本 培养液、琼脂、甘氨酸和激动素组成；共培养基中，琼脂的终浓度为7.5g·L-1，甘氨酸 的终浓度为2mg·L-1，激动素的终浓度为0.1mg·L-1。
所述MS基本培养液的溶剂是水、具体溶质可如表1所示。
表1 MS基本培养液的溶质
大量元素 培养基中浓度(g·L-1) NH4NO3 1.65 KNO3 1.9 KH2PO4 0.17 MgSO4·7H2O 0.37 CaCl2 0.44 微量元素 培养基中浓度(mg·L-1) FeSO4·7H2O 27.8 Na2EDTA 37.3 MnSO4·4H2O 22.3 ZnSO4·4H2O 8.6 H3BO3 6.2 KI 0.83 Na2MoO4·2H2O 0.25 CuSO4·5H2O 0.025 CoCl2·6H2O 0.025 有机成分 培养基中浓度(mg·L-1) 甘氨酸 2.0 盐酸硫胺素 0.1 盐酸吡哆素 0.5 烟酸VB5 0.5 肌醇 100
所述外源基因具体可为抗虫基因Cry2A*、AGP启动子或GFP基因；所述抗虫基 因Cry2A*的核苷酸序列如序列表的序列1所示；所述AGP启动子的核苷酸序列如序 列表的序列2所示；所述GFP基因的核苷酸序列如序列表的序列3所示。
所述重组农杆菌可为用携带所述外源基因的重组质粒转化农杆菌得到的重组农杆 菌。所述重组农杆菌具体可为如下(a)或(b)或(c)：
(a)用重组质粒pTiBO542转化农杆菌EHA105得到重组农杆菌；
(b)用重组质粒pBIαGUS转化农杆菌EHA105得到重组农杆菌；所述重组质粒 pBIαGUS是将pBI121的HindIII和Xba I酶切识别位点之间的小片段取代为序列2所 示的DNA得到的重组质粒；
(c)用重组质粒pBIαGFP转化农杆菌LBA4404得到重组农杆菌；所述重组质粒 pBIαGFP是将pBIαGUS的Xba I和Sac I酶切识别位点之间的小片段取代为序列3所 示的DNA得到的重组质粒。
所述棉花具体可为棉花品种冀丰197或棉花品种鄂抗棉12。
以上任一所述方法在可应用于棉花育种。
本发明针对目前棉花遗传转化中植株再生困难、遗传变异率高、基因型限制性强 和转化周期长，提出一种以棉花茎尖为受体通过农杆菌介导棉花遗传转化的新方法。 该方法通过调整茎尖生长状态、确定农杆菌转化的茎尖侵染合适深度、加入乙酰丁香 酮并调整适宜的pH值，提高转化效率。利用本发明的方法可以快速获得转基因植株 且具有较高的转基因效率。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1、应用本发明的方法获得转基因棉花
一、重组农杆菌的获得
重组质粒pTiBO542：中国农业大学保证向公众提供；参考文献：重组质粒详细构 建过程见Chen H等(2005)论文“Transgenic indica rice plants harboring a synthetic cry2A* gene of Bacillus thuringiensis exhibit enhanced resistance against lepidopteran rice pests.”中第1131至1132页；该重组质粒中携带序列表的序列1所示的抗虫基因Cry2A*。
农杆菌EHA105：中国农业大学保证向公众提供；参考文献：Torregrosa L.，et.al. Influence of Agrobacterium Strain，Culture Medium，and Cultivar on the Transformation Efficiency of Vitis vinifera L.Am.J.Enol.Vitic，53，3：183-190。
用重组质粒pTiBO542转化农杆菌EHA105，得到重组农杆菌。
二、转基因棉花的获得
鄂抗棉12：湖北省种子集团公司，是湖北省农作物品种审定委员会审定品种，品 种审定编号为鄂审棉2005010。
(一)子叶苗的获得
1、棉花种子脱绒
50g棉花(鄂抗棉12)种子加15ml左右浓硫酸，快速搅动2-3min，然后石灰水 中和，不断搓洗，流水冲洗10-12min，获得干净的脱绒种子。
2、将脱绒种子经20％(体积百分含量)双氧水溶液消毒并在摇床上以130转/分 摇动5小时，然后用灭菌水清洗种子5-6遍，最后加入150ml灭菌水，放在28℃环境 下培养24小时，获得萌发种子。
3、将萌发种子在无菌环境下将种壳剥下，将去种壳的棉花种胚种植在发芽培养基 上，黑暗培养，温度28℃；获得子叶半展开、下胚轴伸长至4cm的子叶苗。
