《一种金针菇种内原生质体融合方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种金针菇种内原生质体融合方法.pdf（8页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610259227.7 (22)申请日 2016.04.25 (71)申请人 四川省农业科学院土壤肥料研究所 地址 610066 四川省成都市外东狮子山路2 区 (72)发明人 王波 (74)专利代理机构 成都金英专利代理事务所 (普通合伙) 51218 代理人 袁英 (51)Int.Cl. C12N 15/04(2006.01) (54)发明名称 一种金针菇种内原生质体融合方法 (57)摘要 本发明公开了一种金针菇种内原生质体融 合方法， 它包括以下步骤： 分离原生质体、。
2、 标记原 生质体、 原生质体融合、 再生培养融合子和菌种 繁殖， 标记原生质体步骤包括热灭活标记和化学 灭活标记。 本发明通过对金针菇分离原生质体、 标记原生质体、 原生质体融合、 再生培养融合子 和菌种繁殖， 提供了一种金针菇种内原生质体融 合方法， 该方法解决了传统金针菇育种变异幅度 大、 筛选工作量大、 周期长的缺点， 采用本发明方 法标记的原生质体稳定， 获得原生质体融合子数 量多， 本发明方法操作简单、 周期短、 成本低、 适 用于快速选育优良品种。 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 CN 105802953 A 2016.07.27 CN 105802953 A 1.一种金针菇。
3、种内原生质体融合方法， 其特征在于， 它包括以下步骤： S1.分离原生质体： 取亲本金针菇的菌丝体35g放入三角瓶中， 加入原生质体分离酶 制剂10ml， 在2532下放置34h， 用无菌G2漏斗过滤收集滤液于离心管中， 4500 5500rad/min的转速离心812min， 去上清液， 离心管中加入10ml0.6mol/L的硫酸镁， 即为 亲本原生质体悬浮液； 所述分离酶制剂为溶壁酶溶液， 用无菌0.6mol/L的硫酸镁溶液稀释 而成； S2.标记原生质体： S21.热灭活标记： 将装有亲本之一原生质体悬浮液23ml的离心管放入5565的 水浴锅中进行热灭活处理35min， 即为热灭活的原。
4、生质体； S22.化学灭活标记： 将装有另一亲本原生质体悬浮液23ml的离心管中加入质量分 数为1.52%的甲磺酸乙酯1ml， 在2535的温度下处理12h， 45005500rad/min的转 速离心10min， 去除上清液， 在离心管内加入23ml0.6mol/L的硫酸镁， 即为化学灭活的原 生质体； S3.原生质体融合： 将热灭活的原生质体和化学灭活的原生质体混合， 离心机离心去 除上清液， 离心管中加入融合剂2ml， 3035水浴中温育815min， 再次离心去除上清液， 加入4ml0.6mol/L的硫酸镁渗透压稳定剂， 即为原生质体融合混合液； 其中， 所述离心机的 转速为15002。
5、500rad/min， 离心时间为1525min； S4.再生培养融合子： 取步骤S3制备的原生质体融合混合液100 l， 接种在再生培养基 上， 2025下培养1015d； S5.菌种繁殖： 在再生培养基上萌发的菌落中取单个菌落， 接种在菌种繁殖培养基上 培养， 所述培养的条件为： 培养温度2025， 培养时间610d， 即为金针菇原生质体融合 子。 2.如权利要求1所述的一种金针菇种内原生质体融合方法， 其特征在于， 步骤S1中所述 原生质体分离酶制剂的浓度为11.5%， 用0.6mol/L的硫酸镁稀释原生质体分离酶制剂。 3.如权利要求1所述的一种金针菇种内原生质体融合方法， 其特征在于。
6、， 步骤S3中所述 融合剂由下述浓度的组分组成： 40%PEG、 0.05mol/LCaCl2、 0.6mol/L甘露醇， Tris调pH至 88.5。 4.如权利要求1或3所述的一种金针菇种内原生质体融合方法， 其特征在于， 所述融合 剂的温度为2835。 5.如权利要求1所述的一种金针菇种内原生质体融合方法， 其特征在于， 步骤S3中所述 渗透压稳定剂为0.6mol/L的硫酸镁。 6.如权利要求1所述的一种金针菇种内原生质体融合方法， 其特征在于， 步骤S4中所述 再生培养基的配方为： 酵母粉56g、 蛋白胨12g、 蔗糖105g、 琼脂2023g、 水1000ml， pH值 67。 7.。
