《一种维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统及应用其进行基因编辑的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统及应用其进行基因编辑的方法.pdf（16页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201511002817.3 (22)申请日 2015.12.25 C12N 15/76(2006.01) (71)申请人 安徽大学 地址 230039 安徽省合肥市经济技术开发区 九龙路 111 号 (72)发明人 童望宇 雍德祥 李雪 (74)专利代理机构 安徽合肥华信知识产权代理 有限公司 34112 代理人 余成俊 (54) 发明名称 一种维吉尼亚链霉菌 IBL14 中的 CRISPR-Cas 系统及应用其进行基因编辑的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种维吉尼亚链霉菌 IBL14 中 的 CRISPR-Cas 系统及基因编辑操。
2、作方法， 包括它 的 CRISPR-Cas I-B 型基因编辑系统特征、 靶向基 因与基因编辑模版的设计与质粒构建及靶向基因 与基因编辑模版重组质粒在链霉菌中的基因编辑 操作全过程。应用维吉尼亚链霉菌 IBL14 中的 CRISPR-Cas I-B型基因编辑系统对遗传基因进行 敲除、 插入、 无痕点突变及 RNA 水平调控可方便地 改变生物体的遗传特征， 该发明为实现提高医药、 食品及其它工业产品的生产水平和改善产品品质 提供了新的技术和方法。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 序列表5页 附图2页 CN 10554。
3、3266 A 2016.05.04 CN 105543266 A 1.一种维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统,其特征在于： 所述的维吉尼亚链霉 菌IBL14包括18个CRISPR与一个含有7个蛋白基因的CasI-SV14B型基因编辑系统。 2.根据权利要求1所述的一种维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统,其特征在 于： 所述的18个CRISPR与一个含有7个蛋白基因的CasI-SV14B型基因编辑系统包括： 18个 CRISPR核酸序列SV01-18和7个CasI-SV14B型基因Cas1-6， DevR。 3.根据权利要求1所述的一种维吉尼亚链霉菌IBL14。
4、中的CRISPR-Cas系统， 其特征在 于： 所述的18个CRISPRSV01-18具有附表1中所描述的核酸序列， 其CRISPR核酸序列数可多 于或少于18个。 4.根据权利要求1所述的一种维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统， 其特征在 于： 7个CasI-SV14B型基因顺序为Cas6,DevR,Cas5,Cas3,Cas4,Cas1,Cas2， 两侧分 别与CRISPRIC01和CRISPRIC02相比邻， 且DevR与Cas5， Cas3与Cas4有碱基重叠， 且基因编 辑过程中所需Cas基因数可包含全部7个基因或只含其中的Cas3,Cas5,Cas6和DevR。 。
5、5.一种应用如权利要求1所述的维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统进行基因 编辑的方法， 其特征在于： 包括以下步骤： （1） 基于所述的基因编辑系统进行靶向基因片段与编辑模版片段的设计及载体的构 建； （2） 维吉尼亚链霉菌IBL14原生质体制备及基因编辑载体的转化与重组菌株的验证。 6.根据权利要求5所述的一种应用所述的维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统 进行基因编辑的方法， 其特征在于， 所述的靶向基因片段与编辑模版片段的设计及载体的构建步骤包括： （1） 根据维吉尼亚链霉菌IBL14基因组测序的数据和信息， 得到靶向基因DNA序列信息； （2） 使用P。