(二)转基因棉花的获得
1、相关溶液和培养基的配方
溶液A：由溶质和水组成，pH5.3；溶质及其浓度如下：乙酰丁香酮40μl/L、2-N- 吗啉乙烷磺酸65mM、葡萄糖2％(w/w，质量百分含量)、激动素0.08mg·L-1、步骤 一的重组农杆菌OD600＝0.6-0.8。
共培养基由MS基本培养液、琼脂、甘氨酸和激动素组成；MS基本培养液的溶 剂是水、溶质如表1所示；共培养基中，琼脂的终浓度为7.5g·L-1，甘氨酸的终浓度为 2mg·L-1，激动素的终浓度为0.1mg·L-1。
筛选培养基由MS基本培养液、琼脂、甘氨酸、激动素(KT)、卡那霉素(Kan) 和头孢霉素(Cef)组成；MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示；筛选培养基中， 琼脂的终浓度为7.5g·L-1，甘氨酸的终浓度为2mg·L-1，激动素的终浓度为0.1mg·L-1， 卡那霉素的终浓度为50mg·L-1，头孢霉素的终浓度为250mg·L-1。
2、转基因棉花的获得
(1)培养子叶苗，去除子叶、叶柄和部分下胚轴，保留下胚轴0.8cm左右；25℃、 相对湿度40％、暗培养2天(茎尖伸长变直)。
(2)用尖锐带1mm弯钩的解剖针将茎尖双面划伤，划伤范围从茎尖的顶部到下 胚轴基部，划出深0.8mm左右的伤口，获得划伤茎尖。
(3)将划伤的茎尖在溶液A中浸染15分钟；用灭菌滤纸吸干茎尖表面菌液，再 将茎尖放置在共培养基上培养2天，获得共培养的侵染茎尖。
(4)将侵染茎尖转移到筛选培养基上，筛选3次，每约四周更换一次新鲜的筛选 培养基，获得抗性棉花幼苗。
(5)将抗性幼苗嫁接在棉花砧木上，获得再生植株(数目为N)。
(三)计算转化效率
整个步骤二约3个月时间，将步骤2的(5)得到的再生植株(数目为N)进行PCR 验证，获得转基因植株(数目为n)。转化效率＝n/N×100％。
PCR验证所用的引物如下：
5′-CTCGCTCGTGTCAATGCT-3′；5′-CTCTGGGTTTGCTGTGGG-3′。
转化效率达到6.2％。
实施例2、应用本发明的方法获得转基因棉花
一、重组农杆菌的获得
1、合成序列表的序列2所示的种子特异表达启动子AGP。
2、重组质粒(pBIαGUS)的获得
①用限制性内切酶HindIII和Xba I双酶切pBI121(北京拜尔迪生物技术有限公司， 产品货号：MP-091)，回收大片段；
②用限制性内切酶HindIII和Xba I双酶切步骤1的种子特异表达启动子AGP，回 收酶切产物；
③将步骤①回收的大片段和步骤②回收的酶切产物连接，得到重组质粒pBIαGUS (用序列2所示的种子特异表达启动子AGP取代了pBI121中的组成型表达启动子 CaMV35S)。重组质粒pBIαGUS中，GUS基因为种子特异表达。
3、重组农杆菌的获得
用重组质粒pBIαGUS转化农杆菌EHA105，得到重组农杆菌。
二、转基因棉花的获得
冀丰197：购自河北冀丰种业有限公司，为河北省农作物品种审定委员会审定品种， 品种审定编号为冀审棉2004007号。
(一)子叶苗的获得
1、棉花种子脱绒
50g棉花(冀丰197)种子加15ml左右浓硫酸，快速搅动2-3min，然后石灰水中 和，不断搓洗，流水冲洗10-12min，获得干净的脱绒种子。
2、将脱绒种子经20％(体积百分含量)双氧水溶液消毒并在摇床上以130转/分 摇动5小时，然后用灭菌水清洗种子5-6遍，最后加入150ml灭菌水，放在28℃环境 下培养24小时，获得萌发种子。
3、将萌发种子在无菌环境下将种壳剥下，将去种壳的棉花种胚种植在发芽培养基 上，黑暗培养，温度28℃；获得子叶半展开、下胚轴伸长至5cm的子叶苗。
(二)转基因棉花的获得
1、相关溶液和培养基的配方
溶液A：由溶质和水组成，pH5.6；溶质及其浓度如下：乙酰丁香酮80μl·L-1、2-N- 吗啉乙烷磺酸75mM、葡萄糖2.5％(w/w，质量百分含量)、激动素0.1mg·L-1、步骤 一的重组农杆菌OD600＝0.6-0.8。
共培养基由MS基本培养液、琼脂、甘氨酸和激动素组成；MS基本培养液的溶 剂是水、溶质如表1所示；共培养基中，琼脂的终浓度为7.5g·L-1，甘氨酸的终浓度为 2mg·L-1，激动素的终浓度为0.1mg·L-1。
