技术领域
本发明涉及一种多重荧光PCR技术和毛细管电泳技术。同时检测6个单核苷酸重复微卫星位点以及Braf V600E、UGT1A1*6、UGT1A1*28位点的多态性，为结直肠癌等癌症患者的诊断及个性化用药提供参考，属于生物医学领域中的临床分子诊断检测技术。
背景技术
微卫星序列是指核心序列为1～6个碱基的短串联重复结构，这些重复序列分布在整个人类基因组中。在DNA复制时插入或缺失突变引起的微卫星序列长度改变的现象被称之为微卫星不稳定(Microsatellite Instability，MSI)。
微卫星不稳定是由错配修复(mismatch repair，MMR)基因缺陷造成。人类错配修复基因主要有MLH1、MSH2、PMS2、MSH6等。错配修复基因的功能是纠正DNA复制过程中出现的错误，确保复制过程的准确性。当错配修复基因突变、缺失或表观沉默而失去功能时，错配修复系统功能发生异常(MMR deficient，dMMR)，微卫星中重复核苷酸的数量可增多或减少，导致微卫星长度发生改变，由此产生MSI现象。
微卫星不稳定(MSI)现象在很多实体瘤中都存在。MSI发生率最高的肿瘤类型包括子宫内膜癌(22-33％)、胃癌(22％)、结直肠癌(10-15％)、甲状腺癌(63％)、皮脂癌(35-60％)，在肝癌、黑色素瘤卵巢癌、壶腹癌、宫颈癌、食管腺癌、软组织瘤、头颈癌、肾癌等中发生率也有一定比例(2-10％)。其中对结直肠癌MSI的研究开展最早、最为深入，而且很多MSI相关理论和应用已经得到广泛认可，被NCCN指南、ASCO指南等推荐应用于临床。
结直肠癌(Colorectal Cancer，CRC)是常见的消化道恶性肿瘤，病发部位为直肠及直肠与乙状结肠交界处。我国结直肠癌发病率占肿瘤发病率的第3位，仅次于肺癌和胃癌，且我国结直肠癌的中位发病年龄比欧美提前约10年，青年患者比欧美多见。
结直肠癌的发生分遗传性和非遗传性两类，遗传因素引起的结直肠癌包括家族性大肠腺瘤息肉病(Familial Adenomatous Polyposis，FAP)和遗传性非息肉病性结直肠癌(Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer，HNPCC，又称Lynch综合征)，非遗传性结直肠癌即散发性结直肠癌。研究发现FAP、Lynch综合征以及散发性结直肠癌的发生、发展的分子生物学途径不同。传统上按分子途径将结直肠癌分为两大类：染色体不稳定型(CIN)和微卫星不稳定型(MSI)。约80-85％的结直肠癌与染色体不稳定(CIN)有关，包括FAP和部分散发性结直肠癌。CIN结直肠癌是由于染色体局灶等位基因失衡、染色体扩增或异位等原因造成的。绝大多数CIN结直肠癌存在APC基因突变和染色体18q缺失，并有较高比例KRAS和p53基因突变，好发于左半结肠，组织学类型以高、中分化为主；约15-20％的结直肠癌存在微卫星不稳定(MSI)，包括Lynch综合征和部分散发性结直肠癌。MSI结直肠癌是由于DNA修复系统功能丧失导致的基因组水平突变增加，包括由碱基对替换、移码突变和短串联重复核苷酸序列的改变等，最终引发癌症。MSI结直肠癌多见于右半结肠，组织学类型以黏液腺癌和低分化腺癌为主。
MSI结直肠癌不仅在易发部位、组织形态上与CIN结直肠癌存在差异，而且在临床预后、治疗、遗传性筛查方案上也有所不同。因此对MSI结直肠癌的检测在临床上有重大意义。
目前已有大量证据表明，dMMR/MSI-H是II期结直肠癌患者预后良好的一个标志物，对于具有dMMR/MSI-H肿瘤的II期结直肠癌患者，3/4级分化(低分化)不再认为是高危因素。
早期结直肠癌通常通过手术切除和药物辅助化疗，转移性的晚期结直肠癌通常通过药物化疗。常用药物有5-氟尿嘧啶(5-FU)、伊立替康(CPT-11)等。
对于具有dMMR/MSI-H的II期结直肠癌患者，给予5-FU辅助化疗不能带来生存获益，反而会对患者不利。因此，II期CRC患者是否需要辅助化疗，需要综合考虑临床高危因素和MSI状态。如果考虑氟尿嘧啶类单药治疗，应进行MMR/MSI检测。对于具有dMMR/MSI-H的II期患者，不应给予氟尿嘧啶类单药辅助治疗。
伊立替康有较强的抗肿瘤活性，可有效治疗小细胞及非小细胞肺癌、恶性淋巴癌、胃癌、转移性结直肠癌等多种癌征。美国食品与药品管理局(FDA)批准伊立替康联合5-氟尿嘧啶作为晚期结直肠癌的一线治疗方案。但约有20％的患者在接受以伊立替康为基础的联合化疗方案时出现严重的中性粒细胞减少或腹泻。伊立替康的毒性主要是由其活性代谢产物SN-38引起。活性SN-38可通过位于肝脏的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶UGT1A1的催化作用而转变为无活性的SN-38G，进而排出体外。UGT1A1基因多态性可引起UGT1A1基因功能缺陷。UGT1A1*6、UGT1A1*28突变型中，UGT1A1基因表达下降，活性代谢产物SN-38显著增加，发生不良反应的几率显著增加，临床上需根据UGT1A1基因型检测结果慎重考虑伊立替康用药剂量。