7、如权利要求1所述的一种金针菇种内原生质体融合方法， 其特征在于， 步骤S5中所述 菌种繁殖培养基的配方为： 酵母粉56g、 葡萄糖2023g、 琼脂2023g、 水1000ml， pH值6 7。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105802953 A 2 一种金针菇种内原生质体融合方法 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 具体涉及一种金针菇种内原生质体融合方法。 背景技术 0002 金针菇学名毛柄金钱菌， 又称毛柄小火菇、 构菌、 朴菇、 冬菇、 朴菰、 冻菌、 金菇、 智 力菇等， 英文为：“EnokiMushroom” 。 植物学名为Flammulinavelutiper(Fr。
8、.)Sing。 因其 菌柄细长， 似金针菜， 故称金针菇， 属伞菌目白蘑科针金菇属， 是一种菌藻地衣类。 金针菇具 有很高的药用食疗作用。 金针菇是主要栽培食用菌之一， 新品种选育是金针菇产业发展的 关键之一， 传统的育种方法为杂交育种和诱变育种， 存在的问题是变异幅度大、 筛选工作量 大、 周期长等缺点， 难以获得优良品种。 0003 原生质体融合是指通过人为的方法， 使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行 融合， 借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。 这种育种方式可以打破微生物的 种界界限， 实现远缘菌株的基因重组， 使遗传物质传递更为完整， 获得更多基因重组的机 会， 从而把更多。
9、优良性状组合到一个单一菌株中。 此项技术受到了国内外广大食用菌是育 种工作者的重视， 尤其我国、 日本和韩国研究进展较快， 先后在种内、 种间、 属间都得到过融 合子。 目前， 我国栽培的金针菇品种需从国外引进， 每年引进的菌种费在4000万元以上， 因 此， 采用原生质体融合技术对金针菇进行优良菌株的筛选是本领域工作人员研究的重点和 难点。 发明内容 0004 本发明的目的在于克服现有技术的缺点， 提供一种金针菇种内原生质体融合方 法。 0005 本发明的目的通过以下技术方案来实现： 一种金针菇种内原生质体融合方法， 它 包括以下步骤： S1.分离原生质体： 取亲本金针菇的菌丝体35g放入三。
10、角瓶中， 加入原生质体分离酶 制剂10ml， 在2532下放置34h， 用无菌G2漏斗过滤收集滤液于离心管中， 4500 5500rad/min的转速离心812min， 去上清液， 离心管中加入10ml0.6mol/L的硫酸镁， 即为 亲本原生质体悬浮液； 所述分离酶制剂为溶壁酶溶液， 用无菌0.6mol/L的硫酸镁溶液稀释 而成； S2.标记原生质体： S21.热灭活标记： 将装有亲本之一原生质体悬浮液23ml的离心管放入5565的 水浴锅中进行热灭活处理35min， 即为热灭活的原生质体； S22.化学灭活标记： 将装有另一亲本原生质体悬浮液23ml的离心管中加入质量分 数为1.52%的甲。
11、磺酸乙酯1ml， 在2535的温度下处理12h， 45005500rad/min的转 速离心10min， 去除上清液， 在离心管内加入23ml0.6mol/L的硫酸镁， 即为化学灭活的原 生质体； 说明书 1/5 页 3 CN 105802953 A 3 S3.原生质体融合： 将热灭活的原生质体和化学灭活的原生质体混合， 离心机离心去 除上清液， 离心管中加入融合剂2ml， 3035水浴中温育815min， 再次离心去除上清液， 加入4ml0.6mol/L的硫酸镁渗透压稳定剂， 即为原生质体融合混合液； 其中， 所述离心机的 转速为15002500rad/min， 离心时间为1525min； 。