6、fuDNA聚合酶通过聚合链式反应分别扩增得到末端带有限制性内切酶识别 和切割位点以及overlapPCR互补序列的靶向基因上下同源臂PCR片段； （3） 利用overlapPCR将上下同源臂结合起来构建编辑基因模版； （4） 直接合成靶向基因片段， 首尾分别包含启动子J23119和RNA终止子；（5） 根据限制性 酶切位点上的粘性末端将步骤 （3） 、 步骤 （4） 获得的DNA片段连接到pKC1139上得到基因编辑 质粒pKCSV14， 即可。 7.根据权利要求5所述的一种应用所述的维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统 进行基因编辑的方法， 其特征在于， 所述的维吉尼亚链霉菌。
7、IBL14原生质体制备及基因编辑载体的转化与重组菌株的验证 步骤包括： （1） 在含链霉菌的高渗溶液中添加溶菌酶制备链霉菌原生质体； （2） 将靶向基因片段与编辑模版片段的设计及载体的构建步骤中得到基因编辑质粒 pKCSV14转化到维吉尼亚链霉菌原生质体中得到基因编辑后的重组子； （3） 对重组子染色体进行PCR和基因测序分析确证基因编辑后的目的重组菌株。 8.根据权利要求5所述的一种应用所述的维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统 进行基因编辑的方法， 其特征在于： 所述的基因编辑指的是应用维吉尼亚链霉菌IBL14中的 CRISPR-Cas系统对维吉尼亚链霉菌的遗传物质进行基因。
8、敲除、 插入、 无痕点突变及任意组 合。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105543266 A 2 一种维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统及应用其进 行基因编辑的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种生物技术领域中的基因编辑技术， 确切地说是一种维吉尼亚链霉 菌IBL14中的CRISPR-Cas系统及应用其进行基因编辑的方法。 背景技术 0002 CRISPR(clusteredreglarlyinterspacedshortpalindromicrepeat sequences)称为成簇规则间隔的短回文重复序列， 1987年最早发现于大肠杆菌中(Nakata, A.,。
9、Amemura,M.andMakino,K. (1989)Unusualnucleotidearrangementwithrepeated sequencesintheEscherichiacoliK-12chromosome.JBacteriol.171,3553-3556)， 随后陆续发现存在于许多真细菌和古细菌的基因组中。 2002年R.Jansen等详细分析比较了 原核基因组中的这种重复序列， 更重要的发现此重复序列的旁侧经常伴随出现保守的基因 序列(Jansen,R.,Embden,J.D.,Gaastra,W.andSchouls,L.M. (2002)Identification。
10、of genesthatareassociatedwithDNArepeatsinprokaryotes.MolMicrobiol.43, 1565-1575)， 根据重复序列的排列特征， 他们将这种独特的重复序列命名为CRISPR， 保守基 因序列编码的蛋白质称为Cas附属蛋白(CRISPR-associatedproteins)。 由于这种序列在 细菌和古细菌中分布广泛， 因此推测CRISPR-Cas系统可能具有某种细胞生理功能。 0003 2007年R.Barrangou等首次在乳酸菌Streptococcusthermophilus中实验证实了 CRISPR-Cas系统的生物学功能-原。
11、核细胞抵御噬菌体侵染的一种免疫新机制(Barrangou, R.,Fremaux,C.,Deveau,H.,Richards,M.,Boyaval,P.,Moineau,S.,Romero,D.A.and Horvath,P.(2007)CRISPRprovidesacquiredresistanceagainstvirusesin prokaryotes.Science.315,1709-1712)。 L.AMarraffini等于2008年在Staphylococci中 证明CRISPR-Cas系统同样也能够干扰质粒的结合转移(Marraffini,L.A.andSontheimer, E。