Lynch综合征，既往亦称HNPCC，是一种常染色体显性遗传病，由于MMR基因发生胚系突变所致，约占所有CRC的3-5％。Lynch综合征最突出的特点之一是携带者本人或家族成员可发生CRC及其他多种Lynch相关肿瘤，包括子宫内膜癌、卵巢癌、泌尿系肿瘤、胃癌和小肠癌等，其中CRC和子宫内膜癌最为多见。携带者终身患CRC和子宫内膜癌的风险分别为80％和20-60％。而且携带者发生CRC或其他Lynch相关肿瘤的年龄较轻，结肠癌和子宫内膜癌平均诊断年龄分别约为45岁和46岁，显著早于普通人群。
Lynch综合征的筛选对患者本人有非常重要的意义。首先，通过积极的肠镜随访，Lynch综合征患者第二原发CRC发病率及死亡率显著降低；其次，Lynch综合征携带者发生CRC的时间显著短于散发性CRC，因此肠镜的复查频率(每1-2年一次)要显著高于散发性CRC患者；第三，可指导手术治疗方案的制定，例如对Lynch综合征患者行预防性全结肠切除或对完成生育后的妇女考虑行预防性的子宫和双附件切除。同时，Lynch综合征的筛选对患者家属成员亦非常重要。确诊Lynch综合征能够指导患者家属接受Lynch综合征相关肿瘤的筛查，降低其发病率和死亡率。同时，由于Lynch综合征携带者CRC的发病年龄显著早于普通人群，因此接受肠镜筛查的初次年龄需提前至20-25岁。
超过90％的Lynch综合征是由错配修复基因突变引起，并表现为MSI。因此MSI检测对Lynch综合征的诊断具有重要意义。2017年版NCCN结直肠癌临床指南指出，MMR或MSI检测推荐用于所有有结肠癌或直肠癌病史的病人来鉴别Lynch综合征。约10-15％的散发性结直肠癌表现为类似Lynch综合征的MMR蛋白缺失及MSI特征。与Lynch综合征不同，多数散发性结直肠癌并非是MMR体细胞突变导致，而是因MLH1基因启动子甲基化导致MLH1基因发生表观遗传学沉默所致。由此导致错配修复基因功能异常所发生的肿瘤与Lynch综合征相关结直肠癌类似。皆为MSI-H肿瘤。文献荟萃分析显示63.5％的MLH1启动子甲基化或MLH1表达缺失的结直肠癌样本存在Braf V600E突变。Braf突变极少发生在Lynch综合征相关结直肠癌中，因此检测肿瘤是否存在MLH1甲基化和Braf V600E突变时可作为区分散发性MSI-H结直肠癌与Lynch综合征的重要指标。
检测MSI结直肠癌的方法主要有检测错配修复蛋白缺陷的免疫组织化学法和基于MSI检测的PCR方法。免疫组织化学检测4种主要的错配修复蛋白MLH1、MSH2、MSH6、PMS2，通过检测错配修复蛋白缺失情况反应肿瘤的MSI状态。免疫组化的方法易受组织固定、染色条件等的影响而出现假阳性或假阴性结果，而且操作相对复杂、检测周期较长。
PCR方法通过扩增特定微卫星序列，比较正常组织与肿瘤组织微卫星序列长度的差异判断肿瘤MSI状态。美国国立癌症研究所(NCI)与1996年组织针对HNPCC的国际专题研讨会，颁布了Bethesda指南。2004年发布了该指南修订版。Bethesda指南对HNPCC及散发性结直肠癌MSI判定，推荐的检测体系包括五个位点，其中两个位点为单碱基重复，三个为双碱基重复。同时，Bethesda指南确定MSI的标准为：>30％的位点不稳定为MSI-H，10％～30％为MSI-L，<10％为MSS。这一判定标准得到大多数临床和科研工作者认可。由于双碱基重复位点多态性、峰型判定困难以及双碱基重复位点常引起MSI-L检测结果，所以很多研究者认为双碱基重复位点不适合用于检测MSI，应该使用更多的单碱基重复位点。2004年发布的修订版Bethesda指南也提到了这一问题。Suraweera等于2002年发表了一个由5个单碱基重复位点组成的检测体系。该体系经过后续修订完善，得到了很多科研工作者认可。该体系包括位点是，NR-21、NR-24、NR-27、BAT-25和BAT-26。通过与NCI推荐的Bethesda体系进行对比，全部采用单碱基重复位点的检测方法有更高的灵敏度和特异性。本公司曾提出一个检测体系(专利：肿瘤细胞微卫星不稳定状态的复合扩增体系及检测试剂盒，CN201110152226.X)，该体系检测包含8个单态性单核苷酸位点(NR-21、NR-22、NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26、MONO-27和CAT-25)。该检测体系，最小产物片段约70nt。在小于100nt的区间内，检测结果易受非特异扩增、引物多聚体、脱落荧光集团等影响。因此有必要对其方案进行修正。