12、S4.再生培养融合子： 取步骤S3制备的原生质体融合混合液100 l， 接种在再生培养基 上， 2025下培养1015d； S5.菌种繁殖： 在再生培养基上萌发的菌落中取单个菌落， 接种在菌种繁殖培养基上 培养， 所述培养的条件为： 培养温度2025， 培养时间610d， 即为金针菇原生质体融合 子。 0006 进一步地， 步骤S1中所述原生质体分离酶制剂的浓度为11.5%， 用0.6mol/L的硫 酸镁稀释原生质体分离酶制剂。 0007 进一步地， 步骤S3中所述融合剂由下述浓度的组分组成： 40%PEG、 0.05mol/L CaCl2、 0.6mol/L甘露醇， Tris调pH至88.5。
13、。 0008 进一步地， 所述融合剂的温度为2835。 0009 进一步地， 步骤S3中所述渗透压稳定剂为0.6mol/L的硫酸镁。 0010 进一步地， 步骤S4中所述再生培养基的配方为： 酵母粉56g、 蛋白胨12g、 蔗糖 105g、 琼脂2023g、 水1000ml， pH值67。 0011 进一步地， 步骤S5中所述菌种繁殖培养基的配方为： 酵母粉56g、 葡萄糖20 23g、 琼脂2023g、 水1000ml， pH值67。 0012 本发明具有以下优点： 本发明通过对金针菇分离原生质体、 标记原生质、 原生质体 融合、 再生培养融合子和菌种繁殖， 提供了一种金针菇种内原生质体融合。
14、方法， 该方法解决 了传统金针菇育种变异幅度大、 筛选工作量大、 周期长的缺点， 采用本发明方法标记的原生 质体稳定， 获得原生质体融合子数量多， 本发明方法操作简单、 周期短、 成本低、 适用于快速 选育优良品种。 附图说明 0013 图1为融合子与亲本菌株的拮抗实验结果图； 图2为菌丝形态与细胞核观察鉴定实验结果图。 具体实施方式 0014 下面结合实施例对本发明做进一步的描述， 本发明的保护范围不局限于以下所 述： 实施例1： 一种金针菇种内原生质体融合方法， 它包括以下步骤： S1.分离原生质体： 取亲本金针菇的菌丝体3g放入三角瓶中， 加入原生质体分离酶制 剂10ml， 在25下放置。
15、3h， 用无菌漏斗G2过滤收集滤液于离心管中， 4500rad/min的转速离 心8min， 去上清液， 离心管中加入10ml0.6mol/L的硫酸镁， 即为亲本原生质体悬浮液； 其 中， 所述原生质体分离酶制剂的浓度为1%， 用0.6mol/L的硫酸镁稀释原生质体分离酶制剂； 所述分离酶制剂为溶壁酶溶液， 用无菌0.6mol/L的硫酸镁溶液稀释而成； S2.标记原生质体： 说明书 2/5 页 4 CN 105802953 A 4 S21.热灭活标记： 将装有亲本之一原生质体悬浮液的离心管放入55的水浴锅中进 行热灭活处理3min， 即为热灭活的原生质体； S22.化学灭活标记： 将装有另一亲。
16、本原生质体悬浮液2ml的离心管中加入质量分数为 1.5%的甲磺酸乙酯1ml， 在25的温度下处理1h， 4500rad/min的转速离心10min， 去除上清 液， 在离心管内加入2ml0.6mol/L的硫酸镁， 即为化学灭活的原生质体； S3.原生质体融合： 将热灭活的原生质体和化学灭活的原生质体混合， 离心机离心去 除上清液， 离心管中加入温度为28的融合剂2ml， 30水浴中温育8min， 再次离心去除上 清液， 加入4ml0.6mol/L的硫酸镁渗透压稳定剂， 即为原生质体融合混合液； 其中， 所述离 心机的转速为1500rad/min， 离心时间为15min； 所述融合剂由下述浓度的。
17、组分组成： 40% PEG、 0.05mol/LCaCl2、 0.6mol/L甘露醇， Tris调pH至8； S4.再生培养融合子： 取步骤S3制备的原生质体融合混合液100 l， 接种在再生培养基 上， 20下培养10d； 所述再生培养基的配方为： 酵母粉5g、 蛋白胨1g、 蔗糖105g、 琼脂20g、 水 1000ml， pH值6； S5.菌种繁殖： 在再生培养基上萌发的菌落中取单个菌落， 接种在菌种繁殖培养基上 培养， 所述培养的条件为： 培养温度20， 培养时间6d， 所述菌种繁殖培养基的配方为： 酵母 粉5g、 葡萄糖20g、 琼脂20g、 水1000ml， pH值6， 即为金针菇。
