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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610088324.4 (22)申请日 2016.02.17 C12P 21/06(2006.01) C12N 11/14(2006.01) C12N 11/10(2006.01) C07K 14/78(2006.01) C07K 1/34(2006.01) (71)申请人 常州市庆发工业气体有限公司 地址 213146 江苏省常州市武进区湖塘镇华 家村 (72)发明人 陈蓉蓉 张帆 林大伟 (54) 发明名称 一种银耳胶原蛋白肽的提取方法 (57) 摘要 本发明公开了一种银耳胶原蛋白肽的提取方 法， 属于胶原蛋白肽制备技术领域。 。
2、本发明以淀粉 和磁性粉末制得固定化蛋白酶， 将银耳作为原材 料， 经预处理后酶解， 干燥， 从而得到银耳胶原蛋 白肽的提取方法。本发明工艺简便， 原料易得， 在 制备过程中避免了漂白剂、 氧化剂等化学试剂， 对 环境无任何污染问题， 利用固定化蛋白酶代替游 离蛋白酶， 降低了生产成本， 使得最终制得的蛋白 酶产率高达 90以上、 纯度高达 95以上， 适合 大规模应用。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 CN 105524964 A 2016.04.27 CN 105524964 A 1.一种银耳胶原蛋白肽的提取方法。
3、， 其特征在于具体提取步骤为： （1） 称取3040g可溶性淀粉溶于300400mL去离子水中， 装入带有搅拌器和温度计的 1L三口烧瓶中， 再加入12mL浓度为0.2mol/L氯化亚铁溶液和23mL质量浓度为30%双氧 水， 启动搅拌器以300400r/min转速进行搅拌； （2） 在搅拌过程中滴加3545mL浓度为1mol/L的烧碱溶液， 控制滴加速度使其20 30min内滴加完毕， 再将三口烧瓶移入油浴锅， 加热升温至100110， 保持油浴温度不变， 继续搅拌反应34h后放入温度为46冰水浴中， 静置沉淀1012h后过滤得到滤渣， 干 燥后得到磁性淀粉微球； （3） 称取510g木瓜蛋。
4、白酶和35g碱性蛋白酶加入400500mLpH7.0的磷酸缓冲液 中， 放置在超声振荡仪中， 以100200W功率超声振荡2535min后， 加入2030g上述制得 的磁性淀粉微球， 继续振荡810h， 将反应液用卧式离心机以80009000r/min的转速离心 1015min， 分离去除上清液， 得到固定化蛋白酶， 备用； （4） 称取400500g干银耳放入4050的温水中浸泡12h， 待其充分溶胀后， 用蒸馏 水将其表面污物清洗干净， 用剪刀将洗净后的银耳剪成1cm1cm的小块， 分别用12L浓度 为0.2mol/L烧碱和12L无水乙醇浸泡12天， 最后用去离子水冲洗57遍， 得到预处理。
5、后 的银耳； （5） 将300400g上述预处理后的银耳装入高压反应釜中， 按料液比为1:2向釜内加入 去离子水， 升高釜内温度至100200并提高压力至0.20.3MPa， 保温保压处理30 40min后出料； （6） 将上述物料移入酶解罐， 加入物料总质量12%的备用的固定化蛋白酶， 用保鲜膜 密封罐口后放入恒温箱中， 升温至4050， 保温酶解68h后， 在酶解罐周围施加匀强磁 场， 分离回收磁性固定化蛋白酶， 再将酶解液用孔径为0.40.5 m的纳滤膜进行过滤， 得到 大分子胶原蛋白肽滤液， 经喷雾干燥后研磨过100目标准筛， 即可得到银耳胶原蛋白肽粉 末。 权利要求书 1/1 页 2。