发明内容
本发明的目的是提供一种与结直肠癌患者个性化用药相关基因多态性检测的复合扩增体系及其使用方法。该体系在检测样本MSI状态的同时，可通过Braf V600E、UGT1A1*6和UGT1A1*28位点的检测，进行Lynch综合征的排查及确定伊立替康等药物的合理使用剂量。此外该体系具有操作简单、特异性强、灵敏度高、通量高、可靠性强和成本低的检测特点。
本发明所述检测体系所涉及的PCR体系引物组合物，在同一PCR体系中能同时对以下6个单核苷酸重复位点进行扩增：NR-21、NR-24、NR-27、MONO-27、BAT-25、BAT-26。所述扩增位点的引物分别为：
NR-21引物：
正向引物：5’-GAGTCGCTGGCACAGTTCTA-3’
反向引物：5’-ATATTCCTACTCCGCATTCACAC-3’
NR-24引物：
正向引物：5’-TTGCTGAATTTTACCTCCTGAC-3’
反向引物：5’-ATTGTGCCATTGCATTCCAA-3’
NR-27引物：
正向引物：5’-GGAAACAAAGCATTGAAGTCTGCAGT-3’
反向引物：5’-GAGGTTCTGAGTCGATAATACTAGC-3’
BAT-25引物：
正向引物：5’-CTCGCCTCCAAGAATGTAAGT-3’
反向引物：5’-TCTGCATTTTAACTATGGCTC-3’
BAT-26引物：
正向引物：5’-GGACAGTTTGAACTGACTACTT-3’
反向引物：5’-AGCTCCTTTATAAGCTTCTTCAGT-3’
MONO-27引物：
正向引物：5’-GAAATGGTGGGAACCCAG-3’
反向引物：5’-GGTGGATCAAATTTCACTTGG-3’
在该同一PCR体系中还能扩增下述位点：Braf V600E位点、UGT1A1*6位点、UGT1A1*28位点；扩增该位点的引物分别为：
Braf V600E位点：
正向野生型引物：5’-GGTGATTTTGGTCTAGCTAAGT-3’
正向突变型引物：5’-AATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGA-3’
反向共用引物：5’-GTTGAGACCTTCAATGACTTTCTA-3’
UGT1A1*6位点：
正向野生型引物：5’-CCTCGTTGTA CATCAGAGACG-3’
正向突变型引物：5’-GACGCCTCGTTGTA CATCAGAGACA-3’
反向共用引物：5’-TTGTGCAGTAAGTGGGAACAGCCA-3’
UGT1A1*28位点：
正向引物：5’-TGGTGTATCGATTGGTTTTTGCCATATA-3’
反向引物：5’-GCAGCTGCTGGATGGCCCCAAGCA-3’
在该同一PCR体系中还能扩增下述对照位点：性别Amel基因、人类身份识别位点PentaC和PentaD，该对照位点的引物分别为：
对照Amel位点：
正向引物：5’-CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAG-3’
反向引物：5’-ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG-3’
对照PentaC位点：
正向引物：5’-CTGCCACACAGTTTCCTCCT-3’
反向引物：5’-ACTGAGCGCTTCTAGGGACTT-3’
对照PentaD位点：
正向引物：5’-AGTAGGATCACTTGAGCCTGGAA-3’
反向引物：5’-ATGATTCTCTTTTTTTCCCCTTCG-3’
所述引物组合物有以下9个位点的引物，其引物在PCR检测体系中终浓度分别为：
或者所述引物组合物有以下12个位点的引物，该引物在在PCR检测体系中终浓度分别为：
所述引物的序列3’端-2至-15位可改动1至3个碱基或者/和在引物3’端-15位之后的序列进行改动，所述改动包括末端增加其他序列、删除部分末端序列、改变部分碱基序列。
所述引物的序列上可以添加有修饰或以修饰碱基取代正常碱基。所述修饰为荧光基团修饰、磷酸化修饰、硫代磷酸化修饰、锁核酸修饰或肽核酸修饰。