18、原生质体融合子。 0015 实施例2： 一种金针菇种内原生质体融合方法， 它包括以下步骤： S1.分离原生质体： 取亲本金针菇的菌丝体5g放入三角瓶中， 加入原生质体分离酶制 剂10ml， 在32下放置4h， 用无菌G2漏斗过滤收集滤液于离心管中， 5500rad/min的转速离 心12min， 去上清液， 离心管中加入10ml0.6mol/L的硫酸镁， 即为亲本原生质体悬浮液； 其 中， 所述原生质体分离酶制剂的浓度为1.5%， 用0.6mol/L的硫酸镁稀释原生质体分离酶制 剂； 所述分离酶制剂为溶壁酶溶液， 用无菌0.6mol/L的硫酸镁溶液稀释而成； S2.标记原生质体： S21.热灭。
19、活标记： 将装有亲本之一原生质体悬浮液的离心管放入65的水浴锅中进 行热灭活处理5min， 即为热灭活的原生质体； S22.化学灭活标记： 将装有另一亲本原生质体悬浮液3ml的离心管中加入质量分数为 2%的甲磺酸乙酯1ml， 在35的温度下处理2h， 5500rad/min的转速离心10min， 去除上清液， 在离心管内加入23ml0.6mol/L的硫酸镁， 即为化学灭活的原生质体； S3.原生质体融合： 将热灭活的原生质体和化学灭活的原生质体混合， 离心机离心去 除上清液， 离心管中加入温度为35的融合剂2ml， 35水浴中温育15min， 再次离心去除上 清液， 加入4ml0.6mol/L。
20、的硫酸镁渗透压稳定剂， 即为原生质体融合混合液； 其中， 所述离 心机的转速为2500rad/min， 离心时间为25min； 所述融合剂由下述浓度的组分组成： 40% PEG、 0.05mol/LCaCl2、 0.6mol/L甘露醇， Tris调pH至8.5； S4.再生培养融合子： 取步骤S3制备的原生质体融合混合液100 l， 接种在再生培养基 上， 25下培养15d； 所述再生培养基的配方为： 酵母粉6g、 蛋白胨2g、 蔗糖105g、 琼脂23g、 水 1000ml， pH值7； S5.菌种繁殖： 在再生培养基上萌发的菌落中取单个菌落， 接种在菌种繁殖培养基上 培养， 所述培养的条件。
21、为： 培养温度25， 培养时间10d， 所述菌种繁殖培养基的配方为： 酵 母粉6g、 葡萄糖23g、 琼脂23g、 水1000ml， pH值7， 即为金针菇原生质体融合子。 说明书 3/5 页 5 CN 105802953 A 5 0016 实施例3： 一种金针菇种内原生质体融合方法， 它包括以下步骤： S1.分离原生质体： 取亲本金针菇的菌丝体4g放入三角瓶中， 加入原生质体分离酶制 剂10ml， 在27下放置3.5h， 用无菌G2漏斗过滤收集滤液于离心管中， 4800rad/min的转速 离心10min， 去上清液， 离心管中加入10ml0.6mol/L的硫酸镁， 即为亲本原生质体悬浮液；。
22、 其中， 所述原生质体分离酶制剂的浓度为1.2%， 用0.6mol/L的硫酸镁稀释原生质体分离酶 制剂； 所述分离酶制剂为溶壁酶溶液， 用无菌0.6mol/L的硫酸镁溶液稀释而成； S2.标记原生质体： S21.热灭活标记： 将装有亲本之一原生质体悬浮液的离心管放入58的水浴锅中进 行热灭活处理3.5min， 即为热灭活的原生质体； S22.化学灭活标记： 将装有另一亲本原生质体悬浮液2ml的离心管中加入质量分数为 1.8%的甲磺酸乙酯1ml， 在28的温度下处理1.5h， 5000rad/min的转速离心10min， 去除上 清液， 在离心管内加入3ml0.6mol/L的硫酸镁， 即为化学灭。
23、活的原生质体； S3.原生质体融合： 将热灭活的原生质体和化学灭活的原生质体混合， 离心机离心去 除上清液， 离心管中加入温度为30的融合剂2ml， 32水浴中温育10min， 再次离心去除上 清液， 加入4ml0.6mol/L的硫酸镁渗透压稳定剂， 即为原生质体融合混合液； 其中， 所述离 心机的转速为1800rad/min， 离心时间为20min； 所述融合剂由下述浓度的组分组成： 40% PEG、 0.05mol/LCaCl2、 0.6mol/L甘露醇， Tris调pH至8.2； S4.再生培养融合子： 取步骤S3制备的原生质体融合混合液100 l， 接种在再生培养基 上， 22下培养1。
