技术领域
本发明涉及一种新的抗肿瘤药，特别是涉及一种瑞戈非尼，其可用于治疗由异常的VEGFR、PDGFR、raf、p38、和/或flt-3激酶信号介导的疾病和疾病症状。本发明还涉及所述抗肿瘤药物特别是瑞戈非尼的制备方法。
背景技术
ras信号转导途径的激活意味着对细胞增殖、分化和转化具有深远影响的事件的级联反应。作为Ras下游效应子的Raf激酶是将这些信号从细胞表面受体传递到细胞核的一个关键递质。已经证明，通过使用raf激酶的灭活抗体或显性失活raf激酶或显性失活MEK(raf激酶的底物)的共表达抑制raf激酶信号途径而抑制活化ras的作用会导致转化的细胞恢复为正常的生长表型。Kolch等进一步证明了通过反义RNA对raf表达的抑制阻断了膜相关致癌基因引起的细胞增殖。同样地，在试管实验和体内实验中已经证实raf激酶的抑制(通过反义寡核苷酸)与多种人类肿瘤类型的生长抑制是相关的。
维持大小超过1-2mm3的肿瘤细胞的持续肿瘤生长需要功能性间质，这是包括成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、细胞外基质蛋白质和可溶因子的支持结构。肿瘤通过分泌诸如PDGF和转化生长因子β(TGF-β)等可溶性生长因子引起间质组织的形成，所述生长因子各自刺激宿主细胞分泌诸如成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)和血管内皮生长因子(VEGF)等互补因子。这些刺激因子引起新的血管生成，这向肿瘤提供氧和营养物质并使其生长以及为肿瘤转移提供路线。相信针对抑制间质形成的一些治疗方法会对源自多种组织学类型的上皮肿瘤的生长加以抑制。然而，由于其性质的复杂性以及多种生长因子参与血管生成过程和肿瘤恶化，一种针对单一信号途径的物质可能仅有有限的功效。希望能对肿瘤在宿主间质中用于引发血管生成的多个关键信号途径提供治疗方法。这些途径包括PDGF(间质形成的有效刺激因子)、FGF(成纤维细胞和内皮细胞的化学趋化因子和促有丝分裂素)和VEGF(血管形成的有效调节因子)。
PDGF是间质形成的一种关键调节因子，它由多种肿瘤以旁分泌形式分泌并促进成纤维细胞、平滑肌及内皮细胞的生长，从而促进间质形成及血管生成。PDGF最初是作为猿猴肉瘤病毒的v-sis致癌基因产物得以鉴定。该生长因子由被称为A链或B链的2条肽链构成，肽链一级氨基酸序列具有60％的同源性。肽链经二硫键相连形成由AA、BB或AB同源或异源二聚体组成的30kDa的成熟蛋白。在血小板中发现了高水平的PDGF，并且PDGF可由内皮细胞和血管平滑肌细胞表达。此外，在诸如血管形成不足的肿瘤组织中所发现的低氧条件下PDGF的产生得以上调。PDGF以高亲和力与PDGF受体(PDGFR)结合，该受体是1106个氨基酸构成的124kDa的跨膜酪氨酸激酶受体。PDGFR是同源或异源二聚体肽链形式的，肽链在其氨基酸序列上总地具有30％的同源性，并且在其激酶结构域之间具有64％的同源性。PDGFR是具有分开的激酶结构域的酪氨酸激酶受体家族的成员，该家族包括VEGFR2(KDR)、VEGFR-3(flt-4)、c-Kit和flt-3。PDGFR主要在成纤维细胞、平滑肌细胞和周细胞(pericyte)上表达，并在神经细胞、肾小球细胞、Leydig细胞和中枢神经系统的Schwann细胞上少量表达。一旦与受体结合，PDGF引起受体二聚化并经历酪氨酸残基的自我磷酸化和相互磷酸化，这能提高受体的激酶活性并促进下游效应因子通过激活SH2蛋白结合结构域的募集。包括PI-3激酶、磷酯酶C-γ、src和GAP(针对p21-ras的三磷酸鸟苷酸酶激活蛋白)在内的多种信号分子与激活的PDGFR形成复合物。通过激活PI-3激酶，PDGF激活Rho细胞途径从而引起细胞运动和迁移，并通过激活GAP引起通过p21-ras和MAPK信号途径激活的有丝分裂。
在成人中，PDGF的主要作用是促进并提高伤口愈合的速度并保持血管的体内平衡。在血小板中发现了高浓度的PDGF，它对于成纤维细胞、平滑肌细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞而言是一种有效的化学趋化因子。除了其在伤口愈合中的作用之外，PDGF帮助保持血管的体内平衡。在新生血管发育过程中，PDGF募集血管结构完整性所需要的周细胞和平滑肌细胞。PDGF被认为在肿瘤新生血管形成中发挥相似的作用。作为其在血管生成中所起作用的一部分，PDGF通过其对结缔组织细胞和细胞外基质之间相互作用的调节调节血管的渗透性而控制组织间隙的流体压力。抑制PDGFR的活性可以降低组织间隙的压力并促进细胞毒素流入肿瘤而提高这些物质的抗肿瘤功效。
PDGF可以通过旁分泌或自分泌直接刺激间质细胞或肿瘤细胞上的PDGFR或通过受体的信号放大或经重组激活受体而促进肿瘤生长。过表达的PDGF可以使人的黑素瘤细胞和角质化细胞这两种不表达PDGF受体的细胞类型可能通过PDGF对间质形成和诱导血管生成的直接作用而发生转化。在其中肿瘤表达PDGF但不表达受体的结肠癌、肺癌、乳癌和前列腺癌等肿瘤中也观察到了这种肿瘤间质的旁分泌刺激。在神经胶母细胞瘤、软组织瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌和肺癌中已经报道了对肿瘤细胞生长的自分泌刺激，其中大部分经分析的肿瘤细胞表达PDGF配体和受体。非配体依赖型的受体激活发现地较少，但在慢性粒单核细胞白血病(CMML)中已有报道，其中a染色体易位在类Ets转录因子TEL和PDGF受体之间形成融合蛋白。此外，在胃肠道间质瘤中已经发现了与c-Kit激活无关的PDGFR中的激活突变。PDGFR抑制剂能干扰肿瘤间质发育并抑制肿瘤生长和转移而没有过度的副作用。
血管内皮生长因子(VEGF，也被称为血管渗透性因子VPF)是另一种在胚胎发育和有些血管生成依赖的疾病中血管新生和血管发生的主要调节因子。VEGF代表由于选择性RNA剪接而以同源二聚体形式存在的促有丝分裂原异构体家族。VEGF异构体对于血管内皮细胞来说是高度特异的。
VEGF表达受缺氧以及诸如白介素1、白介素6、表皮生长因子和转化生长因子等多种细胞因子和生长因子诱导。目前已经报道，VEGF和VEGF家族成员与以下三种跨膜受体酪氨酸激酶中的一种或多种结合：VEGF受体1(也称为flt-1(类fms酪氨酸激酶1))、VEGFR-2(也称为含激酶插入结构域受体(KDR)，KDR的小鼠类似物称作胎肝激酶1(flk-1))和VEGFR-3(也称为flt-4)。已经证实，VEGFR-2和flt-1具有不同的信号转导性质。因此，VEGFR-2在完整细胞中经历配体依赖的强酪氨酸磷酸化，而flt-1表现出弱应答。因此，相信对于诱导全范围的VEGF介导的生物学应答而言，与VEGFR-2结合是关键要求。
VEGF在体内血管发生中发挥中心作用，并引起血管新生和血管渗透化。不加调节的VEGF表达引发多种疾病，其特征是不正常的血管新生和/或高渗透性作用。相信有些物质对VEGF介导的信号转导级联的调节能对不正常的血管新生和/或高渗透性作用提供有效控制。肿瘤低氧区域内的肿瘤化细胞通过刺激VEGF生产作出反应，这引起沉默的内皮细胞的激活以刺激新的血管形成。此外，在没有血管新生的肿瘤区域中的VEGF产生可以推动ras信号转导途径。原位杂交研究表明，在包括肺癌、甲状腺癌、乳癌、胃肠道肿瘤、肾及膀胱肿瘤、卵巢癌、宫颈癌以及血管瘤和几种颅内肿瘤在内的各种人类肿瘤中VEGF mRNA的显著上调。中和性VEGFR-2单克隆抗体在阻断肿瘤血管新生中被证明是有效的。
VEGF的过表达(例如在极端缺氧条件下)可以引起眼球内血管新生，导致血管过量增生，最终导致失明。已经在包括糖尿病视网膜病、缺血性视网膜静脉闭塞和早产儿视网膜病和老年黄斑病变在内的多种视网膜病中观察到了这样的级联反应。
在风湿性关节炎(RA)中，血管生成因子的产生可以介导血管翳的内向生长。RA患者的滑液中具有高水平的免疫反应性VEGF，而在其他形式关节炎或退化性关节疾病患者的滑液中VEGF水平低下。在大鼠胶原诱导型关节炎模型中已经证实，血管生成抑制剂AGM-170阻碍关节中的新血管形成。
在银屑病以及诸如大疱性类天疱疮、多形红斑和疱疹样皮炎等与表皮下疱疹形成相关的疱疹类疾病中也表现出VEGF表达的提高。
血管内皮生长因子(VEGF、VEGF-C、VEGF-D)及其受体(VEGFR2、VEGFR3)不仅是肿瘤血管生成、而且是淋巴管生成的关键调控因子。VEGF、VEGF-C和VEGF-D在大部分肿瘤中主要在肿瘤生长期间并经常以充分提高的水平表达。VEGF表达受缺氧、细胞因子、诸如ras的致癌基因或通过肿瘤抑制基因的灭活的刺激。
VEGF的生物学活性通过与其受体的结合得以介导。VEGFR3(也称为flt-4)主要在正常成人组织中的淋巴管内皮细胞上表达。对于新的淋巴管形成需要VEGFR3功能，但对于维持已存在的淋巴管则不需要。VEGFR3在肿瘤的血管内皮细胞上也是上调的。最近，VEGFR3的配体VEGF-C和VEGF-D被确定为哺乳动物中淋巴管生成的调节因子。肿瘤相关的淋巴管生成因子诱导的淋巴管生成可能促进新的导管生长进入肿瘤，这为肿瘤细胞提供了进入系统循环的通道。侵入淋巴管的细胞可能通过胸导管进入血液循环。肿瘤表达研究已经允许对VEGF-C、VEGF-D和VEGFR3表达与同原发肿瘤扩散能力直接相关的临床病理学因素(例如淋巴结转移、淋巴管侵入、继发性转移和无病生存期)进行直接比较。在许多情况下，这些研究说明了淋巴管生成因子表达和原发性实体肿瘤转移能力之间的统计学相关性。
对于恶性细胞中VEGF产生而言，缺氧看来是一种重要的刺激因子。对于肿瘤细胞对缺氧产生应答而诱导VEGF来说，需要p38MAP激酶的激活。除了通过调节VEGF分泌而参与血管生成以外，p38MAP激酶通过调节胶原酶活性和尿激酶纤维蛋白溶酶原活化剂表达促进恶性细胞侵入和不同肿瘤类型的迁移。