所述位点分为三组，三组采用三种不同的荧光标记。所述第一组为：单核苷酸重复位点NR-21、BAT-26，五核苷酸重复位点PentaC；第二组为：单核苷酸重复位点BAT-25、NR-27、五核苷酸重复位点PentaD；第三组为：性别Amel基因、单核苷酸重复位点NR-24、MONO-27，Braf V600E位点、UGT1A1*6位点、UGT1A1*28位点。所述第一组荧光标记为FAM，第二组荧光标记为HEX，第三组荧光标记为TAMAR，荧光标记位于反向引物或反向共用引物的5’端。
所述扩增采用多重等位基因特异性PCR扩增，并通过同一个扩增反应体系完成对相应位点的检测，所述检测采用毛细管电泳检测。
上述肿瘤细胞微卫星不稳定状态检测体系涉及到的检测位点信息见表1：
表1 检测位点信息
基因 GenBank Number NR-21 XM_033393 BAT-26 U41210 PentaC AL138752 BAT-25 L04143 NR-27 AF070674 PentaD AC000014 Amel - NR-24 X60152 MONO-27 AC007684 Braf V600E rs4148323 UGT1A1*6 rs113488022 UGT1A1*28 rs8175347
肿瘤细胞微卫星不稳定状态PCR检测体系的检测试剂盒，包括酶混合液、PCR反应液、上述的引物组合物。
其中酶混合液0.5μl，引物组合物4μl，PCR反应液10μl，PCR检测时加入无核酸酶纯水4.5μl，模板量为1μl，PCR检测体系总体积为20μl；所述酶混合物中含有UDG酶。
检测试剂盒还包括阳性对照、阴性对照和毛细管电泳检测所需相关试剂，如内标等。
肿瘤细胞微卫星不稳定状态检测体系的使用方法，主要包括以下步骤：DNA提取、PCR扩增、遗传分析仪检测扩增产物、数据分析、检测结果的判断。
为了选择最有效的位点以确定样本MSI状态，我们用10个单核苷酸重复位点(NR-21、NR-22、NR-24、BAT-24、BAT-25、CAT-25、BAT-26、NR-27、MONO-27和BAT-34c4)和三个二核苷酸重复位点(D5S346、D2S123和D17S250)，对共333对结直肠癌样本进行检测，其中包含59对MSI-H样本和274对非MSI-H样本。对各单核苷酸位点的检测灵敏度(MSI-H样本中该位点不稳定样本的比例)和检测特异性(非MSI-H样本中该位点稳定的样本比例)进行统计，结果如下表2。在这些位点中，特异性和灵敏度都较高的位点有NR-21、NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26和MONO-27，其灵敏度在88.1％和100％之间，特异性在93.4％到100％之间。因此本发明选择以上6个单态性单核苷酸位点进行检测，以它们的不稳定状态来确定样本的MSI状态。
表2 各位点灵敏度和特异性
基因 灵敏度 特异性 NR-21 91.5％(54/59) 99.3％(272/274) NR-22 84.7％(50/59) 90.9％(249/274) NR-24 86.4％(56/59) 98.9％(271/274) BAT-24 91.5％(54/59) 89.4％(245/274) Bat25 96.6％(57/59) 100.0％(274/274) CAT-25 94.9％(56/59) 89.1％(244/274) Bat26 94.9％(56/59) 99.6％(273/274) Mono27 88.1％(52/59) 93.4％(256/274) NR27 93.2％(55/59) 99.6％(273/274) BAT-34c4 84.7％(51/59) 98.5％(270/274) D5S346 81.4％(48/59) 98.2％(269/274) D2S123 89.8％(53/59) 85.8％(235/274) D17S250 83.1％(49/59) 90.9％(249/274)
在本公司原有检测体系(专利CN201110152226.X)基础上，我们调整了所检测位点，同时标准，以优化位点的排布、避免了较小片段检测区间的干扰、提升了体系扩增均衡性和稳定性等。具体地，对NR-24、BAT-26、NR-21和NR-27的引物序列进行了调整。将NR-21和NR-27的产物大小从最小70nt调整到100nt以上，提高NR-24和BAT-26的扩增效率以协调检测体系均衡性和稳定性。BAT-25和MONO-27的引物序列沿用原体系引物序列。
