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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711133241.3 (22)申请日 2017.11.16 (71)申请人 青岛农业大学 地址 266109 山东省青岛市城阳区长城路 700号青岛农业大学化学与药学院 (72)发明人 杜丰玉周远明肖琳居广琳 孙泽春 (51)Int.Cl. C07C 35/06(2006.01) C07C 69/007(2006.01) C07C 69/18(2006.01) A01N 31/06(2006.01) A01N 37/02(2006.01) A01P 3/00(2006.0。
2、1) C12P 7/02(2006.01) C12P 7/62(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 两种Cyclonerodiol类倍半萜衍生物及其制 备方法和应用 (57)摘要 本发明涉及微生物来源杀菌剂， 具体的说是 两种Cyclonerodiol类倍半萜衍生物及其制备方 法和应用。 所述Cyclonerodiol类倍半萜衍生物 如式 （一） 和式 （二） 所示。 本发明所涉及的 Cyclonerodiol类倍半萜衍生物由菌株粉红单端 孢TrichotheciumroseumMLF-12经发酵培养、 提 取分离制备获得， 其化学结构经核磁共振和质谱 。
3、等技术鉴定； 对苹果腐烂病菌或小麦纹枯病菌具 有较好的抑制活性， 可用于制备具有杀菌作用的 新农药成分或先导化合物。 权利要求书1页 说明书4页 CN 107814688 A 2018.03.20 CN 107814688 A 1.两种Cyclonerodiol类倍半萜衍生物， 其特征在于： Cyclonerodiol类倍半萜衍生物 如式 （一） 和式 （二） 所示,。 2.一种权利要求1所述的Cyclonerodiol类倍半萜衍生物的制备方法， 其特征在于： 1） 将菌株粉红单端孢Trichotheciumroseum MLF-12接种于真菌固体培养基中静置发 酵， 经有机溶剂提取， 获得提。
4、取物， 待用； 2） 将上述提取物进行硅胶柱层析， 以氯仿甲醇进行梯度洗脱， 收集洗脱液， 洗脱液经 薄层层析检测； 3） 将上述步骤2） 中氯仿甲醇体积比6040: 1梯度的洗脱组分， 依次进行反相硅胶柱 层析、 Sephadex LH-20凝胶柱层析与制备薄层层析法分离纯化， 收集Rf值为0.20.4的组 分， 即得式 （一） 所示Cyclonerodiol类倍半萜衍生物； 收集Rf值为0.50.7的组分， 即得式 （二） 所示Cyclonerodiol类倍半萜衍生物。 3.按权利要求2所述的Cyclonerodiol类倍半萜衍生物的制备方法， 其特征在于： 所述 步骤3） 收集Rf值为0。
5、.3的组分， 即得式 （一） 所示Cyclonerodiol类倍半萜衍生物； 收集Rf值为 0.5的组分， 即得式 （二） 所示Cyclonerodiol类倍半萜衍生物。 4.按权利要求2所述的Cyclonerodiol类倍半萜衍生物的制备方法， 其特征在于： 所述 步骤1） 将菌株粉红单端孢Trichotheciumroseum MLF-12接种于真菌固体培养基中发酵30- 40天， 经乙酸乙酯、 丙酮、 氯仿、 甲醇、 乙醇、 水中的一种或几种作为有机溶剂进行提取， 获得 发酵产物。 5.按权利要求2所述的Cyclonerodiol类倍半萜衍生物的制备方法， 其特征在于： 所述 步骤1） 。
6、中真菌固体培养基为大米培养基。 6.按权利要求2所述的Cyclonerodiol类倍半萜衍生物的制备方法， 其特征在于： 所述 步骤2） 中氯仿甲醇洗脱梯度为100: 1至1 : 1。 7.按权利要求2所述的Cyclonerodiol类倍半萜衍生物的制备方法， 其特征在于： 所述 步骤3） 中反向硅胶柱层析洗脱液为体积比2: 3的甲醇水， 凝胶柱层析洗脱液为甲醇， 制备 薄层层析法的色谱条件为体积比30: 1的氯仿甲醇展开。 8.一种权利要求1所述的Cyclonerodiol类倍半萜衍生物的应用， 其特征在于： 所述式 （一） 和式 （二） 所示Cyclonerodiol类倍半萜衍生物可用于制。