促有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)p38的抑制被证明能在试管和/或体内抑制细胞因子形成(例如TNF、IL-1、IL-6、IL-8)和蛋白酶产生(例如MMP-1、MMP-3)。促有丝分裂原激活蛋白激酶p38参与IL-1和TNF信号途径。
临床研究已经将肿瘤坏死因子(TNF)产生和/或向包括类风湿性关节炎在内的多种疾病联系了起来。此外，在多种炎性和/或免疫调节类疾病中发现了过量水平的TNF。这些疾病包括急性风湿热、骨吸收、绝经后骨质疏松、脓血症、脓毒性休克、内毒性休克、全身性炎症反应症、哮喘等。TNF也与感染性疾病相关，这些疾病包括肺结核、胃溃疡过程中的幽门螺杆菌感染等。
许多疾病被认为是由过量的或不需要的基质破坏性金属蛋白酶(MMP)活性或由MMP与金属蛋白酶的组织抑制剂(TMP)的比例失衡所介导的。这些疾病包括骨关节炎、风湿性关节炎、脓毒性关节炎、肿瘤转移、牙周病、角膜脱落、蛋白尿症、动脉粥样硬化斑块破裂引起的冠状动脉血栓、主动脉瘤、不孕、营养不良性大疱性表皮松解、创伤性关节损伤后的退化性软骨缺失、MMP活性介导的骨质疏松、颌骨关节病以及神经系统的脱髓鞘病。
由于抑制p38导致TNF形成和MMP形成的抑制，相信抑制促有丝分裂原激活蛋白激酶p38能够提供治疗诸如类风湿性关节炎和COPD的包括骨质疏松和炎症疾病在内的上述疾病的手段。
对于恶性细胞中VEGF产生而言，缺氧看来是一种重要的刺激因子。对于肿瘤细胞对缺氧产生应答而诱导VEGF来说，需要p38MAP激酶的激活。除了通过调节VEGF分泌而参与血管生成以外，p38MAP激酶通过调节胶原酶活性和尿激酶纤维蛋白溶酶原活化剂表达促进恶性细胞侵入和不同肿瘤类型的迁移。因此，还希望抑制p38激酶通过干扰与血管生成和恶性细胞侵入相关的信号级联影响肿瘤生长。
对某些脲所具有的丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂和/或酪氨酸激酶抑制剂活性已经进行了描述。尤其是已经证实了将某些脲作为药物组合物的活性成分用于对癌症、血管生成疾病、炎性疾病的治疗。
本领域仍然期待有有效的抗肿瘤药物，例如其可用于上文所述的情形。以及此类抗肿瘤药物的有益的制备方法。
式(I)化合物4-[4-({[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]氨基甲酰}氨基)-3-氟苯氧基]-N-甲基吡啶-2-甲酰胺，即4-[4-({[4-chloro-3-(trifluoromethyl)phenyl]carbamoyl}amino)-3-fluorophenoxy]-N-methylpyridine-2-carboxamide已在WO2005009961中公开：
式(I)化合物的一水合物即瑞戈非尼(Regorafenib)以商品名Stivarga上市，用于治疗过度增殖性疾病，诸如癌症、肿瘤、淋巴瘤、肉瘤和白血病。瑞戈非尼的分子式为C21H15ClF4N4O3·H2O，分子量为500.83。
一水合物形式的瑞戈非尼在WO2008043446中提及。此外，式(I)化合物的盐，诸如其盐酸盐、甲磺酸盐和苯基磺酸盐在WO2005009961中提及，并且可以通过用相应的酸处理式(I)化合物来形成。式(I)化合物被描述为用于治疗过度增殖性疾病，诸如癌症、肿瘤、淋巴瘤、肉瘤和白血病。
WO2005009961描述了一种制备式(I)化合物的方法，其说明于下面的方案中：
在第一步中，将4-氨基-3-氟苯酚用叔丁醇钾处理，并加入4-氯-N-甲基-2-吡啶羧酰胺于N,N-二甲基乙酰胺中的溶液，以形成4-(4-氨基-3-氟苯氧基)吡啶-2-羧酸甲基酰胺；
在萃取之后将其最终用异氰酸(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)酯于甲苯中的溶液处理，以形成4{4-[3-(4-氯-3-三氟甲基苯基)-脲基]-3-氟苯氧基}-吡啶-2-羧酸甲基酰胺，其为式(I)化合物。
尽管现有技术公开的方法本身可有效用于制备式(I)化合物、其一水合物、盐酸盐、甲磺酸盐和苯基磺酸盐，但是诸如纯度、产物收率、方法效率、安全性和经济性的因素对于工业规模的药物产品的方法而言是非常重要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备式(I)化合物及其盐和一水合物的工业规模(千克级以上)的方法，其满足了在生产中应用的标准并且提供了纯度、环境适应性、工业实用性、安全方面和体积收率方面的改善。特别地，对于药物的制备而言纯度和安全方面是有待考虑的。这一目的通过本发明得以实现。本发明的式(I)化合物是具有与尿素结合的2-氟-4-(2-(N-甲基氨甲酰基)-4-吡啶氧基)亚苯基基团的ω-羧芳基二苯基脲，它是raf激酶、VEGFR激酶、p38激酶以及PDGFR激酶的有效抑制剂，所述激酶都是对治疗和预防包括癌症在内的骨质疏松、炎性疾病、过度增殖性疾病和血管生成疾病而言感兴趣的分子靶点。
本发明的式(I)化合物的制备示于下面的方案中。
本发明第一方面提供了以下式(I)化合物或其药用盐或一水合物：
根据本发明第一方面的式(I)化合物或其药用盐或一水合物，其为药用原料药。或者，本发明第一方面提供了一种药用原料药，其为本发明所述式(I)化合物或其药用盐或一水合物。
根据本发明第一方面的式(I)化合物或其药用盐或一水合物，其中包含微量的作为杂质的以下式(X)化合物：
根据本发明第一方面的式(I)化合物或其药用盐或一水合物，其中相对于式(I)化合物的重量而言，式(X)化合物的含量小于0.2％，例如小于0.15％，例如小于0.1％，例如小于0.05％。
已经出人意料地发现，对于式(X)化合物(相对于式(I)化合物的)含量小于0.2％的药用原料药，其具有显著更优良的稳定性，例如其原料药或添加辅料的制剂在长期贮藏过程中活性成分明显地能够维持较高水平。
根据本发明第一方面的式(I)化合物或其药用盐或一水合物，其是通过包括如下步骤的方法制备得到的：
(1)在反应混合物中使以下式(IV)化合物
与以下式(V)化合物反应
得到式(I)化合物；接着，任选地，
(2)使所得式(I)化合物用酸处理以形成式(I)化合物的药用盐；接着，任选地，
(3)使步骤(2)所得药用盐用碱性水溶液处理以沉淀出式(I)化合物的一水合物。
根据本发明第一方面的式(I)化合物或其药用盐或一水合物，其中步骤(3)中，在35℃至45℃的温度下使式(I)化合物的一水合物沉淀。
根据本发明第一方面的式(I)化合物或其药用盐或一水合物，其中还包括将步骤(4)，即：使步骤(3)所得式(I)化合物的一水合物减压干燥以形成式(I)化合物的步骤。
根据本发明第一方面的式(I)化合物或其药用盐或一水合物，其中包含溶解的式(I)化合物和从式(I)化合物的盐沉淀出的物质的溶液是反应混合物或是在从反应混合物中分离出式(I)化合物之后制备的式(I)化合物的单独的溶液。
根据本发明第一方面的式(I)化合物或其药用盐或一水合物，其中所述酸这样加入的：在形成式(I)化合物之后，通过向反应混合物中加入质子物质和酸前体而在反应混合物中就地产生(即原位生成)。
根据本发明第一方面的式(I)化合物或其药用盐或一水合物，其中所述质子物质是醇并且所述酸前体是酰基氯。
根据本发明第一方面的式(I)化合物或其药用盐或一水合物，其中所述酸这样加入的：在形成式(I)化合物之后，通过向反应混合物中加入醇和酰基氯而在反应混合物中就地产生(即原位生成)。
根据本发明第一方面的式(I)化合物或其药用盐或一水合物，其中所述醇是甲醇或乙醇并且所述酰基氯是乙酰氯。
根据本发明第一方面的式(I)化合物或其药用盐或一水合物，其中在步骤(1)进行式(IV)化合物与式(V)化合物反应的过程中，还随式(IV)化合物一起添加有链烷酸。在一个实施方案中，式(IV)化合物与链烷酸的摩尔比为1:0.1～0.2。在一个实施方案中，链烷酸是冰乙酸。出人意料地发现，在缩合反应过程中添加适量的链烷酸有助于降低式(X)化合物的生成。
式(IV)化合物是已知的。当然其还可通过以下方法制备得到。
根据本发明第一方面的式(I)化合物或其药用盐或一水合物，其中式(IV)化合物是通过以下步骤制备的：
使式(III)化合物
其中R1和R2独立地选自氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-戊基、3-戊基、新戊基、正己基、2-己基和3-己基，或者R1和R2相连接并且与它们所连接的碳原子一起形成4至7元环烷基环，
与以下式(II)化合物在碱的存在下反应，
随后加入酸以生成式(IV)化合物。
根据本发明第一方面的式(I)化合物或其药用盐或一水合物，其中式(III)化合物在适合的有机溶剂的溶液中使用并且是通过使4-氨基-3-氟苯酚与式(VI)化合物反应生成的
其中R1和R2独立地选自氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-戊基、3-戊基、新戊基、正己基、2-己基和3-己基，或者R1和R2相连接并且和它们所连接的碳原子一起形成4至7元环烷基环。
根据本发明第一方面的式(I)化合物或其药用盐或一水合物，其中式(II)化合物在适合的有机溶剂的溶液中使用，所述溶液是通过用碱中和式(II)化合物的盐酸盐制备的。
根据本发明第一方面的式(I)化合物或其药用盐或一水合物，其中将式(II)化合物溶解在适合的有机溶剂中，用通过加入质子物质和酸前体就地生成的酸处理，沉淀为式(II)化合物的盐，并通过加入碱的水溶液中和。
进一步，本发明第二方面提供了制备以下式(I)化合物或其药用盐或一水合物的方法：
其包括如下步骤：
(1)在反应混合物中使以下式(IV)化合物