6、 CN 105524964 A 2 一种银耳胶原蛋白肽的提取方法 技术领域 0001 本发明公开了一种银耳胶原蛋白肽的提取方法， 属于胶原蛋白肽制备技术领域。 背景技术 0002 胶原蛋白是一种高分子蛋白质， 丝状的胶原蛋白纤维， 能使皮肤保持结实而有弹 性。 胶原蛋白具有很强的生物活性和生物功能， 能参与细胞的迁移、 分化和增殖， 使骨骼、 肌 腱、 软骨和皮肤具有一定的机械强度。 胶原蛋白肽是胶原蛋白在一定的化学作用或酶的作 用下发生 “水解” 反应后得到的分子量在10000dalton以下的产物。 胶原蛋白肽具有独特的 生理活性， 它不仅有蛋白质的营养特性， 消化吸收率可达100， 而且。
7、有保护胃粘膜、 抗溃 疡、 抗氧化、 抗过敏、 抗肿瘤、 抗衰老、 降血压、 降胆固醇、 增强骨强度、 预防骨质疏松、 预防关 节炎、 促进伤口愈合、 促进角膜上皮细胞的修复和生长、 促进皮肤胶原代谢、 免疫调节等多 种生理功能。 0003 近年来， 胶原蛋白肽已广泛应用于生物、 医疗、 食品、 化妆品等诸多领域。 胶原蛋白 肽的用范围也日趋广泛， 其需求量正逐年增长。 以往提取胶原蛋白肽的原料它们主要来源 于畜禽动物组织， 但由于宗教和习俗等原因， 有些地区不能使用。 再加上近年来， 由于疯牛 病和口蹄疫的影响， 人们已经开始转向从鱼类中提取胶原蛋白肽， 因为其所提取的胶原蛋 白肽更为安全。。
8、 0004 目前胶原蛋白肽的制备主要方法有： 高温高压蒸煮法、 酸法、 酶法、 酸法和酶法相 结合。 0005 （1） 高压蒸煮法能够快速提取胶原蛋白肽， 然而该工艺的高压在生产中易引发安 全问题， 制备的样品分子量分布广， 均匀度较差； （2） 酶法提取是目前用得较多的方法， 根据胶原蛋白的结构特点选择合适当的酶提取； 但该工艺制备的产品分子量较集中， 产品附加值较高， 但由于鱼鳞除了胶原蛋白外还含有 大量的无机盐、 脂肪等杂质， 这些杂质影响酶的酶活， 使得酶提取胶原蛋白肽的产率太低， 难以满足产业化大规模生产； （3） 酸法提取虽降低成本， 但单一的酸法提取得到的产品分子量分布广， 均匀。
9、度差； （4） 酸法与酶法结合提取可以提高产率， 制备产品的分子量较集中， 但产率仍然很低， 造成浪费。 0006 上述的传统方法存在以下问题： 工艺复杂： 这些方法都需要经历除杂蛋白、 去除脂肪， 提取胶原蛋白再酶解胶原蛋白 得到胶原蛋白肽这几个程序， 工艺复杂； 污染环境： 为了去除皮上的杂蛋白和脂肪， 需要加入化学试剂， 带来了环境污染的问 题； 成本高： 以上这些方法， 程序多工艺复杂， 生产成本高， 再加上需要加入昂贵的蛋白 酶， 进一步增加了生产成本。 说明书 1/5 页 3 CN 105524964 A 3 发明内容 0007 本发明主要解决的技术问题： 针对目前传统方法在提取胶。
10、原蛋白肽的过程中， 原 料主要源于畜禽动物组织， 由于疯牛病和口蹄疫的影响， 原料对于人体危害较大， 且在制备 过程中程序工艺复杂， 需要加入化学试剂， 带来了环境污染的问题， 另外还需要加入昂贵的 蛋白酶， 增加了生产成本的现状， 提供了一种以淀粉和磁性粉末制得固定化蛋白酶， 将银耳 作为原材料， 经预处理后酶解， 干燥， 从而得到银耳胶原蛋白肽。 该方法工艺简便， 原料易 得， 在制备过程中避免了漂白剂、 氧化剂等化学试剂， 对环境无任何污染问题， 利用固定化 蛋白酶代替游离蛋白酶， 使用后可以回收， 降低了生产成本， 使得最终制得的蛋白酶产率高 达90以上、 纯度高达95以上， 适合大规。
11、模应用。 0008 为了解决上述技术问题， 本发明所采用的技术方案是： （1） 称取3040g可溶性淀粉溶于300400mL去离子水中， 装入带有搅拌器和温度计的 1L三口烧瓶中， 再加入12mL浓度为0.2mol/L氯化亚铁溶液和23mL质量浓度为30%双氧 水， 启动搅拌器以300400r/min转速进行搅拌； （2） 在搅拌过程中滴加3545mL浓度为1mol/L的烧碱溶液， 控制滴加速度使其20 30min内滴加完毕， 再将三口烧瓶移入油浴锅， 加热升温至100110， 保持油浴温度不变， 继续搅拌反应34h后放入温度为46冰水浴中， 静置沉淀1012h后过滤得到滤渣， 干 燥后得到磁。