7、备防治苹果腐烂病菌或小麦纹 枯病菌的微生物杀菌剂。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107814688 A 2 两种Cyclonerodiol类倍半萜衍生物及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及微生物来源杀菌剂， 具体的说是两种Cyclonerodiol类倍半萜衍生物 及其制备方法和应用。 背景技术 0002 苹果是我国北方主要的经济作物之一， 因其口感酸甜， 广受欢迎， 具有较好的经济 效益。 苹果腐烂病能够侵染苹果树的茎叶， 造成枝干枯萎， 严重时会造成整颗苹果树绝产， 造成较大的经济损失。 小麦纹枯病为我国麦区多发病害， 能够侵染小麦生长的各个阶段， 造 成小麦植株枯萎。 。
8、0003 目前， 上述植物病害防治手段主要依靠使用化学合成农药， 虽然能够起到较好的 防控作用， 但是随着植物病害抗药性增强， 化学合成农药施用量也逐年加大， 其弊端也日益 凸显， 带来了环境污染与危害人类健康等问题。 0004 相比较化学合成农药， 微生物来源天然产物对人畜与非靶标生物安全， 具有环境 兼容性好、 不易产生抗药性等优点； 此外， 微生物易于规模化发酵生产， 便于产业化开发。 所 以， 从微生物中寻找并开发微生物来源杀菌剂已经成为未来绿色农药发展的趋势。 发明内容 0005 本发明目的是提供两种Cyclonerodiol类倍半萜衍生物及其制备方法和应用。 0006 为实现上述目。
9、的， 本发明所采用的技术方案为： 两种Cyclonerodiol类倍半萜衍生 物， 如式 （一） 或式 （二） 所示，。 0007 两种Cyclonerodiol类倍半萜衍生物的制备方法， 1） 将菌株粉红单端孢Trichotheciumroseum MLF-12接种于真菌固体培养基中静置发 酵， 经有机溶剂提取， 获得提取物， 待用； 2） 将上述提取物进行硅胶柱层析， 以氯仿甲醇进行梯度洗脱， 收集洗脱液， 洗脱液经 薄层层析检测； 3） 将上述步骤2） 中氯仿甲醇体积比6040 : 1梯度的洗脱组分， 依次进行反相硅胶柱 层析、 Sephadex LH-20凝胶柱层析与制备薄层层析法分离。
10、纯化， 收集Rf值为0.20.4的组 分， 即得式 （一） 所示Cyclonerodiol类倍半萜衍生物； 收集Rf值为0.50.7的组分， 即得式 （二） 所示Cyclonerodiol类倍半萜衍生物。 说明书 1/4 页 3 CN 107814688 A 3 0008 所述步骤3） 收集Rf值为0.3的组分， 即得式 （一） 所示Cyclonerodiol类倍半萜衍生 物； 收集Rf值为0.5的组分， 即得式 （二） 所示Cyclonerodiol类倍半萜衍生物。 0009 所述步骤1） 将菌株粉红单端孢Trichotheciumroseum MLF-12接种于真菌固体培 养基中发酵30-。
11、40天， 经乙酸乙酯、 丙酮、 氯仿、 甲醇、 乙醇、 水中的一种或几种作为有机溶剂 进行提取， 获得发酵产物。 0010 所述步骤1） 中真菌固体培养基为大米培养基。 0011 所述步骤2） 中氯仿甲醇洗脱梯度为100 : 1至1 : 1。 0012 所述步骤3） 中反向硅胶柱层析洗脱液为体积比2 : 3的甲醇水， 凝胶柱层析洗脱 液为甲醇， 制备薄层层析法的色谱条件为体积比30 : 1的氯仿甲醇展开。 0013 两种Cyclonerodiol类倍半萜衍生物的应用， 所述式 （一） 或式 （二） 所示 Cyclonerodiol类倍半萜衍生物可用于制备防治苹果腐烂病菌或小麦纹枯病菌的微生物杀。
12、 菌剂。 0014 本发明所具有的优点： 1） 本发明所涉及的Cyclonerodiol类倍半萜衍生物对苹果腐烂病菌具有较好抑制活 性， 式 （一） 与式 （二） 所示化合物的MIC值分别为64与128 g/mL； 2） 本发明所涉及的Cyclonerodiol类倍半萜衍生物对小麦纹枯病菌具有较好抑制活 性， 式 （一） 与式 （二） 所示化合物的MIC值均为128 g/mL； 3） 本发明所涉及的Cyclonerodiol类倍半萜衍生物可以利用微生物进行规模发酵， 具 有生产工艺相对简单、 周期相对较短等特点。 具体实施方式 0015 为阐明对本发明特征的理解， 下面结合一些非限定性的实施实。
13、例对本发明做进一 步阐述。 0016 实施例1： Cyclonerodiol类倍半萜衍生物如式 （一） 和式 （二） 所示 （结构中的阿拉 伯数字为碳原子的标位） ，。 0017 实施例2： Cyclonerodiol类倍半萜衍生物的发酵生产及分离纯化。 0018 1)发酵培养 菌种培养： 按照微生物的常规培养方法， 挑取少量保存于琼脂麦芽膏培养基的菌株 粉红单端孢Trichotheciumroseum MLF-12， 接种于PDA平板表面， 28培养5天， 作为规模发 酵培养的菌种， 待用； 切取上述PDA平板表面的菌种适量， 接种至已灭菌的、 盛有大米培养基的锥形瓶中， 室 温静置培养30。