与以下式(V)化合物反应
得到式(I)化合物；接着，任选地，
(2)使所得式(I)化合物用酸处理以形成式(I)化合物的药用盐；接着，任选地，
(3)使步骤(2)所得药用盐用碱性水溶液处理以沉淀出式(I)化合物的一水合物。
根据本发明第二方面的方法，其中所述式(I)化合物或其药用盐或一水合物为药用原料药。或者，本发明第二方面提供了制备药用原料药的方法，该药用原料药其为本发明所述式(I)化合物或其药用盐或一水合物。
根据本发明第二方面的方法，其所制得的式(I)化合物或其药用盐或一水合物中，包含微量的作为杂质的以下式(X)化合物
根据本发明第二方面的方法，其所制得的式(I)化合物或其药用盐或一水合物中，相对于式(I)化合物的重量而言，式(X)化合物的含量小于0.2％，例如小于0.15％，例如小于0.1％，例如小于0.05％。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤(3)中，在35℃至45℃的温度下使式(I)化合物的一水合物沉淀。
根据本发明第二方面的方法，其中还包括将步骤(4)，即：使步骤(3)所得式(I)化合物的一水合物减压干燥以形成式(I)化合物的步骤。
根据本发明第二方面的方法，其中包含溶解的式(I)化合物和从式(I)化合物的盐沉淀出的物质的溶液是反应混合物或是在从反应混合物中分离出式(I)化合物之后制备的式(I)化合物的单独的溶液。
根据本发明第二方面的方法，其中所述酸这样加入的：在形成式(I)化合物之后，通过向反应混合物中加入质子物质和酸前体而在反应混合物中就地产生(即原位生成)。
根据本发明第二方面的方法，其中所述质子物质是醇并且所述酸前体是酰基氯。
根据本发明第二方面的方法，其中所述酸这样加入的：在形成式(I)化合物之后，通过向反应混合物中加入醇和酰基氯而在反应混合物中就地产生(即原位生成)。
根据本发明第二方面的方法，其中所述醇是甲醇或乙醇并且所述酰基氯是乙酰氯。
根据本发明第二方面的方法，其中在步骤(1)进行式(IV)化合物与式(V)化合物反应的过程中，还随式(IV)化合物一起添加有链烷酸。在一个实施方案中，式(IV)化合物与链烷酸的摩尔比为1:0.1～0.2。在一个实施方案中，链烷酸是冰乙酸。
根据本发明第二方面的方法，其中式(IV)化合物是通过以下步骤制备的：
使式(III)化合物
其中R1和R2独立地选自氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-戊基、3-戊基、新戊基、正己基、2-己基和3-己基，或者R1和R2相连接并且与它们所连接的碳原子一起形成4至7元环烷基环，
与以下式(II)化合物在碱的存在下反应，
随后加入酸以生成式(IV)化合物。
根据本发明第二方面的方法，其中式(III)化合物在适合的有机溶剂的溶液中使用并且是通过使4-氨基-3-氟苯酚与式(VI)化合物反应生成的
其中R1和R2独立地选自氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-戊基、3-戊基、新戊基、正己基、2-己基和3-己基，或者R1和R2相连接并且和它们所连接的碳原子一起形成4至7元环烷基环。
根据本发明第二方面的方法，其中式(II)化合物在适合的有机溶剂的溶液中使用，所述溶液是通过用碱中和式(II)化合物的盐酸盐制备的。
根据本发明第二方面的方法，其中将式(II)化合物溶解在适合的有机溶剂中，用通过加入质子物质和酸前体就地生成的酸处理，沉淀为式(II)化合物的盐，并通过加入碱的水溶液中和。
进一步，本发明第三方面提供了一种药物组合物，其中包含本发明第一方面任一实施方案所述药用原料药，以及药学可接受的辅料。
或者，进一步，本发明第三方面提供了一种药物组合物，其中包含式(I)化合物或其药用盐或一水合物，以及药学可接受的辅料。
根据本发明第三方面的药物组合物，其中包含微量的作为杂质的以下式(X)化合物
根据本发明第三方面的药物组合物，其中相对于式(I)化合物的重量而言，式(X)化合物的含量小于0.2％，例如小于0.15％，例如小于0.1％，例如小于0.05％。
根据本发明的任一方面，不论是所述药用原料药还是药物组合物，其中相对于式(I)化合物的重量而言，式(X)化合物的含量为0.0001％～0.2％，例如为0.0001％～0.15％，例如为0.0001％～0.1％，例如为0.0001％～0.05％。根据本发明的任一方面，不论是所述药用原料药还是药物组合物，其中相对于式(I)化合物的重量而言，式(X)化合物的含量为0.0005％～0.2％，例如为0.0005％～0.15％，例如为0.0005％～0.1％，例如为0.0005％～0.05％。根据本发明的任一方面，不论是所述药用原料药还是药物组合物，其中相对于式(I)化合物的重量而言，式(X)化合物的含量为0.001％～0.2％，例如为0.001％～0.15％，例如为0.001％～0.1％，例如为0.001％～0.05％。本发明人已经发现，将式(X)化合物的含量降到0.0001％在技术上是相当困难的，会造成目标物的产率急剧下降。因此式(X)化合物含量在可接受(即下限)至可控(即上限)是有益的。
本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾，当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
在本发明中，如未另外说明，涉及的％是重量/重量百分数。
本发明包含一种制备式(I)化合物、其盐或一水合物的方法，该方法通过在反应混合物中将式(IV)化合物(其是4-(4-氨基-3-氟苯氧基)-N-甲基吡啶-2-羧酰胺)
用式(V)化合物(其是异氰酸(4-氯-3-三氟甲基-苯基)酯)处理，
然后将溶解的式(I)化合物用酸处理以形成式(I)化合物的盐(其从含有溶解的式(I)化合物的溶液中沉淀出来)，然后任选地将式(I)化合物的盐用碱性水溶液处理以沉淀式(I)化合物的一水合物，并任选地将该一水合物减压干燥，直到形成式(I)化合物。
在进行式(IV)化合物与式(V)化合物反应的过程中，还随式(IV)化合物一起添加有链烷酸。在一个实施方案中，式(IV)化合物与链烷酸的摩尔比为1:0.1～0.2。在一个实施方案中，链烷酸是冰乙酸。
式(I)化合物的盐可以通过以下步骤来制备：在反应混合物中将式(IV)化合物用式(V)化合物处理，然后将溶解的式(I)化合物用酸处理以形成式(I)化合物的盐，其从含有溶解的式(I)化合物的溶液中沉淀出来。
式(I)化合物的一水合物可以通过以下步骤来制备：在反应混合物中将式(IV)化合物用式(V)化合物处理，然后将溶解的式(I)化合物用酸处理以形成式(I)化合物的盐(其从含有溶解的式(I)化合物的溶液中沉淀出来)，然后优选在35℃至45℃的温度，最优选在38℃至42℃将式(I)化合物的盐用碱性水溶液处理以沉淀出式(I)化合物的一水合物。
式(I)化合物可以通过以下步骤来制备：在反应混合物中将式(IV)化合物用式(V)化合物处理，然后将溶解的式(I)化合物用酸处理以形成式(I)化合物的盐(其从含有溶解的式(I)化合物的溶液中沉淀出来)，然后将式(I)化合物的盐用碱性水溶液处理以沉淀式(I)化合物的一水合物，并优选在85℃至120℃的温度，并且优选在低于30mbar的压力将该一水合物减压干燥，直到形成式(I)化合物。
根据上面描述的方法，含有溶解的式(I)化合物和从式(I)化合物的盐沉淀出的物质的溶液可以优选是反应混合物，或者可以是含有式(I)化合物的单独的溶液。该单独的溶液可以是在从反应混合物中分离出式(I)化合物(例如通过按照描述于例如WO2005009961中的标准的后处理方法并将式(I)化合物溶解于适合的有机溶剂中)之后制备的。
在如上面描述的制备式(I)化合物、其一水合物或盐的方法的优选的实施方案中，所述酸通过向反应混合物中加入质子物质和酸前体在含有溶解的式(I)化合物的溶液中就地产生。
在制备式(I)化合物、其一水合物或盐的方法的更优选的实施方案中，所述酸通过向反应混合物中加入醇和酸前体在式(I)化合物生成之后在反应混合物中就地产生。
在制备式(I)化合物、其一水合物或盐的方法的最优选的实施方案中，所述酸通过向反应混合物中加入醇和酰基氯(优选乙酰氯)在式(I)化合物生成之后在反应混合物中就地产生。
在制备式(I)化合物、其一水合物或盐的方法中，式(IV)化合物与式(V)化合物的反应在适合的有机溶剂中(例如在四氢呋喃中)，在高于15℃并低于70℃的温度(优选在15℃至60℃的温度，更优选在15℃至50℃，最优选在室温)发生。优选首先将式(IV)化合物加入至适合的有机溶剂(例如在四氢呋喃中)中，并与式(V)化合物混合30至300分钟，优选60至150分钟，最优选80至100分钟，优选溶解或混悬于适合的有机溶剂(例如甲苯)中，所述溶剂可以不同于第一种适合的有机溶剂。在形成式(I)化合物之后，将酸加入至反应混合物中。优选所述酸通过在例如5至60分钟，优选10至30分钟内加入质子物质(例如水和/或醇，优选醇)和酸前体(优选酰基氯)(从而就地生成相应的酸)在反应混合物中就地产生。优选首先加入质子物质。式(I)化合物的盐可以通过沉淀来分离。
为了制备式(I)化合物的一水合物，将式(I)化合物的盐进一步用碱性水溶液(优选用有机溶剂和碱性水溶液的混合物)处理。式(I)化合物的一水合物可以通过沉淀来分离，优选在35℃至45℃的温度，最优选在38℃至42℃进行。
为了制备式(I)化合物，将式(I)化合物的一水合物干燥，优选在85℃至120℃的温度并且在减压条件下，更优选在低于30mbar的压力下进行。