12、 .J .( 2008)CRISPRinterferencelimitshorizontalgenetransferin staphylococcibytargetingDNA.Science.322,1843-1845)。 近年来， CRISPR-Cas系统的 免疫机制以及Cas蛋白质结构功能等方面的研究取得了重大的进展， 而且基于CRISPR-Cas 系统发展的DNA编辑新技术， 在原核和真核细胞中成功地应用于基因组编辑改造， 在医药、 食品、 农业等领域中显示出了巨大的潜力。 但到目前为止， 广泛应用的CRISPR-Cas系统均 为CRISPR-CasII型系统。 0004 基因编辑技术。
13、是遗传功能研究的重要手段， 传统的基因编辑方法主要包括锌指核 酸酶(ZFN： zinc-fingernucleases)技术和转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN： transcriptionactivator-likeeffectornuclease)技术。 不论是TALEN技术还是ZFN技 术， 其定向打靶都依赖于DNA序列特异性结合蛋白模块的合成， 这一步骤非常繁琐费时， 常 需要数周以上时间； 且基因打靶效率低。 CRISPR/Cas技术摆脱了合成组装具有特异性DNA识 别能力的蛋白模块的繁琐操作， 其gRNA的设计和合成工作量远远小于TALEN和ZFN技术中的 DNA识别模块的构建。
14、过程， 且打靶效率高。 可是， 在CRISPR-CasI型系统中， 目前的基因编辑 说明书 1/7 页 3 CN 105543266 A 3 操作研究多采用接合转移， 因而操作周期常达2个星期以上。 0005 CRISPR-CasI型系统虽有发现， 但少有应用报道。 维吉尼亚链霉菌IBL-14 (StreptomycesvirginiaeIBL14)是本实验室从甾体制药厂附近的活性泥污中分离得到 的一株能降解多种甾体化合物的放线菌。 对菌株IBL-14全基因组测序和数据库分析发现， 菌株IBL-14中存在CRISPR-CasI-SV14B型系统。 同时， 该系统可通过原生质体转化进行维 吉尼亚。
15、链霉菌基因编辑， 该原生质体转化操作比接合转移操作缩短操作时间约4-5天。 特别 是： 维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统及基因编辑操作方法未见报道。 发明内容 0006 本发明要解决的技术问题是提供一种维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统 及基因编辑操作方法， 通过靶向基因与基因编辑模版的设计与质粒构建及靶向基因与基因 编辑模版重组质粒在链霉菌中的转化操作， 对染色体基因进行敲除、 插入、 点突变及RNA水 平调控可方便地改变维吉尼亚链霉菌的遗传特征， 从而实现改造链霉菌基因组之目的。 0007 采用如下技术方案： 0008 一种维吉尼亚链霉菌IBL14中的。
16、CRISPR-Cas系统,其特征在于： 所述的维吉尼亚链 霉菌IBL14包括18个CRISPR与一个含有7个蛋白基因的CasI-SV14B型基因编辑系统。 0009 所述的一种维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统,其特征在于： 所述的18个 CRISPR与一个含有7个蛋白基因的CasI-SV14B型基因编辑系统包括： 18个CRISPR核酸序 列SV01-18和7个CasI-SV14B型基因Cas1-6， DevR。 0010 所述的一种维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统， 其特征在于： 所述的18个 CRISPRSV01-18具有附表1中所描述的核酸序列， 。
17、其CRISPR核酸序列数可多于或少于18个。 0011 所述的一种维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统， 其特征在于： 7个CasI- SV14B型基因顺序为Cas6,DevR,Cas5,Cas3,Cas4,Cas1,Cas2， 两侧分别与CRISPRIC01和 CRISPRIC02相比邻， 且DevR与Cas5， Cas3与Cas4有碱基重叠， 且基因编辑过程中所需Cas基 因数可包含全部7个基因或只含其中的Cas3,Cas5,Cas6和DevR。 (如图1所示) 0012 所述的维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统进行基因编辑的方法， 其特征 在于： 包括以。