筛选培养基由MS基本培养液、琼脂、甘氨酸、激动素、卡那霉素和头孢霉素组 成；MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示；筛选培养基中，琼脂的终浓度为 7.5g·L-1，甘氨酸的终浓度为2mg·L-1，激动素的终浓度为0.1mg·L-1，卡那霉素的终浓 度为75mg·L-1，头孢霉素的终浓度为375mg·L-1。
2、转基因棉花的获得
(1)培养子叶苗，去除子叶、叶柄和部分下胚轴，保留下胚轴1.5cm左右；28℃、 相对湿度50％、暗培养2.5天(茎尖伸长变直)。
(2)用尖锐带1mm弯钩的解剖针将茎尖双面划伤，划伤范围从茎尖的顶部到下 胚轴基部，划出深1mm左右的伤口，获得划伤茎尖。
(3)将划伤的茎尖在溶液A中浸染30分钟；用灭菌滤纸吸干茎尖表面菌液，再 将茎尖放置在共培养基上培养3天，获得共培养的侵染茎尖。
(4)将侵染茎尖转移到筛选培养基上，筛选3次，每约四周更换一次新鲜的筛选 培养基，获得抗性棉花幼苗。
(5)将抗性幼苗嫁接在棉花砧木上，获得再生植株(数目为N)。
(三)计算转化效率
整个步骤二约3个月时间，将步骤2的(5)得到的再生植株进行PCR验证，获 得转基因植株(数目为n)。转化效率＝n/N×100％。PCR验证所用的引物如下： 5′-TCGGCTATGACTGGGCACAACAGA-3′；5′-AAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCG-3′。
将转基因植株进行GUS染色，均显示阳性。
转化效率达到5.9％。
实施例3、应用本发明的方法获得转基因棉花
一、重组农杆菌的获得
1、合成序列3所示的GFP基因。
2、重组质粒(pBIαGFP)的获得
①用限制性内切酶Xba I和Sac I双酶切实施例2的步骤二的2得到的pBIαGUS， 回收大片段；
②用限制性内切酶Xba I和Sac I双酶切步骤1的GFP基因，回收酶切产物；
③将步骤①回收的大片段和步骤②回收的酶切产物连接，得到重组质粒pBIαGFP (用序列3所示的GFP基因取代了pBIαGUS中的GUS基因)。
3、重组农杆菌的获得
农杆菌LBA4404：中国农业大学保证向公众提供；参考文献：Torregrosa L.，et.al. Influence of Agrobacterium Strain，Culture Medium，and Cultivar on the Transformation Efficiency of Vitis vinifera L.Am.J.Enol.Vitic，53，3：183-190。
用重组质粒pBIαGFP转化农杆菌LBA4404，得到重组农杆菌。
二、转基因棉花的获得
冀丰197：购自河北冀丰种业有限公司，为河北省农作物品种审定委员会审定品种， 品种审定编号为冀审棉2004007号。
(一)子叶苗的获得
1、棉花种子脱绒
50g棉花(冀丰197)种子加15ml左右浓硫酸，快速搅动2-3min，然后石灰水中 和，不断搓洗，流水冲洗10-12min，获得干净的脱绒种子。
2、将脱绒种子经20％(体积百分含量)双氧水溶液消毒并在摇床上以130转/分 摇动5小时，然后用灭菌水清洗种子5-6遍，最后加入150ml灭菌水，放在28℃环境 下培养24小时，获得萌发种子。
3、将萌发种子在无菌环境下将种壳剥下，将去种壳的棉花种胚种植在发芽培养基 上，黑暗培养，温度28℃；获得子叶半展开、下胚轴伸长至6cm的子叶苗。
(二)转基因棉花的获得
溶液A：由溶质和水组成，pH5.8；溶质及其浓度如下：乙酰丁香酮120μl/L、2-N- 吗啉乙烷磺酸85mM、葡萄糖3％(w/w，质量百分含量)、激动素0.12mg·L-1、步骤 一的重组农杆菌OD600＝0.6-0.8。
共培养基由MS基本培养液、琼脂、甘氨酸和激动素组成；MS基本培养液的溶 剂是水、溶质如表1所示；共培养基中，琼脂的终浓度为7.5g·L-1，甘氨酸的终浓度为 2mg·L-1，激动素的终浓度为0.1mg·L-1。
筛选培养基由MS基本培养液、琼脂、甘氨酸、激动素、卡那霉素和头孢霉素组 成；MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示；筛选培养基中，琼脂的终浓度为 7.5g·L-1，甘氨酸的终浓度为2mg·L-1，激动素的终浓度为0.1mg·L-1，卡那霉素的终浓 度为100mg·L-1，头孢霉素的终浓度为500mg·L-1。