在制备式(I)化合物、其一水合物或盐的方法中形成酸加成盐的合适的酸包括但不限于无机酸、羧酸和磺酸，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、三氟甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、萘二磺酸、乙酸、丙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸、马来酸和苯甲酸。优选盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、三氟甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸和萘二磺酸，更优选盐酸、苯磺酸、甲苯磺酸或甲磺酸，最优选盐酸。
式(I)化合物的盐(其为药学上可接受的盐)包括但不限于无机酸、羧酸和磺酸的酸加成盐，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、三氟甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、萘二磺酸、乙酸、丙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸、马来酸和苯甲酸的盐。优选盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、三氟甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸和萘二磺酸的盐，更优选盐酸、苯磺酸、甲苯磺酸或甲磺酸的盐，最优选盐酸盐。
根据本发明，醇是携带至少一个羟基基团的有机物质。醇包括但不限于甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、仲丁醇、异丁醇、正戊醇、甘油或其混合物。优选将甲醇、乙醇和异丙醇用作本方法中的醇。
为了就地制备酸，适合的酸前体包括但不限于有机酰卤，优选酰基卤，诸如酰基氯和酰基溴，更优选乙酰氯、乙酰溴、丙酰氯或丙酰溴，最优选乙酰氯。
优选上面描述的方法，其中在没有水的情况下就地制备酸。
在制备式(I)化合物、其一水合物或盐的方法中合适的有机溶剂包括但不限于四氢呋喃、甲苯、乙酸乙酯、二噁烷、甲基叔丁基醚、二甲氧基乙烷,二甲亚砜、二甲基甲酰胺、1-甲基-2-吡咯烷酮或上述溶剂的混合物。更优选使用四氢呋喃、甲苯及其混合物。
在制备式(I)化合物的一水合物的方法中合适的碱性水溶液包括但不限于碱金属氢氧化物、碱土金属氢氧化物、碱金属醇盐、碱土金属醇盐、有机胺和氨的水溶液，优选氢氧化钠和氢氧化钾的水溶液，更优选氢氧化钠的水溶液。碱性水溶液可以与有机溶剂，诸如丙酮、乙酸乙酯、四氢呋喃混合，优选与丙酮混合。
本发明同样包含一种制备式(IV)化合物的方法，该方法通过使式(III)化合物
其中R1和R2独立地选自氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-戊基、3-戊基、新戊基、正己基、2-己基和3-己基，或者R1和R2相连接并且，与它们所连接的碳原子一起形成4至7元环烷基环，
与式(II)化合物(其为4-氯-N-甲基-2-吡啶羧酰胺)在碱的存在下反应，
随后加入酸以生成式(IV)化合物。
在制备式(IV)化合物的方法的优选的实施方案中，式(III)化合物在适合的有机溶剂的溶液中使用并且是通过使4-氨基-3-氟苯酚与式(VI)化合物反应形成的，
其中R1和R2独立地选自氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-戊基、3-戊基、新戊基、正己基、2-己基和3-己基，或者R1和R2相连接并且，与它们所连接的碳原子一起形成4至7元环烷基环。
在制备式(IV)化合物的方法的进一步优选的实施方案中，式(II)化合物在适合的有机溶剂的溶液中使用，所述溶液是通过用碱，优选用氢氧化钠，更优选用氢氧化钠的水溶液中和式(II)化合物的盐酸盐制备的。
在制备式(IV)化合物的方法中，4-氨基-3-氟苯酚与式(VI)化合物在20°至最高达回流温度的温度，优选在50℃至最高达回流温度的温度，最优选在式(VI)化合物的回流温度下反应，所述式(VI)化合物可以过量使用并作为溶剂。任选地，可以加入另外的不同的溶剂，诸如甲苯、乙酸乙酯、环己烷或其混合物。可以通过任选在减压条件下共沸蒸馏除去挥发性反应组分。所形成的式(III)化合物可以在适合的有机溶剂的溶液中(优选在1-甲基-2-吡咯烷酮溶液中)使用，并在碱的存在下用4-氯-N-甲基-2-吡啶羧酰胺(优选在与适合的有机溶剂的溶液中使用，更优选在1-甲基-2-吡咯烷酮溶液中使用)处理。将反应混合物加热至50℃至最高达150℃的温度，优选80℃至最高达120℃的温度。在1至5h之后，优选2至4h之后，将温度调节至50℃至最高达90℃，优选70℃至最高达90℃，并加入酸(优选于水中的乙酸)。冷却之后，优选冷却至0℃至10℃的温度，并且任选地用式(IV)化合物的晶体播种，可以通过沉淀分离式(IV)化合物。
优选式(VI)化合物，其中R1和R2独立地选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或者R1和R2相连接并且，与它们所连接的碳原子一起形成4至7元环烷基环。更优选式(VI)化合物选自4-甲基-2-戊酮、3-甲基-2-丁酮、2-丁酮、2-戊酮、4-庚酮、2,4-二甲基-3-戊酮和环己酮。
在制备式(IV)化合物的方法中合适的有机溶剂包括但不限于1-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲亚砜、环丁砜或所提及的溶剂的混合物。优选使用1-甲基-2-吡咯烷酮和/或二甲基甲酰胺。
在制备式(IV)化合物的方法中适合的碱为碱金属氢氧化物和碱金属醇盐。优选叔丁醇钾。叔丁醇钾优选在溶液中使用，更优选在四氢呋喃溶液中使用。
为了提供高纯度形式的式(II)化合物，将其溶解于适合的有机溶剂中，用通过加入质子物质和酸前体就地生成的酸处理，沉淀为式(II)化合物的盐(优选式(II)化合物的盐酸盐)，并通过加入碱的水溶液中和。
为了该目的，将起始化合物4-氯-N-甲基-2-吡啶羧酰胺溶解于适合的有机溶剂(优选在甲苯中)中，并用就地生成的酸(通过加入质子物质(例如水和/或醇，优选醇)和酸前体(优选酰基氯)例如在5至60分钟内，优选在10至30分钟内，从而就地生成相应的酸)处理。优选首先加入质子物质。4-氯-N-甲基-2-吡啶羧酰胺的盐，优选4-氯-N-甲基-2-吡啶羧酰胺的盐酸盐可以通过沉淀分离。将这样的4-氯-N-甲基-2-吡啶羧酰胺的纯化的盐溶解于适合的有机溶剂(优选在甲苯中)中，并通过加入碱的水溶液(优选氢氧化钠的水溶液)中和。在分离各相之后，任选地减压浓缩有机相，并加入适合的有机溶剂(优选1-甲基-2-吡咯烷酮)以制备一种溶液，其可以直接用于制备式(IV)化合物(如上面所述)。
在制备4-氯-N-甲基-2-吡啶羧酰胺的方法中合适的有机溶剂包括但不限于四氢呋喃、甲苯、乙酸乙酯、二噁烷、甲基叔丁基醚、二甲氧基乙烷、二甲亚砜、二甲基甲酰胺、1-甲基-2-吡咯烷酮或所提及的溶剂的混合物。更优选使用四氢呋喃、甲苯及其混合物。
根据本发明，醇是携带至少一个羟基基团的有机物质。醇包括但不限于甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、仲丁醇、异丁醇、正戊醇、甘油或其混合物。优选将甲醇、乙醇和异丙醇用作本发明方法中的醇。
为了就地制备酸，适合的前体包括但不限于有机酰卤，优选酰基卤，诸如酰基氯和酰基溴，更优选乙酰氯、乙酰溴、丙酰氯或丙酰溴，最优选乙酰氯。
优选在没有水的情况下就地制备所述酸。
可供选择的方式是，式(II)化合物及其盐酸盐可以按照描述于WO2005009961或Bankston等人(Organic Process Research&Development,2002,6,777-781)中的方法来制备。.式(V)化合物(其为异氰酸(4-氯-3-三氟甲基-苯基)酯)可以按照描述于WO2000042012中的方法制备。
根据本发明第三方面的药物组合物，其是呈片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂等制剂形式。
根据本发明第三方面的药物组合物，其中包括：活性药物化合物、稀释剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂；所述活性药物化合物为以下式(I)化合物或其盐、一水合物：
根据本发明第三方面的药物组合物，其为固体药物组合物。
根据本发明第三方面的药物组合物，其为呈片剂形式的固体药物组合物。
根据本发明第三方面的药物组合物，其中所述稀释剂包括但不限于：磷酸氢钙、高岭土、糊精、乳糖、甘露醇、蔗糖、微晶纤维素、粉末化纤维素、沉降碳酸钙、山梨醇和淀粉及其衍生物(例如玉米淀粉、土豆淀粉、可压性淀粉、改良淀粉、预胶化淀粉等)、赤藻糖醇、木糖醇、果糖等等以及它们的组合。
根据本发明第三方面的药物组合物，其中包含的活性药物化合物以式(I)化合物计为40重量份，所述稀释剂的量为50～500重量份；例如所述稀释剂的量为50～400重量份；例如所述稀释剂的量为50～300重量份；例如所述稀释剂的量为50～200重量份。
根据本发明第三方面的药物组合物，其中所述崩解剂包括但不限于：低取代羟丙基纤维素、交联聚维酮、交联羧甲基淀粉钠、淀粉羟基乙酸钠、交联羧甲基纤维素钠等等以及它们的组合。
根据本发明第三方面的药物组合物，其中包含的活性药物化合物以式(I)化合物计为40重量份，所述崩解剂的量为50～500重量份；例如50～400重量份；例如50～300重量份；例如50～200重量份。