18、下步骤： 0013 (1)基于所述的基因编辑系统进行靶向基因片段与编辑模版片段的设计及载体的 构建； 0014 (2)维吉尼亚链霉菌IBL14原生质体制备及基因编辑载体的转化与重组菌株的验 证。 0015 所述的一种应用所述的维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统进行基因编辑 的方法， 其特征在于， 0016 所述的靶向基因片段与编辑模版片段的设计及载体的构建步骤包括： 0017 (1)根据维吉尼亚链霉菌IBL14基因组测序的数据和信息， 得到靶向基因DNA序列 信息； 0018 (2)使用PfuDNA聚合酶通过聚合链式反应分别扩增得到末端带有限制性内切酶 识别和切割位点以及ov。
19、erlapPCR互补序列的靶向基因上下同源臂PCR片段； 0019 (3)利用overlapPCR将上下同源臂结合起来构建编辑基因模版； 说明书 2/7 页 4 CN 105543266 A 4 0020 (4)直接合成靶向基因片段， 首尾分别包含启动子J23119和RNA终止子； 0021 (5)根据限制性酶切位点上的粘性末端将步骤(3)、 步骤(4)获得的DNA片段连接到 pKC1139上得到基因编辑质粒pKCSV14， 即可。 0022 所述的一种应用所述的维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统进行基因编辑 的方法， 其特征在于， 0023 所述的维吉尼亚链霉菌IBL14原。
20、生质体制备及基因编辑载体的转化与重组菌株的 验证步骤包括： 0024 (1)在含链霉菌的高渗溶液中添加溶菌酶制备链霉菌原生质体； 0025 (2)将靶向基因片段与编辑模版片段的设计及载体的构建步骤中得到基因编辑质 粒pKCSV14转化到维吉尼亚链霉菌原生质体中得到基因编辑后的重组子； 0026 (3)对重组子染色体进行PCR和基因测序分析确证基因编辑后的目的重组菌株。 0027 所述的一种应用所述的维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统进行基因编辑 的方法， 其特征在于： 所述的基因编辑指的是应用维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系 统对维吉尼亚链霉菌的遗传物质进行。
21、基因敲除、 插入、 无痕点突变及任意组合。 0028 有益效果为； 0029 本发明丰富了CRISPRS技术的类型； 提供了CRISPR-CASI-SV14B型系统在链霉菌 基因功能研究中的应用； 为CRISPR-CASI-SV14B型系统在其它生物体基因编辑研究中提供 了新的方法和技术选择。 应用维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-CasI-SV14B型基因编辑 系统对链霉菌遗传基因进行敲除、 插入、 点突变及RNA水平调控可方便、 快速、 高效地改变生 物体的遗传特征。 0030 应用维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-CasI-B型基因编辑系统对遗传基因进行 敲除、 插入、 。
22、无痕点突变及RNA水平调控可方便地改变生物体的遗传特征， 该发明为实现提 高医药、 食品及其它工业产品的生产水平和改善产品品质提供了新的技术和方法。 附图说明 0031 图1维吉尼亚链霉菌IBL14中的CasI-B系统； 该CasI-SV14B系统包含7个Cas基因 (顺序为Cas6,DevR,Cas5,Cas3,Cas4,Cas1,Cas2)， 两侧分别与CRISPRIC01和CRISPR IC02相比邻， 且DevR与Cas5， Cas3与Cas4有碱基重叠。 0032 图2 pKCSV14-16k质粒构建过程图； 0033 图3 svu016基因编辑转化株PCR检测电泳图； svu016。