(1)培养子叶苗，去除子叶、叶柄和部分下胚轴，保留下胚轴2cm左右；30℃、 相对湿度60％、暗培养3天(茎尖伸长变直)。
(2)用尖锐带1mm弯钩的解剖针将茎尖双面划伤，划伤范围从茎尖的顶部到下 胚轴基部，划出深1.2mm左右的伤口，获得划伤茎尖。
(3)将划伤的茎尖在溶液A中浸染45分钟；用灭菌滤纸吸干茎尖表面菌液，再 将茎尖放置在共培养基上培养4天，获得共培养的侵染茎尖。
(4)将侵染茎尖转移到筛选培养基上，筛选3次，每约四周更换一次新鲜的筛选 培养基，获得抗性棉花幼苗。
(5)将抗性幼苗嫁接在棉花砧木上，获得再生植株(数目为N)。
(三)计算转化效率
整个步骤二约3个月时间，将步骤2的(5)得到的再生植株进行PCR验证，获 得转基因植株(数目为n)。转化效率＝n/N×100％。PCR验证所用的引物如下： 5′-TCGGCTATGACTGGGCACAACAGA-3′；5′-AAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCG-3′。
将转基因植株进行GFP荧光检测，均显示阳性。
转化效率达到5.3％。
序列表
<110>中国农业大学
<120>一种获得转基因棉花的方法
<130>CCGNARY102282
<160>3
<210>1
<211>2343
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
cggatccaga ctcactctga gcgtcgtcac acgcagcttg tgcgggatat catttgcctg 60
taaccggttt ccttaaagcg aaaacccccc cacccaaagg taaggctatg aacaacgtgc 120
tgaacagcgg caggaccacc atctgcgacg cctacaatgt cgtggcccac gaccccttca 180
gcttcgagca caagagcctg gatacgatcc agaaggaatg gatggagtgg aagcgcacgg 240
accacagcct ctacgtcgcc ccagtggtcg gcactgtgtc gagcttcctg ctgaagaagg 300
tgggtagcct catcggcaag cgcatcctgt ccgagctctg gggcatcatc ttccccagcg 360
gtagcaccaa cctgatgcag gatatcctgc gcgagaccga acagttcctg aaccagcgcc 420
tgaacactga caccctcgct cgtgtcaatg ctgacctgat cggcctgcag gccaacatca 480
gggagttcaa tcaacaggtg gacaacttcc tcaaccccac ccagaaccca gtgccgagct 540
ccatcacgag ctccgtgaac accatgcagc agctgttcct gaatcgcctc ccgcagttcc 600
agatccaagg ctaccagctc ttgctgctgc ccctcttcgc tcaggcggcc aacatgcacc 660
tgagcttcat ccgcgacgtg atcctgaacg ctgacgagtg gggtatctcc gccgccaccc 720
tcaggaccta ccgcgattac ctgcgcaact acacccgtga ctattccaac tactgcatca 780
acacctacca gaccgccttc aggggcctca acacccgcct gcacgacatg cttgagttcc 840
gcacatacat gttcctgaac gtgttcgaat acgtctccat ctggagcctc ttcaagtacc 900
agagcctgat ggtgagctcc ggcgctaacc tctacgccag cggttccggc ccacagcaaa 960
cccagagctt caccgcccag aactggccct tcctctacag cctgttccaa gtgaatagca 1020
actacatcct gtccggcatc tccggtacca ggctgtcgat caccttcccc aacatcggcg 1080
gtctgccagg cagcacgacc actcactccc tgaacagcgc cagggtgaac tacagcggcg 1140