本发明体系中还增加了下述3个对照位点：性别识别位点Amel、人类身份识别位点PentaC和PentaD。为了对伊立替康药物使用提供参考，在检测样本MSI状态的同时对Braf V600E、UGT1A1*6、UGT1A1*28位点进行分型，因此本发明中加入了Braf V600E、UGT1A1*6、UGT1A1*28三个位点。
本发明所述检测体系，采用的是定量荧光PCR(Quantitive Fluorescent PCR，QF-PCR)的方法对目的位点进行扩增，通过毛细管电泳进行扩增产物的检测，完成对目的位点分型的检测。对于微卫星重复位点，每个检测位点设置两条引物，通过检测产物长度确定样本微卫星不稳定状态或多态性状态。Braf V600E、UGT1A1*6每个检测位点设置三条引物，对两种分型分别设置一条不同长度的特异引物，以及一条荧光标记的下游引物。每条特异引物只能与对应基因型的DNA模板结合并进行扩增。完成PCR扩增和毛细管电泳检测后，通过特定荧光标记、特定长度的扩增产物的有无即可判定样本特定位点是否存在特定基因型。
本发明方法的特点：
1)同时检测样本MSI状态以及Braf V600E、UGT1A1*6、UGT1A1*28位点分型。
对于结直肠癌患者，确定其MSI状态对其预后预期、治疗策略选择都有重要意义。NCCN指南已推荐所有结直肠癌患者都应接受MMR或MSI检测。
NCCN指南同时指出，对于MLH1缺失的dMMR或MSI高度不稳定(MSI-H)的患者，还应该进一步检测Braf V600E状态以确定其属于遗传性的Lynch综合征还是属于散发性结直肠癌。
由于结直肠癌特点，相当比例患者在发现时已经处于中晚期。对于晚期结直肠癌患者，目前应用较广泛的一线治疗方案是伊立替康联合5-氟尿嘧啶。但伊立替康副作用较大且发生比例高，其副作用与UGT1A1基因分型直接相关。FDA批准的伊立替康说明书中以明确要求进行UGT1A1分型检测，并给出针对不同分型的用药建议。近期PD-1/PD-L1药物已被批准作为MSI-H结直肠癌患者的末线治疗方案，且已有临床试验表明其具有作为二线或一线治疗的能力。所以同时检测MSI状态和UGT1A1基因分型对患者后续治疗策略选择都具有重要意义。
综上，对于结直肠癌患者，MSI、Braf V600E、UGT1A1*6/*28检测都有临床价值和需求。本发明将上述检测整合在同一个扩增检测反应中，在不增加检测样本需求、检测周期、检测成本的情况下，获得确定后续治疗策略相关的基因状态，具有广泛临床价值和显著经济价值。
2)使用遗传分析仪通过毛细管电泳检测扩增产物。
遗传分析仪检测平台是广泛使用的主流检测平台之一，通过毛细管电泳对荧光标记的扩增产物进行检测，检测的主要技术优势在于：
①，检测灵敏度高。毛细管电泳结合使用荧光染料大幅提高了检测灵敏度，比琼脂糖电泳检测灵敏度高100倍以上。能更灵敏地检测到扩增产物，并且明确显示单核苷酸重复位点变化以及区分SNP位点野生型和突变型。另一方面，由于检测灵敏度高，为复合PCR扩增反应提供了更大调整空间。更重要的是，由于检测灵敏度高，降低了对PCR扩增产物量的要求，可以降低PCR反应模板用量、可以降低PCR扩增循环数，节约检材。
②，检测分辨率高。在通常利用的100-500bp检测范围内可清晰、有效地区分1bp差异。如此高的分辨率使得不会由于产物大小接近而产生误判，也避免了非特异扩增引起的结果误判。另一方面，高分辨率还使得同时检测更多位点成为可能。
③，可以同时对4种荧光信号检测。更进一步拓展了检测范围，使得同时检测更多位点成为可能。
④，检测速度快(40分钟)、需要操作少、可自动化大批量检测。
⑤，检测结果可利用软件自动分析判型。
3)防污染措施。
本体系中加入了UDG-dUTP防污染措施，可以有效防止产物污染，避免引起假阳性结果。
综上，本专利技术路线应用于肿瘤细胞微卫星不稳定状态检测。主要优点包括：检测样本MSI状态的同时还可检测Braf V600E以对Lynch综合征进行排查，同时检测UGT1A1基因型以对伊立替康用药提供指导。
附图说明
图1为遗传分析仪的毛细管电泳分离结直肠癌肿瘤组织样本A的扩增产物检测结果图谱。图2为遗传分析仪的毛细管电泳分离结直肠癌肿瘤组织样本B的扩增产物检测结果图谱。图3为遗传分析仪的毛细管电泳分离结直肠癌肿瘤组织样本C的扩增产物检测结果图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。
实施例1：
以含有9个位点的MSI检测体系对结直肠癌肿瘤组织样本A及其对应的正常组织样本进行检测。
1.1检测体系
检测试剂盒包含PCR反应液、引物混合液、酶混合液、阳性对照、阴性对照、内标等。引物混合液包括6个单核苷酸重复位点、3个对照位点共9对引物，引物序列如下：
NR-21引物：