12、性淀粉微球； （3） 称取510g木瓜蛋白酶和35g碱性蛋白酶加入400500mL磷酸缓冲液中， 放置在 超声振荡仪中， 以100200W功率超声振荡2535min后， 加入2030g上述制得的磁性淀粉 微球， 继续振荡810h， 将反应液用卧式离心机以80009000r/min的转速离心1015min， 分离去除上清液， 得到固定化蛋白酶， 备用； （4） 称取400500g干银耳放入4050的温水中浸泡12h， 待其充分溶胀后， 用蒸馏 水将其表面污物清洗干净， 用剪刀将洗净后的银耳剪成1cm1cm的小块， 分别用12L浓度 为0.2mol/L烧碱和12L无水乙醇浸泡12天， 最后用去离子。
13、水冲洗57遍， 得到预处理后 的银耳； （5） 将300400g上述预处理后的银耳装入高压反应釜中， 按料液比为1:2向釜内加入 去离子水， 升高釜内温度至100200并提高压力至0.20.3MPa， 保温保压处理30 40min后出料； （6） 将上述物料移入酶解罐， 加入物料总质量12%的备用的固定化蛋白酶， 用保鲜膜 密封罐口后放入恒温箱中， 升温至4050， 保温酶解68h后， 在酶解罐周围施加匀强磁 场， 分离回收磁性固定化蛋白酶， 再将酶解液用孔径为0.40.5 m的纳滤膜进行过滤， 得到 大分子胶原蛋白肽滤液， 经喷雾干燥后研磨过100目标准筛， 即可得到银耳胶原蛋白肽粉 末。 。
14、0009 本发明的应用方法是： 使用时， 取25g本发明制得的银耳胶原蛋白肽粉末放入50 100mL化妆品乳液中， 充分混合均匀， 在每日早晚洁面后， 取35mL混合液涂抹在脸上各 个部位， 轻轻拍打使得完全吸收为止， 长期使用， 不仅可修复皮肤断裂老化的弹力纤维网， 使皮肤弹性挥发， 柔韧充盈， 而且还可消除体内自由基， 多途径抗氧化， 减缓皮肤衰老。 0010 本发明的有益效果是： 说明书 2/5 页 4 CN 105524964 A 4 （1） 本发明方法独特新颖， 原料简单易得， 在制备过程中避免了漂白剂、 氧化剂等化学 试剂， 对环境无任何污染问题； （2） 本发明在制备的过程中利用。
15、固定化蛋白酶代替游离蛋白酶， 降低了生产成本； （3） 本发明制得的银耳胶原蛋白肽粉末无色无味， 分子量为12003200D， 可广泛应用 于保健食品、 生物医药、 化妆品等与人体健康相关的行业。 具体实施方式 0011 首先称取3040g可溶性淀粉溶于300400mL去离子水中， 装入带有搅拌器和温 度计的1L三口烧瓶中， 再加入12mL浓度为0.2mol/L氯化亚铁溶液和23mL质量浓度为 30%双氧水， 启动搅拌器以300400r/min转速进行搅拌； 然后在搅拌过程中滴加3545mL 浓度为1mol/L的烧碱溶液， 控制滴加速度使其2030min内滴加完毕， 再将三口烧瓶移入油 浴锅，。
16、 加热升温至100110， 保持油浴温度不变， 继续搅拌反应34h后放入温度为46 冰水浴中， 静置沉淀1012h后过滤得到滤渣， 干燥后得到磁性淀粉微球； 随后称取5 10g木瓜蛋白酶和35g碱性蛋白酶加入400500mL磷酸缓冲液中， 放置在超声振荡仪中， 以100200W功率超声振荡2535min后， 加入2030g上述制得的磁性淀粉微球， 继续振荡 810h， 将反应液用卧式离心机以80009000r/min的转速离心1015min， 分离去除上清 液， 得到固定化蛋白酶， 备用； 接下来称取400500g干银耳放入4050的温水中浸泡1 2h， 待其充分溶胀后， 用蒸馏水将其表面污物。