gtgtgagcag cggtctcatc ggcgccacca atctcaacca caacttcaac tgcagcaccg 1200
tgctgccacc cctgtccacc cccttcgttc gcagctggct ggacagcggc accgataggg 1260
agggcgtggc taccagcacc aactggcaga ccgaatcctt ccagaccact ctgagcctca 1320
ggtgcggtgc cttcagcgcc cgcggcaata gcaactactt ccccgactac ttcatccgca 1380
acattagcgg cgtcccactc gtgatccgca acgaggacct gaccaggccc ctccactaca 1440
accaaatccg caacatcgag tcccccagcg gcagcccagg tggcgctagg gcctacctgg 1500
tgagcgtgca caaccgcaag aacaatatct acgccgctaa cgagaacggc accatgatcc 1560
atctggcccc cgaagactac accggcttca ccatcagccc aatccacgcc acgcaggtga 1620
acaatcaaac ccgcactttc atcagcgaga agttcggcaa ccagggcgac agcctgaggt 1680
tcgagcagag caacaccaca gcccgctaca ccctgcgtgg caatggtaac tcctacaacc 1740
tctacctgag ggtcagcagc atcggcaaca gcaccatccg cgtgaccatt aacggccgtg 1800
tgtacaccgt gagcaacgtg aacaccacta cgaacaacga cggtgtcaac gataacggcg 1860
ctcgcttctc cgacatcaac atcggtaata tcgtggccag cgataacacc aacgtcaccc 1920
tggacatcaa cgtgaccctc aactccggca cccccttcga cctgatgaac atcatgttcg 1980
tgcccaccaa cctgccgcca ctctactaat gacgaattcc cgatctagta acatagatga 2040
caccgcgcgc gataatttat cctagtttgc gcgctatatt ttgttttcta tcgcgtatta 2100
aatgtataat tgcgggactc taatcataaa aacccatctc ataaataacg tcatgcacct 2160
gaatagatct tggacaagcg ttaggcctat ctgtgcatta catgttaatt attacatgct 2220
taacgtaatt caacagaaat tatatgataa tcatcgcaag accggcaaca ggattcaatc 2280
ttaagaaact ttattgccaa atgtttgaac gatcggggaa attcgagctc ggatccaagc 2340
ttc 2343
<210>2
<211>1163
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
cccaagcttc tattttcatc ctatttagaa atccaagttg acacctaaaa tttagttgga 60
ctgccatgta ggattatcgt tagagagata acggagctta acggtagagt gatcactttg 120
taacaaaata ataacaaaag tgactaaagt gtaacatttc aaacataaat gattaaaata 180
taacctgagg caaacaaaaa tgactatttt tatagattac cctaaaatta aagagtcatg 240
gccctagccc ctcgcctact tgtttgtttt taataaacta acatagtata atatattgtt 300