根据本发明第三方面的药物组合物，其中所述粘合剂例如但不限于：羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(分子量为5000～50000的PVP，例如PVP K15、PVP K17、PVP K25、PVP K30等)、聚乙烯醇、阿拉伯胶、海藻酸、海藻酸钠、明胶等等以及它们的组合。更优选的包括羟丙基纤维素，羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙烯醇。
根据本发明第三方面的药物组合物，其中包含的活性药物化合物以式(I)化合物计为40重量份，所述粘合剂的量为50～500重量份；例如50～400重量份；例如100～300重量份；例如100～200重量份。粘合剂可以通过干法加入，并采用典型的干法制粒压片法制备片剂；粘合剂可以通过干法加入，并采用水或含水乙醇为润湿剂对整个物料进行湿法制粒然后再制备片剂；粘合剂还可以使用水或含水乙醇配成溶液作为粘合剂溶液，接着以该粘合剂溶液进行湿法制粒然后再制备片剂；粘合剂还可以与活性药物一起溶解于适宜的溶剂(例如乙醇和/或丙酮)中，再将该溶液经喷雾干燥工艺添加到稀释剂和/或崩解剂中。这些不同种类的粘合剂加入方式都是本领域技术人员公知的，并且是容易做到的。
根据本发明第三方面的药物组合物，其中所述润滑剂在本领域亦可称为助流剂，通常将其统称为润滑剂。润滑剂包括但不限于：硬脂酸镁、硬脂酸、硬脂酸钙、硬脂酸锌、液状石蜡、聚乙二醇、二氧化硅、胶体二氧化硅、微粉硅胶、滑石粉、淀粉、氢化植物油等等或其组合。
根据本发明第三方面的药物组合物，其中包含的活性药物化合物以式(I)化合物计为40重量份，所述润滑剂的量为1～50重量份；例如所述润滑剂的量为1～25重量份；例如所述润滑剂的量为1～20重量份；例如所述润滑剂的量为1～10重量份；例如所述润滑剂的量为2～8重量份。
根据本发明第三方面的药物组合物，其中所述式(I)化合物的药学可接受的盐包括传统的无毒的盐，例如通过本领域熟知的方法从无机或有机酸获得的盐。例如式(I)化合物的硫酸盐、磷酸盐、三氟甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、1-萘磺酸盐、三氟乙酸盐、苹果酸盐、富马酸盐、苯甲酸盐、水杨酸盐、苯乙酸盐、醋酸盐、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天门冬氨酸盐、安息香酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、肉桂酸盐、环戊丙酸盐、双葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、羟乙磺酸、延胡索酸盐、葡糖庚酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙烷磺酸盐、衣康酸盐、乳酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲烷磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯丙酸盐、苦味酸盐、三甲基乙酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、磺酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸和十一酸盐在内的酸加成盐。
根据本发明第三方面的药物组合物，其中所述式(I)化合物或其药用盐的溶剂合物可以是其任何药用溶剂合物。例如式(I)化合物的水合物，例如式(I)化合物的一水合物等。
根据本发明第三方面的药物组合物，其中所述式(I)化合物或其药用盐的多晶型，可以是现有技术公开的任何晶型，例如已知的式(I)化合物的I晶型，等等。
根据本发明第三方面的药物组合物，其是通过常规的制剂工艺制备得到的。
根据本发明第三方面的药物组合物，其是呈包衣片剂的形式。
根据本发明第三方面的药物组合物，其是呈包衣片剂的形式，所述的衣层是薄膜衣。
根据本发明第三方面的药物组合物，其中所述的衣层占片剂总重量的1～5％，例如1～4％，例如2～3％。
根据本发明第三方面的药物组合物，其中所述衣层的包衣材料的主要成膜材料选自：乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素和甲基丙烯酸-烷基丙烯酸酯共聚物；进一步地，包衣材料的主要成膜材料是羟丙基甲基纤维素，例如是其含水分散体；进一步地，包衣材料是是羟丙基甲基纤维素含水分散体；进一步地，包衣材料选自和
根据本发明第三方面的药物组合物，其中所述衣层的包衣材料的主要成膜材料是聚乙烯醇。在一个实施方案中，它们可以用水根据本领域的常规用量在对片剂包衣前临时进行配制，亦可以容易地从市场购得。例如，可以从卡乐康公司购得，例如薄膜包衣预混配方，例如粉针又例如，可以从爱勒易医药材料公司购得，例如系列产品，例如一种典型的包衣材料组成包括：着色剂(例如氧化铁红和/或氧化铁黄或其它)、磷脂(例如豆磷脂)、聚乙二醇(例如聚乙二醇3350)、聚乙烯醇、滑石粉、二氧化钛等。例如从卡乐康公司购得的粉色其中含有部分水解的聚乙烯醇(占混合物总重量的44％)、PEG3350(占混合物总重量的12.4％)、豆磷脂、氧化铁(氧化铁红和氧化铁黄)、滑石粉、二氧化钛。
本发明组合物的用途
本发明提供了能调节涉及raf、VEGFR、PDGFR、p38和/或flt-3激酶的一条或多条信号转导途径的药物组合物。Raf是参与包括细胞生长、细胞存活和侵入在内的许多重要的细胞过程的调控的重要的信号分子。它是Ras/raf/MEK/ERK途径成员。这一途径存在于大部分肿瘤细胞中。VEGFR、PDGFR和flt-3是跨膜的受体分子，当其受到适当的配体刺激会触发Ras/raf/MEK/ERK细胞信号途径，导致细胞内级联反应。这些受体分子都具有酪氨酸激酶活性。
VEGFR受体受血管内皮生长因子(VEGF)刺激，并且是内皮细胞发育和功能调节中的重要控制点。PDGFβ受体在包括间叶细胞在内的多种细胞类型中调节细胞增殖和存活。Flt-3是FL配体的受体。其结构类似于c-kit，并调节多能造血细胞的生长，从而影响T细胞、B细胞和树突细胞的发育。
包括野生型和突变型在内的raf、VEGFR、PDGFR、p38和/或flt-3的任何基因或异构体可以按照本发明进行调节。Raf或raf-l激酶是丝氨酸/苏氨酸激酶家族，它包括至少3个家族成员(a-raf、b-raf和c-raf或raf-1)。C-raf和b-raf是本发明所述药物组合物的优选靶点。在包括黑素瘤在内的多种肿瘤中鉴别了b-raf的激活突变(例如V599E突变体)，并且这里所描述的药物组合物可以用于抑制其活性。
术语“调节”是指与所述药物组合物不存在时的正常活性相比改变了所述途径(或其组分)的功能活性。这一作用包括任何数量或程度上的调节，这包括提高、激活、增强、增加、促进、刺激、降低、阻碍、抑制、减少、减小、拮抗等等。
本发明所述药物组合物也可以调节以下一个或多个过程，这些过程包括但不限于例如细胞生长(包括例如分化、细胞存活和/或增殖)、肿瘤细胞生长(包括例如分化、细胞存活和/或增殖)、肿瘤消退、内皮细胞生长(包括例如分化、细胞存活和/或增殖)、血管生成(血管生长)、淋巴管生成(淋巴管生长)和/或造血功能(例如T细胞和B细胞发育、树突细胞发育等等)。
虽然不希望受到任何作用机理或机制的束缚，已经发现本发明所述药物组合物具有调节激酶活性的能力。然而，本发明所述的方法不局限于任何具体机制或所述药物组合物如何实现其治疗作用。术语“激酶活性”是指其中将一个γ磷酸根从三磷酸腺苷(ATP)转移到蛋白底物中的一个氨基酸残基(例如丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸)上的催化活性。药物组合物可以调节激酶活性，例如通过直接与ATP竞争激酶的ATP结合位点抑制其活性、通过在酶的结构上产生构象变化影响其活性(例如通过破坏具有生物学活性的三维结构)等等。
使用常规检测方法可以对激酶活性进行常规测定。激酶检测系统通常包括激酶、底物、缓冲液和检测系统组分。典型的激酶检测方法包括蛋白激酶与底物肽和如P-ATP的ATP反应以产生磷酸化的终产物(例如在使用底物肽时的磷酸化蛋白)。可以使用任何适当的方法对最终产物进行检测。当使用放射性ATP时，使用亲和膜或凝胶电泳可以将放射性标记的磷酸化蛋白与未反应的γ-32P-ATP分离，并随后使用放射自显影在凝胶上显影或使用闪烁计数器检测。也可以使用非放射性方法。可以使用识别磷酸化底物的抗体(例如抗磷酸酪氨酸抗体)。例如，激酶可以与底物在存在ATP和激酶缓冲液并且所述激酶有效磷酸化所述底物的条件下孵育。可以分离反应混合物(例如通过电泳)，并随后可以检测底物的磷酸化(例如通过使用抗磷酸酪氨酸抗体的免疫印迹法)。所述抗体可以用可检测的标记物标记(例如诸如HRP的酶、亲和素或生物素、化学发光试剂等等)。其他的方法可以采用ELISA、亲和膜分离、荧光偏振法、发光法等等。
放射性形式之外的另一种方法是时间分辨荧光共振能量传递(TR-FRET)。所述方法按照常规激酶反应，其中底物(例如生物素化的聚(谷氨酸酪氨酸))被蛋白磷酸在ATP存在的条件下磷酸化。最终产物随后可以用铕螯合的磷酸特异性抗体(抗磷酸酪氨酸或磷酸丝氨酸/苏氨酸)和与生物素化底物结合的链亲和素-APC进行检测。上述两个组分在结合时在空间上靠近，并且从磷酸特异性抗体向受体(SA-APC)的能量传递产生均一形式的荧光读数。