17、清洗干净， 用剪刀将洗净后的银耳剪成1cm 1cm的小块， 分别用12L浓度为0.2mol/L烧碱和12L无水乙醇浸泡12天， 最后用去离子 水冲洗57遍， 得到预处理后的银耳； 之后将300400g上述预处理后的银耳装入高压反应 釜中， 按料液比为1:2向釜内加入去离子水， 升高釜内温度至100200并提高压力至0.2 0.3MPa， 保温保压处理3040min后出料； 最后将上述物料移入酶解罐， 加入物料总质量1 2%的备用的固定化蛋白酶， 用保鲜膜密封罐口后放入恒温箱中， 升温至4050， 保温酶 解68h后， 在酶解罐周围施加匀强磁场， 分离回收磁性固定化蛋白酶， 再将酶解液用孔径 为。
18、0.40.5 m的纳滤膜进行过滤， 得到大分子胶原蛋白肽滤液， 经喷雾干燥后研磨过100目 标准筛， 即可得到银耳胶原蛋白肽粉末。 0012 实例1 首先称取30g可溶性淀粉溶于300mL去离子水中， 装入带有搅拌器和温度计的1L三口烧 瓶中， 再加入1mL浓度为0.2mol/L氯化亚铁溶液和2mL质量浓度为30%双氧水， 启动搅拌器以 300r/min转速进行搅拌； 然后在搅拌过程中滴加35mL浓度为1mol/L的烧碱溶液， 控制滴加 速度使其20min内滴加完毕， 再将三口烧瓶移入油浴锅， 加热升温至100， 保持油浴温度不 变， 继续搅拌反应3h后放入温度为4冰水浴中， 静置沉淀10h后。
19、过滤得到滤渣， 干燥后得到 磁性淀粉微球； 随后称取5g木瓜蛋白酶和3g碱性蛋白酶加入400mL磷酸缓冲液中， 放置在超 声振荡仪中， 以100W功率超声振荡25min后， 加入20g上述制得的磁性淀粉微球， 继续振荡 8h， 将反应液用卧式离心机以8000r/min的转速离心10min， 分离去除上清液， 得到固定化蛋 白酶， 备用； 接下来称取400g干银耳放入40的温水中浸泡1h， 待其充分溶胀后， 用蒸馏水 将其表面污物清洗干净， 用剪刀将洗净后的银耳剪成1cm1cm的小块， 分别用1L浓度为 0.2mol/L烧碱和1L无水乙醇浸泡1天， 最后用去离子水冲洗5遍， 得到预处理后的银耳；。
20、 之后 将300g上述预处理后的银耳装入高压反应釜中， 按料液比为1:2向釜内加入去离子水， 升高 说明书 3/5 页 5 CN 105524964 A 5 釜内温度至100并提高压力至0.2MPa， 保温保压处理30min后出料； 最后将上述物料移入 酶解罐， 加入物料总质量1%的备用的固定化蛋白酶， 用保鲜膜密封罐口后放入恒温箱中， 升 温至40， 保温酶解6h后， 在酶解罐周围施加匀强磁场， 分离回收磁性固定化蛋白酶， 再将 酶解液用孔径为0.4 m的纳滤膜进行过滤， 得到大分子胶原蛋白肽滤液， 经喷雾干燥后研磨 过100目标准筛， 即可得到银耳胶原蛋白肽粉末。 0013 本实例操作简单。
21、易行， 使用时， 取2g本发明制得的银耳胶原蛋白肽粉末放入50mL 化妆品乳液中， 充分混合均匀， 在每日早晚洁面后， 取3mL混合液涂抹在脸上各个部位， 轻轻 拍打使得完全吸收为止， 长期使用， 不仅可修复皮肤断裂老化的弹力纤维网， 使皮肤弹性挥 发， 柔韧充盈， 而且还可消除体内自由基， 多途径抗氧化， 减缓皮肤衰老。 0014 实例2 首先称取35g可溶性淀粉溶于350mL去离子水中， 装入带有搅拌器和温度计的1L三口烧 瓶中， 再加入1.5mL浓度为0.2mol/L氯化亚铁溶液和2.5mL质量浓度为30%双氧水， 启动搅拌 器以350r/min转速进行搅拌； 然后在搅拌过程中滴加354。
22、5mL浓度为1mol/L的烧碱溶液， 控制滴加速度使其25min内滴加完毕， 再将三口烧瓶移入油浴锅， 加热升温至105， 保持油 浴温度不变， 继续搅拌反应3.5h后放入温度为5冰水浴中， 静置沉淀11h后过滤得到滤渣， 干燥后得到磁性淀粉微球； 随后称取8g木瓜蛋白酶和4g碱性蛋白酶加入450mL磷酸缓冲液 中， 放置在超声振荡仪中， 以150W功率超声振荡30min后， 加入25g上述制得的磁性淀粉微 球， 继续振荡9h， 将反应液用卧式离心机以8500r/min的转速离心13min， 分离去除上清液， 得到固定化蛋白酶， 备用； 接下来称取450g干银耳放入45的温水中浸泡1.5h， 。