14、天。 加入乙酸乙酯灭菌， 待用； 说明书 2/4 页 4 CN 107814688 A 4 所述大米培养基为大米100 g/瓶， 蛋白胨0.6 g/瓶， 天然海水100 mL/瓶。 2)化合物的 分离纯化 将上述大米培养基用乙酸乙酯超声提取3次， 合并乙酸乙酯提取液， 减压蒸馏得浸膏。 将其进行硅胶VLC （vacuum liquid chromatography） 快速柱层析， 按照洗脱液极性递增顺 序， 以体积比100 : 1至1 : 1的氯仿甲醇 （流速为150 mL/min） 进行梯度洗脱。 收集洗脱 液， 并经薄层层析检测， 检测时以茴香醛-浓硫酸作为显色剂， 根据Rf值以及显色情况。
15、来合 并相同或类似部分。 收集氯仿甲醇体积比6040 : 1梯度的洗脱组分， 将收集的组分进行 反相硅胶柱层析， 以体积比1 : 9至1 : 0的甲醇水 （流速为5 mL/min） 依次进行梯度洗 脱， 收集体积比为2: 3的甲醇水洗脱组分。 该组分经凝胶柱层析， 以甲醇为洗脱溶液 （流 速为1 mL/min） ， 最后经制备薄层层析法分离纯化 （色谱条件为体积比30 : 1的氯仿甲醇 展开） ， 收集Rf值为0.3的组分， 即得式 （一） 所示Cyclonerodiol类倍半萜衍生物； 收集Rf值为 0.5的组分， 即得式 （二） 所示Cyclonerodiol类倍半萜衍生物。 0019 式。
16、 （一） 所示Cyclonerodiol类倍半萜衍生物， 无色粉末; HRESIMS m/z279.1930 M + Na+， 提示分子式为C15H28O3， 其NMR数据见表1。 0020 表1. 式 （一） 所示Cyclonerodiol类倍半萜衍生物的1H (500MHz)和13C NMR (125MHz)谱图数据 （NMR测试所用溶剂： 氘代氯仿） 0021 式 （二） 所示Cyclonerodiol类倍半萜衍生物， 无色粉末; HRESIMS m/z321.2042 M + Na+， 提示分子式为C17H30O4， 其NMR数据见表2。 0022 表2. 式 （一） 所示Cyclon。
17、erodiol类倍半萜衍生物的1H (500MHz)和13C NMR (125MHz)谱图数据 （NMR测试所用溶剂： 氘代甲醇） 说明书 3/4 页 5 CN 107814688 A 5 0023 实施例3： 抑菌活性试验 采用微量稀释法， 测定式 （一） 和式 （二） 所示化合物对苹果腐烂病菌与小麦纹枯病菌的 抑菌活性 （从天然产物到新农药创制-原理方法 ， 吴文君， 2006， 化学工业出版社） 。 0024 1） 菌悬液的制备 将供试真菌接种于PDA培养基表面于28 培养72 h后， 吸取2 mL无菌0.85% NaCl溶液 （含0.25% 吐温-20） 洗涤培养物， 并用玻璃刮刀将菌。
18、落轻轻刮下。 吸取适量菌悬液于无菌试 管中， 调至0.5麦氏比浊 （相当于1.5108 CFU/mL） 备用。 0025 2） 样品的配制 取1 mg待测样品 （式 （一） 所示化合物） ， 溶解于100 L50% DMSO中， 充分混匀后， 吸取50 L样品溶液到另一只离心管中， 接着加入50 L 50% DMSO， 得到浓度减半的样品溶液。 按照此 方法， 得到6组浓度依次减半的样品溶液。 0026 3） 最小抑制浓度 （MIC） 测定方法 （1） 采用无菌操作， 将倍比稀释后不同浓度的样品溶液分别加到无菌的96孔聚苯乙烯 板中， 第1至第6孔各加5 L的样品溶液， 并以不加样品孔作为空白。
19、对照， 加5 L 50% DMSO溶 液孔为溶剂对照； （2） 将相当于0.5麦氏比浊度的指示菌悬液， 经PDB培养基稀释1000倍后， 取95 L依次加 入到96孔板中， 使得第1至第6孔的样品浓度依次为512、 256、 128、 64、 32、 16 g/mL。 以上所有 样品均重复三次。 轻轻震荡混匀后， 将96孔板密封置于28生化培养箱中培养72 h； （3） 在600 nm波长下使用酶标仪测定每孔的吸光值， 以在小孔内完全抑制指示菌生长 的最低样品浓度为该化合物的MIC。 0027 试验结果为： 式 （一） 与式 （二） 所示化合物对苹果腐烂病菌具有较好抑制活性， MIC值分别为64与128 g/mL； 式 （一） 与式 （二） 所示化合物对小麦纹枯病菌具有较好抑制活 性， MIC值均为128 g/mL。 0028 上述实验结果证明本发明所涉及的Cyclonerodiol类倍半萜衍生物具有较好抑菌 活性， 可用于制备防治苹果腐烂病菌或小麦纹枯病菌的微生物杀菌剂。 说明书 4/4 页 6 CN 107814688 A 6 。