正向引物：5’-GAGTCGCTGGCACAGTTCTA-3’
反向引物：5’-FAM-ATATTCCTACTCCGCATTCACAC-3’
NR-24引物：
正向引物：5’-TTGCTGAATTTTACCTCCTGAC-3’
反向引物：5’-TAMAR-ATTGTGCCATTGCATTCCAA-3’
NR-27引物：
正向引物：5’-GGAAACAAAGCATTGAAGTCTGCAGT-3’
反向引物：5’-HEX-GAGGTTCTGAGTCGATAATACTAGC-3’
BAT-25引物：
正向引物：5’-CTCGCCTCCAAGAATGTAAGT-3’
反向引物：5’-HEX-TCTGCATTTTAACTATGGCTC-3’
BAT-26引物：
正向引物：5’-GGACAGTTTGAACTGACTACTT-3’
反向引物：5’-FAM-AGCTCCTTTATAAGCTTCTTCAGT-3’
MONO-27引物：
正向引物：5’-GAAATGGTGGGAACCCAG-3’
反向引物：5’-TAMAR-GGTGGATCAAATTTCACTTGG-3’
PentaC引物：
正向引物：5’-CTGCCACACAGTTTCCTCCT-3’
反向引物：5’-FAM-ACTGAGCGCTTCTAGGGACTT-3’
PentaD引物：
正向引物：5’-AGTAGGATCACTTGAGCCTGGAA-3’
反向引物：5’-HEX-ATGATTCTCTTTTTTTCCCCTTCG-3’
Amel引物：
正向引物：5’-CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAG-3’
反向引物：5’-TAMAR-ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG-3’
将上述9对引物分别溶解并配成浓度为100μM的工作液，然后按照表3的最终浓度配成引物混合液
表3 引物终浓度
名称 终浓度(μM) NR-21 0.55 NR-24 1.7 NR-27 1.3 Bat-25 0.75 Bat-26 3 Mono-27 2.5 Penta-C 0.35 Penta-D 2.5 Amel 0.215
1.2检测方法
DNA提取。采用组织DNA提取试剂盒提取肿瘤组织样本A及相应的正常组织样本DNA，DNA提取完毕用紫外分光光度计测定浓度，并稀释成2ng/ul。
PCR扩增。
1)PCR反应液配制(在试剂准备区完成)
将各反应试剂(PCR反应液、酶混合液、引物混合液等)振荡混匀后，按表4体积比(模板除外)配制成PCR反应混合溶液，分装19ul于PCR反应管中。
表4 反应体系配制
2)加入模板(在标本制备区完成)
检测模板为肿瘤组织及正常组织提取DNA，向PCR反应管中分别加入1μL肿瘤组织样本DNA、1μL正常组织样本DNA、1μL阳性对照和1μL阴性对照。
3)PCR扩增(在扩增区完成)
将各反应管放入PCR扩增仪反应槽内，设置反应体系为20μL。按表5反应程序进行PCR扩增。
表5 PCR扩增程序
扩增产物进行毛细管电泳检测。配制混有分子量内标和甲酰胺的上样混合液：(0.5μL分子量内标+8.5μL甲酰胺)×检测样品数，涡旋振荡混匀10-15秒；用移液器给每个检测孔分装9μL的甲酰胺和内标混合物；取1μL扩增产物加入甲酰胺和内标混合物里，盖上封板胶盖。如果需要可以使用离心机短暂离心将样品中的气泡除掉；把样品放置95℃变性3分钟，迅速放置冰浴上3分钟。按照遗传分析仪用户使用手册步骤进行检测。检测建议设置进样时间为10秒、进样电压为3kV、运行时间为1800秒。
数据分析。向GeneMapper软件中导入相关文件，包括Panel、Bin、对应的Analysis Method、ROX500内标。输入样品源数据(.fsa文件)，在相关参数选择栏中选定之前导入的文件，分析数据。
检测结果的判定。通过比较肿瘤组织与正常组织中6个单核苷酸重复位点的差异来判断肿瘤组织中这6个位点的不稳定状态。
肿瘤组织样本A的扩增检测结果见图1，通过与正常组织相比较(正常组织样本的扩增检测结果图未附)，可判断样本A为NR-21、BAT-26、BAT-25、NR-27、NR-24、MONO-27六个位点不稳定的MSI-H型肿瘤组织。
实施例2：
以含有12个位点的MSI检测体系对结直肠癌肿瘤组织样本B、C及二者对应的正常组织样本进行检测。
2.1检测体系
检测试剂盒包含PCR反应液、引物混合液、酶混合液、阳性对照、阴性对照、内标等。实施例所采用的引物共有12对，引物序列如下：