aggattatat aaaattatta ataaatagta taattaattt aaaatttatg aaaaaataaa 360
ctaccatatt tcttaatacg tggcacctta tgttagattg gactgtataa cttatatact 420
attatctata ttgaatccaa atccttgctt ttaagcgttt ttagtgaaac attttatttt 480
ccattcttat tatataaatt tatataatga tataatatgt aatacttaga taatattatt 540
gaaaaagaat aaaaatacct caaactttga aaggactaat ttgtatgagc atcaaacgta 600
caggatacca aaagtataca tatctgaatt tgttcatatc tcctgcaact catagatcat 660
caccatgcac agcaacatgt gtacacttga cttgtcctcc atcaactcaa cccttaactc 720
agtgaatcgg gacatctctg tctcacttta aaacccttcc cagtttcaac actctttgaa 780
ttcaactgag ttcacataca acacaacacg gtccatcatc tttctgctgt taaagcatca 840
tcatttcgcc ccttccagtt acagatgcaa ccatgaaccc ccctgcaaca aagtttgtcc 900
gaaccttgct cgtaccatgt gaagggatgt ggcatctcga tatctaccca ccactataca 960
aaaaaaaaaa aaaagagaca atatttcgtc ttctttaatt tgcacactcg tcatcttgca 1020
tgtcaatgtc ttcaacacgt tgatgaagat ttgcatgcaa aaatatcacc ttccacagct 1080
ccaccttcta taaatacatt accactcttt gctattacca tcacacagta acaaaataca 1140
gagcttatcg taatctctag agc 1163
<210>3
<211>732
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
gctctagaat gagtaaagga gaagaacttt tcactggagt tgtcccaatt cttgttgaat 60
tagatggtga tgttaatggg cacaaatttt ctgtcagtgg agagggtgaa ggtgatgcaa 120
catacggaaa acttaccctt aaatttattt gcactactgg aaaactacct gttccatggc 180
caacacttgt cactactttc ggttatggtg ttcaatgctt tgcgagatac ccagatcata 240
tgaaacagca tgactttttc aagagtgcca tgcctgaagg ttatgtacag gaaagaacta 300
tatttttcaa agatgacggg aactacaaga cacgtgctga agtcaagttt gaaggtgata 360
cccttgttaa tagaatcgag ttaaaaggta ttgattttaa agaagatgga aacattcttg 420
gacacaaatt ggaatacaac tataactcac acaatgtata catcatggca gacaaacaaa 480
agaatggaat caaagttaac ttcaaaatta gacacaacat tgaagatgga agcgttcaac 540
tagcagacca ttatcaacaa aatactccaa ttggcgatgg ccctgtcctt ttaccagaca 600
accattacct gtccacacaa tctgcccttt cgaaagatcc caacgaaaag agagaccaca 660
tggtccttct tgagtttgta acagctgctg ggattacaca tggcatggat gaactataca 720
aataagagct cg 732