24、2d； 所述再生培养基的配方为： 酵母粉5.3g、 蛋白胨1.2g、 蔗糖105g、 琼脂 21g、 水1000ml， pH值6.5； S5.菌种繁殖： 在再生培养基上萌发的菌落中取单个菌落， 接种在菌种繁殖培养基上 培养， 所述培养的条件为： 培养温度22， 培养时间7d， 所述菌种繁殖培养基的配方为： 酵母 粉5.3g、 葡萄糖22g、 琼脂21g、 水1000ml， pH值6.5， 即为金针菇原生质体融合子。 0017 实施例4： 一种金针菇种内原生质体融合方法， 它包括以下步骤： S1.分离原生质体： 取亲本金针菇的菌丝体4.5g放入三角瓶中， 加入原生质体分离酶 制剂10ml， 在3。
25、0下放置3.8h， 用无菌G2漏斗过滤收集滤液于离心管中， 5200rad/min的转 速离心11min， 去上清液， 离心管中加入10ml0.6mol/L的硫酸镁， 即为亲本原生质体悬浮 液； 其中， 所述原生质体分离酶制剂的浓度为1.4%， 用0.6mol/L的硫酸镁稀释原生质体分离 酶制剂； 所述分离酶制剂为溶壁酶溶液， 用无菌0.6mol/L的硫酸镁溶液稀释而成； S2.标记原生质体： S21.热灭活标记： 将装有亲本之一原生质体悬浮液的离心管放入62的水浴锅中进 行热灭活处理4.5min， 即为热灭活的原生质体； S22.化学灭活标记： 将装有另一亲本原生质体悬浮液2ml的离心管中加。
26、入质量分数为 1.8%的甲磺酸乙酯1ml， 在32的温度下处理1.8h， 5300rad/min的转速离心10min， 去除上 清液， 在离心管内加入2ml0.6mol/L的硫酸镁， 即为化学灭活的原生质体； S3.原生质体融合： 将热灭活的原生质体和化学灭活的原生质体混合， 离心机离心去 除上清液， 离心管中加入温度为32的融合剂2ml， 35水浴中温育14min， 再次离心去除上 清液， 加入4ml0.6mol/L的硫酸镁渗透压稳定剂， 即为原生质体融合混合液； 其中， 所述离 心机的转速为2300rad/min， 离心时间为22min； 所述融合剂由下述浓度的组分组成： 40% 说明书 。
27、4/5 页 6 CN 105802953 A 6 PEG、 0.05mol/LCaCl2、 0.6mol/L甘露醇， Tris调pH至8.5； S4.再生培养融合子： 取步骤S3制备的原生质体融合混合液100 l， 接种在再生培养基 上， 24下培养14d； 所述再生培养基的配方为： 酵母粉5.8g、 蛋白胨1.8g、 蔗糖105g、 琼脂 22g、 水1000ml， pH值6.8； S5.菌种繁殖： 在再生培养基上萌发的菌落中取单个菌落， 接种在菌种繁殖培养基上 培养， 所述培养的条件为： 培养温度24， 培养时间8d， 所述菌种繁殖培养基的配方为： 酵母 粉5.8g、 葡萄糖22g、 琼脂。
28、22g、 水1000ml， pH值6.8， 即为金针菇原生质体融合子。 0018 实施例5： 拮抗实验 鉴定培养基配方为： 酵母粉56g、 葡萄糖20g、 琼脂20g、 水1000ml。 0019 接种方法： 将实施例1-4得到的融合子和亲本菌种同时接种在鉴定培养基平板上， 融合子接种在中部， 两侧接种亲本， 菌种块间相距12cm， 在25、 黑暗环境下培养10d， 再 在25、 光照下培养10d； 实验结果： 实施例1-4获得的融合子与亲本菌株间形成拮抗线， 如图1所示。 0020 实施例6： 菌丝形态与细胞核观察鉴定 取实施例1-4获得的融合子菌丝体， 放在载玻片上， 加入荧光让色剂DAPI， 染色处理3 5min， 在400倍的荧光显微镜下观察， 观察结果为： 实施例1-4获得的融合子的菌丝为管状、 分枝、 无锁状联合、 细胞内细胞核为1个， 如图2所示。 说明书 5/5 页 7 CN 105802953 A 7 图1 图2 说明书附图 1/1 页 8 CN 105802953 A 8 。