NR-21引物、NR-24引物、NR-27引物、BAT-25引物、BAT-26引物、MONO-27引物、PentaC引物、PentaD引物、Amel引物序列同实施例1。
Braf V600E引物：
正向野生型引物：5’-GGTGATTTTG GTCTAGCTAC AT-3’
正向突变型引物：5’-GGTTGGTGATTTTGGTCTAGCTACGA-3’
反向共用引物：5’-TAMAR-GTTGAGACCTTCAATGACTTTCTA-3’
UGT1A1*6位点：
正向野生型引物：5’-CCTCGTTGTA CATCAGAGCG-3’
正向突变型引物：5’-CCTTCCTCGTTGTA CATCAGAGAA-3’
反向共用引物：5’-TAMAR-TTGTGCAGTAAGTGGGAACAGCCA-3’
UGT1A1*28位点：
正向引物：5’-TGGTGTATCGATTGGTTTTTGCCATATA-3’
反向引物：5’-TAMAR-GCAGCTGCTGGATGGCCCCAAGCA-3’
注：1.“＝”双下划线代表各引物在引物3’端-2至-15位改动的碱基。
2.“－”单下划线代表各引物可以在引物3’端-15位之后的序列进行改动，包括末端增加其他序列、删除部分末端序列、改变部分碱基序列。
3.反向共用引物均在5’端进行TAMAR荧光标记。
将上述12对引物分别溶解并配成浓度为100μM的工作液，然后按照表6的最终浓度配成引物混合液
表6 引物终浓度
名称 终浓度(μM) NR-21 0.55 NR-24 1.7 NR-27 1.3 Bat-25 0.75 Bat-26 3 Mono-27 2.5 Penta-C 0.35 Penta-D 2.5 Amel 0.215 Braf V600E 2.2 UGT1A1*6 1.8 UGT1A1*28 1.7
2.2检测方法
DNA提取、PCR扩增、数据分析同实施例1。
检测结果的判定。
通过比较肿瘤组织与正常组织中6个单核苷酸重复位点的差异来判断肿瘤组织中这6个位点的不稳定状态。检测结果图中Braf V600E位点野生型显示为WT，突变型显示为WU。UGT1A1*6位点野生型显示为WT，突变型显示为WU。UGT1A1*28对应的四种基因型分别显示为5、6、7、8，对应UGT1A1基因启动子区TA重复的个数。其中6为野生型，UGT1A1基因表达正常；5、7、8为突变型，UGT1A1基因表达量低于野生型。
肿瘤组织样本B的扩增检测结果见图2，通过与正常组织相比较(正常组织样本的扩增检测结果图未附)，可判断样本BNR-21、BAT-26、NR-27、NR-24四个位点不稳定，属于微卫星高度不稳定型(MSI-H)；Braf V600E位点为杂合突变型，UGT1A1*6位点为野生型，UGT1A1*28位点为野生型。Braf V600E位点突变表明该肿瘤样本是因MLH1甲基化造成MLH1蛋白表达缺失，导致微卫星高度不稳定，表明该患者所患癌症不是Lynch综合征而是散发性结直肠癌；UGT1A1为野生型(TA6/TA6)，表明伊立替康体内代谢正常，因而该患者可使用正常剂量伊立替康。
肿瘤组织样本C的扩增检测结果见图3，通过与正常组织相比较(正常组织样本的扩增检测结果图未附)，可判断样本C为微卫星稳定型(MSS)，显然患者非Lynch综合征患者；UGT1A1为纯合突变型(TA7/TA7)，表明该患者UGT1A1基因表达量低，尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶代谢能力差，应严格控制伊立替康药物用量或更换其他药物。
序列表
<110> 北京阅微基因技术有限公司
<120> 肿瘤细胞微卫星不稳定状态检测体系
<130> PP18006-YWJ
<160> 28
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
gagtcgctgg cacagttcta 20
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
atattcctac tccgcattca cac 23
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
ttgctgaatt ttacctcctg ac 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
attgtgccat tgcattccaa 20
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 6
gaggttctga gtcgataata ctagc 25