本发明所述药物组合物可以用于治疗和/或预防涉及raf、VEGFR、PDGFR、p38和/或flt-3的一条或更多细胞信号转导途径所介导的任何疾病或病症。术语“治疗”按照其常规意义使用，例如出于抗击、减轻、降低、解除、改善疾病或功能紊乱的症状等等目的对患者进行处理或照顾。所述药物组合物也可以以用于预防和/或治疗由所述信号分子介导的疾病和/或病症进行描述。术语“介导”表示例如所述信号分子是在所述疾病和/或病症中异常或失常的途径的一部分。
可以治疗的疾病和病症包括任何上面和下面所提及的疾病以及：
包括例如细胞增殖紊乱、癌症、肿瘤等等的raf相关疾病；
包括例如癌症、肿瘤生长、炎症疾病、风湿性关节炎、视网膜病、银屑病、肾小球肾病、哮喘、慢性支气管炎、动脉硬化症、移植排斥、涉及血管生成的病症等等的VEGFR-2相关疾病；
括例如癌症、角膜疾病、角膜红肿、角膜移植、淋巴腺增生、涉及淋巴管生成的病症等等VEGFR-3相关疾病；
包括例如特征在于细胞增殖、细胞基质形成、细胞运动和/或细胞外基质形成的疾病或病症的PDGFR-β相关疾病。具体的例子包括例如肿瘤、恶性肿瘤、癌症、癌症转移、慢性骨髓性白血病、炎症、肾病、糖尿病肾病、肾小球膜增生性肾小球肾病、纤维化病症、动脉硬化症、心瓣再狭窄、高血压相关动脉硬化、静脉搭桥移植动脉硬化、硬皮病、间质性肺病、滑液病、关节炎、白血病、淋巴瘤等等；
包括例如免疫相关疾病、血细胞疾病、涉及造血细胞(例如T细胞、B细胞、树突状细胞)发育的病症、癌症、贫血、HIV、获得性免疫缺陷症等等的Flt-3相关疾病；
包括炎症疾病、免疫调节疾病以及其他与异常的细胞因子(特别是TNFα)产生或异常的MMP活性相关的其他疾病的p38相关疾病。这些疾病包括但不限于风湿性关节炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、骨质疏松症、克罗恩病和银屑病。
此外，本发明所述药物组合物可以用于治疗例如下列的病症和疾病：肾小球硬化、间质性肾炎、间质性肺纤维病、动脉硬化症、伤口瘢痕和硬皮病。
本发明所述药物组合物也具有广泛的治疗活性用以治疗或预防各种疾病的进展，这些疾病诸如炎症病症、冠状动脉再狭窄、肿瘤相关血管生成、动脉硬化症、自身免疫病、炎症、与肾小球或肾小球膜细胞增殖相关的某些肾病、以及与视网膜血管增殖相关的眼病、银屑病、肝硬化、糖尿病、动脉硬化症、再狭窄、血管移植再狭窄、支架内再狭窄、血管生成、眼病、肺纤维病、闭塞性细支气管炎、肾小球肾病、风湿性关节炎。
本发明也为以下一种或多种人和/或其他哺乳动物的病症提供了治疗、预防、调节等等：包括糖尿病视网膜病、缺血性视网膜静脉闭塞、早产视网膜病和老年黄斑病变的视网膜病；风湿性关节炎、银屑病、或与皮下水泡形成相关的大疱病(包括大疱性类天疱疮、多形红斑或疱疹样皮炎)、风湿热、骨吸收、绝经后骨质疏松症、脓血症、格兰氏阴性脓血症、脓血性休克、内毒素休克、毒素休克综合征、系统性炎症反应综合征、炎性肠病(克罗恩病和溃疡性结肠炎)、赫克斯海默反应、哮喘、成人呼吸窘迫症候群、急性肺部纤维化病、肺结节病、过敏性呼吸病、硅肺病、煤矿工人肺尘症、肺泡损伤、肝衰竭、急性炎症中的肝病、重症酒精性肝炎、疟疾(恶性疟原虫疟疾和脑部疟疾)、非胰岛素依赖型糖尿病(NEDDM)、充血性心脏衰竭、心脏病后损伤、动脉硬化症、阿尔茨海默病、急性脑炎、脑损伤、多发性硬化(多发性硬化中的脱髓鞘和寡树突状细胞缺失)、晚期癌症、恶性淋巴癌、胰腺炎、感染中伤口愈合弱化、炎症和癌症、骨髓增生异常综合征、系统性红斑狼疮、胆汁性肝硬化、肠坏死、辐射伤/给予单克隆抗体后的毒性、宿主-移植物反应(缺血-再灌注损伤以及肾脏、肝脏、心脏和皮肤同种异体移植排斥)、肺同种异体移植排斥(闭塞性支气管炎)、整体髋关节置换并发症、以及选自肺结核、胃溃疡病中的幽门螺杆菌感染、枯氏锥虫感染引起的夏格氏病、大肠杆菌感染引起的志贺样毒素作用、葡萄球菌感染引起的肠毒素A作用、脑膜炎感染的感染性疾病、以及莱姆病螺旋体、钩端螺旋体、细胞巨大病毒、流感病毒、泰勒脑脊髓炎病毒和人免疫缺陷病毒(HIV)引起的感染、乳头状瘤、芽状神经胶质瘤、卡波济氏肉瘤、黑素瘤、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、星细胞瘤、头癌、颈癌、膀胱癌、乳癌、结肠直肠癌、甲状腺癌、胰腺癌、胃癌、肝细胞癌、白血病、淋巴瘤、霍奇金病、伯基特病、关节炎、风湿性关节炎、糖尿病视网膜病、血管生成、再狭窄、支架内再狭窄、血管移植再狭窄、肺纤维化、肝硬化、动脉硬化症、肾小球肾病、糖尿病肾病、移植排斥、银屑病、糖尿病、伤口愈合、炎症、以及神经变性病、过度免疫病、血管瘤、心肌血管生成、冠状及脑侧突血管形成、缺血、角膜病、虹膜病、新生血管性青光眼、早产黄斑病变视网膜病、伤口愈合、幽门螺杆菌溃疡相关疾病、骨折、子宫内膜异位、糖尿病症状、猫抓热、甲状腺肥大、哮喘或烧伤后浮肿、外伤、慢性肺病、中风、息肉、囊肿、滑膜炎、慢性及过敏性炎症、卵巢高刺激综合征、肺部和脑部水肿、瘢痕瘤、纤维症、硬化、腕管综合征、成年呼吸窘迫综合征、腹水、眼病、心血管病、克-富(POEMS)综合征、克罗恩病、肾小球肾病、骨关节炎、多发性硬化、移植物排斥、莱姆关节炎、脓血症、冯希-林二氏综合征、类天疱疮、佩吉特病、多囊肾病、肉状瘤病、甲状腺炎、高粘稠度综合征、Osier-Weber-Rendir病、慢性闭塞性肺病、辐射、缺氧、先兆子痫、月经过多、子宫内膜异位、单纯疱疹感染、缺血性视网膜病、角膜血管生成、带状疱疹、人免疫缺陷病毒、副痘病毒、原生动物、弓形虫病以及肿瘤相关的渗出和水肿。
本发明所述的药物组合物可以具有一种以上的所述活性并因此可以针对多条信号转导途径。因此，这些药物组合物可以实现通常只能在使用不同药物组合物组合时才能获得的治疗和预防效果。例如，通过使用单一药物组合物抑制新导管形成(例如与VEGFR-2和VEGFR-3功能相连的)(例如血管和/或淋巴管)和细胞增殖(例如与raf和PDGFRβ功能相连的)在治疗癌症以及其他由新的血管形成而促进的细胞增殖异常中尤其有用。因此，本发明尤其涉及了至少具有抗细胞增殖和抗血管生成(即抑制血管生成)活性的药物组合物。按照本发明可以对任何受益于导管生长和细胞增殖抑制的疾病或病症进行治疗。由于可以更精确地定义其活性范围，使用单一药物组合物也是有利的。
本发明药物组合物可以对任何肿瘤进行治疗，这些肿瘤包括但不限于在raf、ras和/或flt-3中及其所参与的信号途径的任何上游或下游成员中具有一个或多个突变的肿瘤。如先前所述，肿瘤可以用本发明所述药物组合物进行治疗而不考虑其所对应的机制。可以对任何器官的肿瘤进行治疗，这包括但不限于例如结肠癌、胰腺癌、乳癌、前列腺癌、骨癌、肝癌、肾癌、肺癌、睾丸癌、皮肤癌、胃癌、结肠直肠癌、肾细胞癌、肝细胞癌、黑素瘤等等。
乳癌的例子包括但不限于浸润性导管癌、浸润性小叶癌、原位导管癌和原位小叶癌。
呼吸道癌的例子包括但不限于小细胞及非小细胞肺癌、以及支气管腺瘤和胸膜肺母细胞瘤。
脑癌的例子包括但不限于脑干和垂体神经胶质瘤、小脑和大脑星细胞瘤、成神经管细胞瘤、室鼓膜瘤以及神经外胚瘤和松果腺瘤。
男性生殖器官肿瘤包括但不限于前列腺癌和睾丸癌。女性生殖器官肿瘤包括但不限于子宫内膜癌、宫颈癌、卵巢癌、阴道癌和外阴癌以及子宫肉瘤。
消化道肿瘤包括但不限于肛门癌、结肠癌、结肠直肠癌、食道癌、胆囊癌、胃癌、直肠癌、小肠癌以及唾液腺癌。
尿道系统肿瘤包括但不限于膀胱癌、阴茎癌、肾癌、肾盂癌、输尿管癌以及尿道癌。
眼癌包括但不限于眼内黑素瘤和成视网膜细胞瘤。
肝癌的例子包括但不限于肝细胞癌(具有或不具有纤维板层形式的肝细胞癌)、胆管细胞癌以及混合型肝细胞胆管细胞癌。
皮肤癌包括但不限于鳞状细胞瘤、卡波西肉瘤、恶性黑素瘤、梅克尔细胞皮肤癌以及非黑素瘤皮肤癌。
头颈癌包括但不限于喉癌、下咽癌、鼻咽癌和/或口咽癌以及嘴唇和口腔癌。
淋巴瘤包括但不限于AIDS相关淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金病以及中枢神经系统淋巴瘤。
肉瘤包括但不限于软组织肉瘤、骨肉瘤、恶性纤维性组织细胞瘤、淋巴肉瘤以及横纹肌肉瘤。
白血病包括但不限于急性骨髓白血病、急性成淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病以及绒毛细胞白血病。
除了抑制肿瘤细胞增殖，本发明所述药物组合物也能引起肿瘤消退，例如肿瘤大小的减小或肿瘤在体内分布范围的降低。
具体实施方式
所提供的以下实施例仅用于解释目的而不是用于，也不应被解释为以任何方式限制本发明。使用Bruker的光谱仪在室温记录1H-NMR谱。将氘代二甲亚砜用作溶剂，所述溶剂包括四甲基硅烷作为内标(如果没有另外提及的话)。使用沃特斯和Applied Biosystems的光谱仪记录MS谱。给出了相对信号强度(以基于主峰的百分比表示)。使用惠谱HP1100进行HPLC。确定的条件伴随各自的工作实施例给出。
实施例1：4-{4-[({[4-氯-3-(三氟甲基)-苯基]氨基}羰基)氨基]-3-氟苯氧基}- N-甲基吡啶-2-羧酰胺、其盐酸盐和其一水合物的制备
阶段1：
4-氯-N-甲基-吡啶-2-羧酰胺盐酸盐：
将420g的4-氯-N-甲基吡啶-2-羧酰胺(根据WO2006/034796制备的)于甲苯中的溶液(大约30％w/w)和48.8g乙醇加入至反应烧瓶中。在搅拌以达到反应混合物的温度不超过30℃的程度的条件下加入67.2g乙酰氯。在室温下进一步搅拌1.5h之后，将产物滤出，用甲苯(212g)洗涤并减压干燥(30℃，80mbar)。以此方式，得到156.3g(定量收率)4-氯-N-甲基-吡啶-2-羧酰胺盐酸盐。熔点173.7-174.5℃。
1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)：δ[ppm]＝2.96(d，3H)，7.79-7.97(m，1H)，8.13-8.26(m，1H)，8.73(d，1H)，9.06(br.s.，1H)，13.16(br.s.，1H).