23、基因编辑转化株PCR检测电泳 图； 0034 泳道1-8为转化株基因组PCR产物， 泳道9为空白菌基因组扩增产物， M为GM347 Marker； 0035 图4敲除菌扩增出的svu016基因测序结果。 具体实施方式 0036 本发明所说的是一种维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统及基因编辑操作 方法， 下面结合具体施例进一步的作说明， 旨在更好的解释本发明的内容， 以下施例不限制 本发明的保护范围。 此外， 在所列实施例中如无特别说明匀采用如下材料： 说明书 3/7 页 5 CN 105543266 A 5 0037 1)菌种 0038 宿主为Streptomycesvirg。
24、iniaeIBL14， 敲除辅助质粒pKC1139。 0039 2)培养基 0040 种子培养基(FM培养基) 0041 NH4Cl3.0g， K2HPO43H2O1.55g， NaH2PO42H2O0.85g， MgSO47H2O0.2g， CaCl22H2O10.0mg， FeSO47H2O1.0mg， ZnSO40.1mg； 加自来水至1000ml， 灭菌前pH调为 7.0， 然后加葡萄糖3.0g,酵母粉3.0g玉米浆3.0g, -环糊精3.0g。 0042 转化培养基(R2YE培养基) 0043 蔗糖103g/L， K2SO40.25g/L， MgCl26H2O10.12g/L， 葡萄。
25、糖10g/L， 酪蛋白0.1g/ L， 酵母粉5g/L， TES5.73g/L， 微量元素(Fe2(SO4)6H2O0.01g， CuSO45H2O0.001， ZnSO45H2O0.001,MnSO4H2O0.001； 加蒸馏水至1000ml)2ml， 琼脂22g/L， pH7.0(使用前 融化并加入0.54KH2PO410ml/L， 2.5MCaCl22H2O8ml/L， 20L-脯氨酸15ml/L)。 0044 P缓冲液(原生质体转化用) 0045 蔗糖103g， K2SO40.25g,MgCl26H2O2.02g,微量元素溶液2ml， 蒸馏水800ml灭菌 后每80ml上述溶液中加入：。
26、 0.5KH2PO41ml,3.68CaCl22H2O10ml,5.73TES缓冲液 (pH7.2)10ml。 0046 所用试剂均为市售品。 0047 实施例1(svu016基因敲除) 0048 (1)基因svu016引物设计与DNA扩增 0049 根据全基因组测序信息， 设计基因svu016特异性引物016-F和016-R(表3)。 提取维 吉尼亚链霉菌IBL-14基因组DNA， 使用上海生工生物工程股份有限公司生产的PfuDNA Polymerase进行svu016基因PCR扩增， 反应条件： 955min， 9430s， 5830s， 72 2min， 2.5U生工公司生产的PfuDN。
27、APolymerase(50 l反应体系)， 30个循环， 7210min。 PCR产物经1琼脂糖电泳检测， 试剂盒回收， 得到纯化的svu016全长基因片段备用。 0050 (2)制备上、 下游同源臂 0051 根据svu016基因全序列(表2)设计svu016基因上游同源臂引物016-UF和016-UR、 以及下游同源臂引物016-DF和016-DR(表3)(黑体加粗为overlapPCR互补序列)， 且上同源 臂上游引物含BamHI限制性内切酶酶切位点， 下同源臂下游引物含EcoRI限制性内切酶酶切 位点(下划线为酶切位点)。 0052 以纯化的svu016基因DNA为模板， 先分别扩增。
28、上、 下游同源臂， 反应条件为： 95 5min， 9430s， 6630s， 7230s， 2.5U生工公司生产的PfuDNAPolymerase(50 l反应 体系)， 30个循环， 7210min。 PCR产物经1琼脂糖电泳检测， 试剂盒回收， 得到纯化后的 上、 下游同源臂DNA片段备用。 0053 (3)制备编辑模版片段 0054 取上同源臂纯化产物与下同源臂纯化产物0.4 l混合作为模板， 30 l反应体系进 行overlapPCR， 反应条件为： 94预变性5min， 94变性lmin， 55退火1min， 72延伸 30s， 一个循环后加人引物016-UF与016-DR各1 l。