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 5
ggaaacaaag cattgaagtc tgcagt 26
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 7
ctcgcctcca agaatgtaag t 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 8
tctgcatttt aactatggct c 21
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 9
ggacagtttg aactgactac tt 22
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 10
agctccttta taagcttctt cagt 24
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 11
gaaatggtgg gaacccag 18
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 12
ggtggatcaa atttcacttg g 21
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 13
ggtgattttg gtctagctaa gt 22
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 14
aataggtgat tttggtctag ctacaga 27
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 15
gttgagacct tcaatgactt tcta 24
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 16
cctcgttgta catcagagac g 21
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 17
gacgcctcgt tgtacatcag agaca 25
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 18
ttgtgcagta agtgggaaca gcca 24
<210> 19
<211> 28
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 19
tggtgtatcg attggttttt gccatata 28
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 20
gcagctgctg gatggcccca agca 24
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 21
ccctgggctc tgtaaagaat ag 22
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 22
atcagagctt aaactgggaa gctg 24
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 23
ctgccacaca gtttcctcct 20
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 24
actgagcgct tctagggact t 21
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 25
agtaggatca cttgagcctg gaa 23
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 26
atgattctct ttttttcccc ttcg 24
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 27
gagtcgctgg cacagttcta 20
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 28
atattcctac tccgcattca cac 23