MS[DCI,NH3]:m/e＝171[M+H]+(M＝游离碱)。
HPLC：固定相：Nucleodur Gravity C18(150mm长，3mm ID，3.0μm粒径)；流动相A：1.15g磷酸氢二铵+0.68mL邻-磷酸(85％于水中的溶液)/lL水；流动相B：乙腈；UV检测：在254nm；烘箱温度：45℃，注射体积：3μl，流速：0.5mL/min.；线性梯度：5％B->80％B(20min.)，在80％B的10分钟保留时间；纯度：>98％(Rt＝17.8min.)。
阶段2：
4-(4-氨基-3-氟苯氧基)-N-甲基吡啶-2-羧酰胺
方法2a：
向具有搅拌器的反应烧瓶中加入41.4g的4-氯-N-甲基-吡啶-2-羧酰胺盐酸盐和作为溶剂的100g甲苯。在加入68.4g水和19.6g氢氧化钠水溶液(45％w/w)之后，将反应混合物搅拌30分钟。将两相分离并弃去水层。将有机层经真空蒸馏浓缩并将甲苯用1-甲基-2-吡咯烷酮(70g)取代，得到4-氯-N-甲基-吡啶-2-羧酰胺于1-甲基-2-吡咯烷酮中的溶液。
向具有搅拌器的第二反应烧瓶中加入26.7g的4-氨基-3-氟苯酚和100g的4-甲基-2-戊酮。通过加热至回流并额外搅拌1小时，经共沸蒸馏除去水。然后将过量的4-甲基-2-戊酮经真空蒸馏除去并用1-甲基-2-吡咯烷酮(70g)取代以制备含有根据式(III)的亚胺化合物的溶液。向所得反应混合物中加入4-氯-N-甲基-吡啶-2-羧酰胺于1-甲基-2-吡咯烷酮中的溶液。将反应混合物加热至大约100℃。滴加(在大约70分钟内)123.2g叔丁醇钾于四氢呋喃中的溶液(20％w/w)，同时经蒸馏除去四氢呋喃。其后，将反应混合物在100℃搅拌额外的3小时以完成反应。在调节至80℃之后，加入350ml甲苯、392ml水和8g乙酸。将混合物在80℃搅拌10分钟，冷却至50℃并用4-(4-氨基-3-氟苯氧基)-N-甲基吡啶-2-羧酰胺的晶体播种。在冷却至0℃之后，将混悬液搅拌大约30分钟。将产物滤出，用甲醇/水(1:3v/v，144ml)洗涤并减压干燥(30℃，80mbar)。以此方式，得到40.4g(理论值的78％)4-(4-氨基-3-氟苯氧基)-N-甲基吡啶-2-羧酰胺，为棕色晶体。
熔点140.8-141.4℃
1H-NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ[ppm]＝2.87(d，3H)，5.24-5.35(s，2H)，6.80-6.85(m，1H)，6.87-6.99(m，1H)，7.01-7.09(m，1H)，7.09-7.14(m，1H)，7.45(d，1H)，8.49(d，1H)，8.75-8.85(m，1H).MS[ES]：m/e＝262[M+H]+
HPLC：固定相：Agilent Zorbax SB-AQ(150mm长，3mm ID，3.5μm粒径)；流动相A：1.40g磷酸氢二钾+5.8ml邻-磷酸(8.5％于水中的溶液)/lL水；流动相B：乙腈；UV检测：在268nm；烘箱温度：50℃，注射体积：3μl，流速：0.8mL/min；在两个步骤中的线性梯度：10％B->37％B(10min.)，37％B->80％B(10min.)，在80％B的10分钟保留时间；纯度：>97％(Rt＝9.22min.)。
方法2b：
向具有搅拌器的反应烧瓶中加入41.4g的4-氯-N-甲基-吡啶-2-羧酰胺盐酸盐和作为溶剂的100g甲苯。在加入68.4g水和19.6g氢氧化钠水溶液(45％w/w)之后，将反应混合物搅拌30分钟。将两相分离并弃去水层。将有机层经真空蒸馏浓缩并将甲苯用1-甲基-2-吡咯烷酮(70g)取代，得到4-氯-N-甲基-吡啶-2-羧酰胺于1-甲基-2-吡咯烷酮中的溶液。
向具有搅拌器的第二反应烧瓶中加入26.7g的4-氨基-3-氟苯酚和100g的3-甲基-2-丁酮。通过加热至回流并额外搅拌3小时，经共沸蒸馏除去水。然后将过量的3-甲基-2-丁酮经真空蒸馏除去并用1-甲基-2-吡咯烷酮(70g)取代以制备含有根据式(III)的亚胺化合物的溶液。向所得反应混合物中加入4-氯-N-甲基-吡啶-2-羧酰胺于1-甲基-2-吡咯烷酮中的溶液。将反应混合物加热至大约100℃。滴加123.2g叔丁醇钾于四氢呋喃中的溶液(20％w/w)(在大约3小时内)，同时经蒸馏除去四氢呋喃。其后，将反应混合物在100℃搅拌额外的2.5小时以完成反应。在调节至80℃之后，加入350ml甲苯、392ml水和8g乙酸。将混合物在80℃搅拌10分钟，冷却至50℃并用4-(4-氨基-3-氟苯氧基)-N-甲基吡啶-2-羧酰胺的晶体播种。在冷却至0℃之后，将混悬液搅拌大约30分钟。将产物滤出，用甲醇/水(1:3v/v，144ml)洗涤并减压干燥(30℃，80mbar)。以此方式，得到44.6g(理论值的84％)4-(4-氨基-3-氟苯氧基)-N-甲基吡啶-2-羧酰胺，为淡棕色晶体。熔点141.9-142.6℃。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ[ppm]＝2.83(d，3H)，5.27(s，2H)，6.77-6.83(m，1H)，6.86-6.94(m，1H)，7.01-7.07(m，1H)，7.09-7.13(m，1H)，7.41(d，1H)，8.49(d，1H)，8.71-8.87(m，1H).MS[ES]：m/e＝262[M+H]+
HPLC：固定相：Agilent Zorbax SB-AQ(150mm长，3mm ID，3.5μm粒径)；流动相A：1.40g磷酸氢二钾+5.8ml邻-磷酸(8.5％于水中的溶液)/lL水；流动相B：乙腈；UV检测：在268nm；烘箱温度：50℃，注射体积：3μl，流速：0.8mL/min；在两个步骤内的线性梯度：10％B->37％B(10min.)，37％B->80％B(10min.)，在80％B的10分钟保留时间；纯度：>99％(Rt＝9.16min.)。
方法2c：
向具有搅拌器的反应烧瓶中加入41.4g的4-氯-N-甲基-吡啶-2-羧酰胺盐酸盐和作为溶剂的100g甲苯。在加入68.4g水和19.6g氢氧化钠水溶液(45％w/w)之后，将反应混合物搅拌30分钟。将两相分离并弃去水层。将有机层经真空蒸馏浓缩并将甲苯用1-甲基-2-吡咯烷酮(70g)取代，得到4-氯-N-甲基-吡啶-2-羧酰胺于1-甲基-2-吡咯烷酮中的溶液。
向具有搅拌器的第二反应烧瓶中加入26.7g的4-氨基-3-氟苯酚、73g环己烷和20.6g环己酮。通过加热至回流并额外搅拌3小时，经共沸蒸馏除去水。然后将溶剂环己烷和过量的环己酮经真空蒸馏除去并用1-甲基-2-吡咯烷酮(70g)取代以制备含有根据式(III)的亚胺化合物的溶液。向所得反应混合物中加入4-氯-N-甲基-吡啶-2-羧酰胺于1-甲基-2-吡咯烷酮中的溶液。将反应混合物加热至大约100℃。滴加(在大约40分钟内)126g叔丁醇钾于四氢呋喃中的溶液(20％w/w)，同时经蒸馏除去四氢呋喃。其后，将反应混合物在100℃搅拌额外的3小时以完成反应。在调节至之80℃后，加入350ml甲苯、392ml水和8g乙酸。将混合物在80℃搅拌10分钟，冷却至50℃并用4-(4-氨基-3-氟苯氧基)-N-甲基吡啶-2-羧酰胺的晶体播种。在冷却至3℃之后，将混悬液搅拌大约30分钟。将产物滤出，用甲醇/水(1:3v/v，144ml)洗涤并减压干燥(30℃，80mbar)。以此方式，得到40.1g(理论值的76％)4-(4-氨基-3-氟苯氧基)-N-甲基吡啶-2-羧酰胺，为淡棕色晶体。
熔点141.4℃
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ[ppm]＝2.84(d，3H)，5.27(s，2H)，6.78-6.85(m，1H)，6.86-6.94(m，1H)，7.01-7.04(m，1H)，7.09-7.14(m，1H)，7.45(d，1H)，8.49(d，1H)，8.71-8.87(m，1H).MS[ES]：m/e＝262[M+H]+
HPLC：固定相：Agilent Zorbax SB-AQ(150mm长，3mm ID，3.5μm粒径)；流动相A：1.40g磷酸氢二钾+5.8ml邻-磷酸(8.5％于水中的溶液)/lL水；流动相B：乙腈；UV检测：在268nm；烘箱温度：50℃，注射体积：3μl，流速：0.8mL/min；在两个步骤内的线性梯度：10％B->37％B(10min.)，37％B->80％B(10min.)，在80％B的10分钟保留时间；纯度：>98％(Rt＝9.14min.)。
阶段3：制备4-{4-[({[4-氯-3-(三氟甲基)-苯基]氨基}羰基)氨基]-3-氟苯氧 基}-N-甲基吡啶-2-羧酰胺一水合物(一水合物)
向具有搅拌器的反应烧瓶中加入20.0g的阶段2方法2a制得的4-(4-氨基-3-氟苯氧基)-N-甲基吡啶-2-羧酰胺(即式(IV)化合物)、冰乙酸(式(IV)化合物与冰乙酸的摩尔比为1:0.15)和作为溶剂的180g四氢呋喃。在室温在大约90分钟内滴加18.7g异氰酸(4-氯-3-三氟甲基-苯基)酯和21.1g甲苯的溶液。将所得溶液搅拌3小时以完成反应。然后将30g四氢呋喃和7.8g甲醇加入至反应混合物中。然后在15分钟内将9.0g乙酰氯滴加至反应混合物中。在额外搅拌大约2小时之后，将混悬液过滤并将固体用四氢呋喃(18.2g)和丙酮(136.4g)洗涤。在40℃将固体加入至丙酮(268.6g)、水(55.8g)和氢氧化钠水溶液(8.2g，45％w/w)的混合物中。将混合物搅拌额外的30分钟。然通过用4-{4-[({[4-氯-3-(三氟甲基)-苯基]氨基}羰基)氨基]-3-氟苯氧基}-N-甲基吡啶-2-羧酰胺一水合物的晶体播种引发结晶。在冷却至20℃之后，加入31.6g水。将混悬液冷却至大约3℃并搅拌30分钟。将产物滤出，用丙酮(106g)和水(44g)的冷的混合物洗涤并减压干燥(30℃，80mbar)。以此方式，得到31.6g(理论值的83％)4-{4-[({[4-氯-3-(三氟甲基)-苯基]氨基}羰基)氨基]-3-氟苯氧基}-N-甲基吡啶-2-羧酰胺一水合物，为白色晶体。