29、， 继续PCR， 反应条件为： 95预变性5min， 94变性30s， 66退火30s， 72延伸1min， 进行30个循环， 7210min。 1琼脂糖凝胶电 泳检测扩增产物并纯化备用。 说明书 4/7 页 6 CN 105543266 A 6 0055 (4)制备靶向基因片段 0056 含启动子J23119的guideDNA-SVU016gk01连接产物的靶向基因片段(表3)由滁州 通用生物公司直接合成， 首尾分别加上HindIII及XbaI酶切位点， 中间依次是启动子 J23119， spacer， repeat以及终止子(小写字母为酶切位点， 单下划线为启动子J23119， 斜体 为s。
30、pacer， 黑体加粗为repeat， 双下划线为终止子terminator)。 0057 (5)构建基因编辑质粒pKCSV14-16k 0058 将实施例1步骤(3)中获得的编辑模版片段通过BamHI限制性内切酶酶、 EcoRI限制 性内切酶切出粘性末端， 然后通过全式金T4连接酶将其连接到pKC1139质粒上， 得编辑模版 载体； 将实施例1步骤(4)中的靶向基因片段通过HindIII限制性内切酶酶、 XbaI限制性内切 酶切出粘性末端， 然后通过全式金T4连接酶将其连接到得编辑模版载体上得到基因编辑质 粒pKCSV14-16k。 0059 (6)维吉尼亚链霉菌IBL14原生质体制备 00。
31、60 在装有不锈钢弹簧的三角瓶中加入30ml的FM培养基(加0.15gGlycine)， 接种100 l的孢子悬液， 于30摇床中培养24-36h。 将培养物倒入50ml已灭菌的离心管中中， 用无菌 水涮洗三角瓶， 收集洗液于同一离心管中， 然后3000rpm离心10min。 弃上清， 将菌丝体悬浮 于15ml的10.3的蔗糖溶液中， 3000rpm离心10min， 弃上清。 同此法洗两次。 取1ml菌丝体， 加入4ml的溶菌酶(上海生工生物工程股份有限公司生产)溶液(溶菌酶母液为50mg/mlP Buffer， 终浓度为2mg/ml， 用PBuffer稀释)， 于30水浴30-60min(间。
32、隔七八分种轻轻摇 动)至上清呈乳状。 加入5ml的PBuffer并用5ml的吸管吹吸几次， 继续温浴10min(使大量的 原生质体释放出来)。 用装有脱脂棉的试管过滤， 滤液转入无菌干净的离心管中， 3000rpm离 心7min。 原生质体沉淀呈黄色。 弃上清， 轻柔打散原生质体， 用PBuffer洗两次(洗去溶菌 酶)。 每次仍使用3000rpm离心7min。 弃上清， 用枪将原生质体打散， 分装， 于-70度保存备用。 0061 (7)基因编辑质粒pKCSV14-16k转化 0062 将基因编辑质粒pKCSV14-16k转化到维吉尼亚链霉菌IBL-14原生质体中， 在R2YE 固体培养基中。
33、30培养， 待平板呈雾状后涂布1ml(含50mg/ml的安普霉素溶液30 l)无菌水 溶液、 覆盖， 超净台吹干后30培养约30min得到svu016基因敲除重组子。 0063 (8)重组子染色体PCR和基因测序分析 0064 挑取8株转化株基因组作为模板， 再以步骤(1)svu016基因引物016-F/016-R进行 PCR扩增反应， 反应条件： 955min， 9430s， 5830s， 722min， 2.5U生工公司生产的 PfuDNAPolymerase(25 l反应体系)， 30个循环， 7210min。 PCR产物经1琼脂糖电泳检 测， 8株重组子染色体DNA扩增条带均减少预期的。
34、400bp(图4)， 经通用生物系统(安徽)有限 公司测序证明svu016基因已成功敲除掉， 所得目的重组子为svu016基因敲除重组子。 0065 实施例2(氯霉素抗性基因插入) 0066 (1)基因svu016引物设计与DNA扩增 0067 同实施例1步骤(3)。 0068 (2)制备上、 下游同源臂以及氯霉素基因 0069 上下游同源臂扩增同实施例1步骤(2)。 氯霉素基因引物cm-F和cm-R(表3)。 以纯化 的氯霉素基因DNA为模板， 扩增氯霉素基因， 反应条件为： 955min， 9430s， 6030s， 721min， 2.5U生工公司生产的PfuDNAPolymerase(。
35、50 l反应体系)， 30个循环， 72 说明书 5/7 页 7 CN 105543266 A 7 10min。 PCR产物经1琼脂糖电泳检测， 试剂盒回收， 得到纯化后氯霉素DNA片段备用。 0070 (3)制备编辑模版片段 0071 取上同源臂纯化产物和氯霉素基因纯化产物0.4 l混合作为模板， 30 l反应体系 进行overlapPCR， 反应条件为： 94预变性5min， 94变性lmin， 55退火1min， 72延伸 1min， 一个循环后加人引物016-UF与cm-R各1 l， 继续PCR， 反应条件为： 95预变性5min， 94 变性30s， 66退火30s， 72延伸90s。