23、待其充分溶 胀后， 用蒸馏水将其表面污物清洗干净， 用剪刀将洗净后的银耳剪成1cm1cm的小块， 分别 用1.5L浓度为0.2mol/L烧碱和1.5L无水乙醇浸泡1.5天， 最后用去离子水冲洗6遍， 得到预 处理后的银耳； 之后将350g上述预处理后的银耳装入高压反应釜中， 按料液比为1:2向釜内 加入去离子水， 升高釜内温度至150并提高压力至0.25MPa， 保温保压处理35min后出料； 最后将上述物料移入酶解罐， 加入物料总质量1.5%的备用的固定化蛋白酶， 用保鲜膜密封 罐口后放入恒温箱中， 升温至45， 保温酶解7h后， 在酶解罐周围施加匀强磁场， 分离回收 磁性固定化蛋白酶， 再。
24、将酶解液用孔径为0.45 m的纳滤膜进行过滤， 得到大分子胶原蛋白 肽滤液， 经喷雾干燥后研磨过100目标准筛， 即可得到银耳胶原蛋白肽粉末。 0015 本实例操作简单易行， 使用时， 取4g本发明制得的银耳胶原蛋白肽粉末放入80mL 化妆品乳液中， 充分混合均匀， 在每日早晚洁面后， 取4mL混合液涂抹在脸上各个部位， 轻轻 拍打使得完全吸收为止， 长期使用， 不仅可修复皮肤断裂老化的弹力纤维网， 使皮肤弹性挥 发， 柔韧充盈， 而且还可消除体内自由基， 多途径抗氧化， 减缓皮肤衰老。 0016 实例3 首先称取40g可溶性淀粉溶于400mL去离子水中， 装入带有搅拌器和温度计的1L三口烧 。
25、瓶中， 再加入2mL浓度为0.2mol/L氯化亚铁溶液和3mL质量浓度为30%双氧水， 启动搅拌器以 400r/min转速进行搅拌； 然后在搅拌过程中滴加45mL浓度为1mol/L的烧碱溶液， 控制滴加 速度使其30min内滴加完毕， 再将三口烧瓶移入油浴锅， 加热升温至110， 保持油浴温度不 变， 继续搅拌反应4h后放入温度为6冰水浴中， 静置沉淀12h后过滤得到滤渣， 干燥后得到 磁性淀粉微球； 随后称取10g木瓜蛋白酶和5g碱性蛋白酶加入500mL磷酸缓冲液中， 放置在 超声振荡仪中， 以200W功率超声振荡35min后， 加入30g上述制得的磁性淀粉微球， 继续振荡 说明书 4/5 。
26、页 6 CN 105524964 A 6 10h， 将反应液用卧式离心机以9000r/min的转速离心15min， 分离去除上清液， 得到固定化 蛋白酶， 备用； 接下来称取500g干银耳放入50的温水中浸泡2h， 待其充分溶胀后， 用蒸馏 水将其表面污物清洗干净， 用剪刀将洗净后的银耳剪成1cm1cm的小块， 分别用2L浓度为 0.2mol/L烧碱和2L无水乙醇浸泡2天， 最后用去离子水冲洗7遍， 得到预处理后的银耳； 之后 将400g上述预处理后的银耳装入高压反应釜中， 按料液比为1:2向釜内加入去离子水， 升高 釜内温度至200并提高压力至0.3MPa， 保温保压处理40min后出料； 。
27、最后将上述物料移入 酶解罐， 加入物料总质量2%的备用的固定化蛋白酶， 用保鲜膜密封罐口后放入恒温箱中， 升 温至50， 保温酶解8h后， 在酶解罐周围施加匀强磁场， 分离回收磁性固定化蛋白酶， 再将 酶解液用孔径为0.5 m的纳滤膜进行过滤， 得到大分子胶原蛋白肽滤液， 经喷雾干燥后研磨 过100目标准筛， 即可得到银耳胶原蛋白肽粉末。 0017 本实例操作简单易行， 使用时， 取5g本发明制得的银耳胶原蛋白肽粉末放入100mL 化妆品乳液中， 充分混合均匀， 在每日早晚洁面后， 取5mL混合液涂抹在脸上各个部位， 轻轻 拍打使得完全吸收为止， 长期使用， 不仅可修复皮肤断裂老化的弹力纤维网， 使皮肤弹性挥 发， 柔韧充盈， 而且还可消除体内自由基， 多途径抗氧化， 减缓皮肤衰老。 说明书 5/5 页 7 CN 105524964 A 7 。