1H-NMR.(500MHz，甲醇-d4)：δ[ppm]＝2.95(s，3H)，6.96-7.01(m，1H)，7.05-7.11(m，2H)，7.49-7.53(m，1H)，7.55-7.59(m，1H)，7.61-7.65(m，1H)，8.00-8.03(m，1H)，8.15-8.20(m，1H)，8.46-8.50(m，1H).MS[ES]：m/e＝483[M+H]+
本发明使用以下[HPLC-A法]测定各种形式原料药或其制剂中的式(I)化合物含量(即纯度)和相关杂质的含量。[HPLC-A法]如下：
固定相：Eclipse XDB-C8(150mm长，2.1mm ID，3.5μm粒径)；流动相A：1.0g己烷-1-磺酸钠盐+1.0mL三氟乙酸/1L水；流动相B：乙腈；UV检测：在232nm；烘箱温度：43℃，注射体积：3μl，流速：0.5mL/min；在3个步骤内的线性梯度：5％B->36％B(14.5min.)，36％B->44％B(6min.)，44％B->80％B(9.5min.)，在80％B的10分钟保留时间；
按外标法以峰面积计算原料或组合物中式(I)化合物的含量；
按外标法以峰面积计算原料或组合物中式(X)化合物相对于式(I)化合物的相对含量；
式(I)化合物的保留时间约为25.5min；
式(X)化合物相对于式(I)化合物的相对保留时间(RRT)为0.86～0.90。
经测定，以上阶段3获得的式(I)化合物一水合物的药用原料药中的纯度99.82％(即式(I)化合物一水合物占原料药总重量的含量)；
经测定，以上阶段3获得的式(I)化合物一水合物的药用原料药中式(X)化合物相对于式(I)化合物一水合物的相对含量为0.063％(其相对于原料药总重量的含量为0.0631％)。
补充试验1：使用阶段2方法2b制得的4-(4-氨基-3-氟苯氧基)-N-甲基吡啶-2-羧酰胺(即式(IV)化合物)，其它原材料使用与阶段3同一批次的，参考以上“阶段3”的方法，得到式(I)化合物一水合物(收率83％)；经测定，该药用原料药纯度99.94％，式(X)化合物相对含量为0.007％。
补充试验2：使用阶段2方法2c制得的4-(4-氨基-3-氟苯氧基)-N-甲基吡啶-2-羧酰胺(即式(IV)化合物)，其它原材料使用与阶段3同一批次的，参考以上“阶段3”的方法，得到式(I)化合物一水合物(收率81％)；经测定，该药用原料药纯度99.93％，式(X)化合物相对含量为0.016％。
补充试验3：使用与阶段3同一批次的原材料，参考以上“阶段3”的方法，不同的仅是添加的冰乙酸的用量为：式(IV)化合物与冰乙酸的摩尔比为1:0.2，得到式(I)化合物一水合物(收率86％)；经测定，该药用原料药纯度99.86％，式(X)化合物相对含量为0.036％。
补充试验4：使用与阶段3同一批次的原材料，参考以上“阶段3”的方法，不同的仅是添加的冰乙酸的用量为：式(IV)化合物与冰乙酸的摩尔比为1:0.1，得到式(I)化合物一水合物(收率85％)；经测定，该药用原料药纯度99.86％，式(X)化合物相对含量为0.168％。
补充试验5：使用与阶段3同一批次的原材料，参考以上“阶段3”的方法，不同的仅是添加的冰乙酸的用量为：式(IV)化合物与冰乙酸的摩尔比为1:0.5或1:1，得到式(I)化合物一水合物(收率分别为75％和63％)；经测定，该药用原料药纯度99.89％，式(X)化合物相对含量为0.108％和0.094。表明增加冰乙酸用量时并不能有效地提高产物纯度，但却会对产品的收率产生显著的不良影响。
补充试验6：使用与阶段3同一批次的原材料，参考以上“阶段3”的方法，不同的仅是不添加冰乙酸，得到式(I)化合物一水合物(收率84％)；经测定，该药用原料药纯度99.23％，式(X)化合物相对含量为0.47％；
补充试验7：参考以上“补充试验1”的方法，不同的仅是不添加冰乙酸，得到式(I)化合物一水合物(收率82％)；经测定，该药用原料药纯度99.16％，式(X)化合物相对含量为0.63％；
补充试验8：参考以上“补充试验2”的方法，不同的仅是不添加冰乙酸，得到式(I)化合物一水合物(收率83％)；经测定，该药用原料药纯度99.24％，式(X)化合物相对含量为0.44％；
补充试验9：使用与阶段3同一批次的原材料，参考以上“阶段3”的方法，不同的仅是将冰乙酸改为甲酸，得到式(I)化合物一水合物(收率86％)；经测定，该药用原料药纯度99.23％，式(X)化合物相对含量为0.39％。
补充试验10：使用与阶段3同一批次的原材料，参考以上“阶段3”的方法，不同的仅是与乙酰氯原位反应形成酸的甲醇改用乙醇，得到式(I)化合物一水合物(收率76％)；经测定，该药用原料药纯度99.79％，式(X)化合物相对含量为0.057％。
阶段4：制备4-{4-[({[4-氯-3-(三氟甲基)-苯基]氨基}羰基)氨基]-3-氟苯氧 基}-N-甲基吡啶-2-羧酰胺(无水物)
将10.2g阶段4制得的4-{4-[({[4-氯-3-(三氟甲基)-苯基]氨基}羰基)氨基]-3-氟苯氧基}-N-甲基吡啶-2-羧酰胺一水合物在90℃减压干燥(21mbar)3小时，以此方式，得到9.8g的4-{4-[({[4-氯-3-(三氟甲基)-苯基]氨基}羰基)-氨基]-3-氟苯氧基}-N-甲基吡啶-2-羧酰胺，为白色晶体。熔点187.3-188.1℃。
1H-NMR(400MHz，甲醇-d4)：δ[ppm]＝2.94(s，3H)，6.94-7.13(m，3H)，7.51(d，1H)，7.58(d，1H)，7.61-7.67(m，1H)，8.01(d，1H)，8.17(t，1H)，8.45-8.53(m，1H).MS[ES]：m/e＝483[M+H]+
经测定，以上阶段4获得的式(I)化合物无水物的药用原料药中的纯度99.84％；
经测定，以上阶段4获得的式(I)化合物无水物的药用原料药中式(X)化合物相对于式(I)化合物无水物的相对含量为0.054％(其相对于物料中式(I)化合物无水物总重量的含量为0.0541％)。
补充试验例11：参照以上“阶段4”的方法，不同的改用上文补充试验例1至补充试验例10所得各种式(I)化合物一水合物的产物为原料，得到10批式(I)化合物的无水物；经[HPLC-A法]测定，它们分别与其所用一水合物原料在纯度和式(X)化合物相对含量均无明显改变，纯度差异不超过0.1％，式(X)化合物相对含量差异不超过0.003％。
实施例2：原料药的稳定性考察
分别将以上实施例1、其各阶段、及各补充试验例中制备得到的各种不同纯度的式(I)化合物一水合物和式(I)化合物无水物药用原料药用铝塑料复合膜密封包装，置45℃恒温箱中放置4个月以进行高温处置。测定各原料药在0月时以及4月时的纯度和式(X)化合物相对含量，并分别比较每批样品的纯度和式(X)化合物相对含量的变化值，分别以纯度变化值和相对含量变化百分数表征这种变化。两参数的计算式如下：
纯度变化值＝0月纯度-4月纯度
相对含量变化百分数＝[(4月相对含量-0月相对含量)÷0月相对含量]×100％
结果显示：
全部原料药在4月时的纯度与该批原料药在0月时的纯度均无明显变化，纯度变化值均在0.2个百分数范围内，例如阶段3所得式(I)化合物一水合物的药用原料药，其0月时纯度99.82％，4月时纯度99.67％，纯度变化值仅为0.15％，表明从主成分的变化角度讲并未出现明显的降低；但是，式(X)化合物的相对含量变化百分数却呈现与其本身在原料药中的相对含量相关的变化趋势，具体是：对于式(X)化合物相对含量低于0.2％的全部药用原料药，它们的相对含量变化百分数均低于13％，例如阶段3所得式(I)化合物一水合物的药用原料药经高温处置4月后其中式(X)化合物的相对含量变化百分数为8.7％；但是式(X)化合物相对含量大于0.2％的全部药用原料药，它们在经高温处置4月后其中式(X)化合物的相对含量变化百分数均在52～183％范围内，并且式(X)化合物的相对含量越高的原料药其式(X)化合物相对含量变化百分数越大，例如补充试验8产物的式(X)化合物相对含量变化百分数为146％。
实施例3：制备片剂形式的药物组合物
参照WO2014039677A1之19页实施例1之步骤a)、b)、c)的配方和制法，分别使用本发明上文实施例1制备的式(I)化合物一水合物或式(I)化合物无水物的药用原料药为活性成分，制备包衣片剂(每片包含式(I)化合物40mg)。
将所得各片剂分别用铝塑料复合膜密封包装，置45℃恒温箱中放置4个月以进行高温处置。参考以上实施例2中的方法，测定各片剂在0月时以及4月时的式(I)化合物含量和式(X)化合物相对(于式(I)化合物的)含量，并分别比较每批样品的式(I)化合物残余含量和式(X)化合物相对含量的变化值，分别以式(I)化合物残余含量和式(X)化合物相对含量变化百分数表征这种变化。两参数的计算式如下：
式(I)化合物残余含量＝(4月含量÷0月相对含量)×100％
相对含量变化百分数＝[(4月相对含量-0月相对含量)÷0月相对含量]×100％
结果显示：全部片剂在4月时的式(I)化合物残余含量均大于95％，均在95％～99％范围内，表明从活性成分的变化角度讲各片剂无明显的稳定性差异，例如阶段3所得式(I)化合物一水合物药用原料药制成的片剂，其4月时式(I)化合物残余含量为97.8％；但是，式(X)化合物的相对含量变化百分数，却类似于其在原料药中的变化趋势，呈现与其本身在片剂中的相对含量相关的变化趋势，具体是：对于式(X)化合物相对含量低于0.2％的原料药制成的全部片剂，它们的相对含量变化百分数均低于15％，例如阶段3所得式(I)化合物一水合物药用原料药制成的片剂经高温处置4月后其中式(X)化合物的相对含量变化百分数为9.7％；但是式(X)化合物相对含量大于0.2％的原料药制成的全部片剂，它们在经高温处置4月后其中式(X)化合物的相对含量变化百分数均在64～197％范围内，并且式(X)化合物的相对含量越高的片剂其式(X)化合物相对含量变化百分数越大，例如补充试验9产物的式(X)化合物相对含量变化百分数为133％。
以上通过本发明较佳实施例对本发明的精神作了详细阐述。本领域技术人员理解，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何修改、等同变化与修饰，均落在本发明的保护范围内。