36、， 进行30个循环， 7210min。 1琼脂糖凝胶电泳检 测扩增产物并纯化备用。 接着取上同源臂纯化产物和氯霉素基因结合后纯化产物及下同源 臂纯化产物0.4 l混合作为模板， 30 l反应体系进行overlapPCR， 反应条件为： 94预变性 5min， 94变性lmin， 55退火1min， 72延伸90s， 一个循环后加人引物016-UF与016-R各1 l， 继续PCR， 反应条件为： 95预变性5min， 94变性30s， 66退火30s， 72延伸2min， 进 行30个循环， 7210min。 1琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物并纯化备用。 0072 (4)制备靶向基因片段 0073。
37、 同实施例1步骤(4) 0074 (5)构建基因编辑质粒pKCSV14-16cm 0075 同实施例1步骤(5)。 0076 (6)维吉尼亚链霉菌IBL14原生质体制备 0077 同实施例1步骤(6)。 0078 (7)基因编辑质粒pKCSV14-16cm转化 0079 同实施例1步骤(7)。 0080 (8)重组子筛选 0081 挑去板上长出的单菌落到FM培养基中， 42培养2h待质粒自杀后， 取10 l菌液分 别涂布到含有安普霉素和氯霉素的FM培养基上， 24h后含有安普霉素的培养基中没有菌落 长出而含有氯霉素的培养基中有菌体长出， 挑取单菌落进行菌落PCR， 重组子染色体DNA扩 增条带。
38、均增加预期的300bp， 同时测序正确。 0082 实施例3(svu016基因无痕点突变) 0083 (1)基因svu016引物设计与DNA扩增 0084 同实施例1步骤(3)。 0085 (2)制备点突变编辑模版片段 0086 点突变编辑模版片段SVU016C352T由滁州通用生物公司直接合成， 首尾分别加上 BamHI和EcoRI酶切位点， 在此编辑模板片段上将蛋白活性位点352位半胱氨酸密码子序列 突变成苏氨酸密码子序列， 同时为了保证打靶正确， 将活性位点附近的氨基酸密码子序列 修改成其简并序列(表3)。 0087 (3)制备靶向基因片段 0088 同实施例1步骤(4)制备靶向基因gu。
39、ideDNA-SVU016C352T。 (表3) 0089 (4)构建基因编辑质粒pKCSV14-SVU016C352T 0090 同实施例1步骤(5)。 0091 (5)维吉尼亚链霉菌IBL14原生质体制备 0092 同实施例1步骤(6)。 0093 (6)基因编辑质粒pKCSV14-SVU016C352T转化 说明书 6/7 页 8 CN 105543266 A 8 0094 同实施例1步骤(7)。 0095 (7)重组子筛选 0096 挑去板上长出的单菌落到含有安普霉素的FM培养基中， 30培养24h后， 取10ul菌 液涂布到含有安普霉素的FM培养基上， 待长出单菌落后挑取单菌落进行菌。
40、落PCR， 以实施例 1步骤(1)中svu016基因引物016-F/016-R进行PCR扩增反应， 反应条件： 955min， 94 30s， 5830s， 722min， 2.5U生工公司生产的PfuDNAPolymerase(25 l反应体系)， 30 个循环， 7210min。 PCR产物经1琼脂糖电泳检测后送至通用生物系统(安徽)有限公司 测序， 测序结果证明svu016活性位点半胱氨酸被突变成苏氨酸。 0097 以上所述仅以实施例来进一步说明本发明的技术内容， 以便于读者更容易理解， 但不代表本发明的实施方式仅限于此， 任何依本发明所做的技术延伸或再创造， 均受本发 明的保护。 说明书 7/7 页 9 CN 105543266 A 9 0001 序列表 1/5 页 10 CN 105543266 A 10 0002 序列表 2/5 页 11 CN 105543266 A 11 0003 序列表 3/5 页 12 CN 105543266 A 12 0004 序列表 4/5 页 13 CN 105543266 A 13 0005 0006 序列表 5/5 页 14 CN 105543266 A 14 图1 图2 图3 说明书附图 1/2 页 15 CN 105543266 A 15 图4 说明书附图 2/2 页 16 CN 105543266 A 16 。