贝类多倍体倍性检测方法 【技术领域】
本发明属于细胞工程育种的多倍体诱导技术领域，涉及一种人工诱导贝类多倍体中使用的倍性检测方法，尤指在规模化诱导鲍鱼、牡蛎、扇贝等贝类多倍体时使用的一种贝类多倍体倍性检测方法。
背景技术
无论是人工诱导多倍体的研究实验，还是多倍体规模化养殖生产，都要求在早期胚胎发育阶段就能快速且及时地对多倍体率做出检测，从而对其诱导结果的有效性做出准确的评估。在目前的贝类多倍体人工诱导实验中，往往通过取样早期胚胎、幼虫、稚贝、成贝组织，经染色体制片后进行染色体条数统计，或者取样并制成细胞悬液后，使用流式细胞仪进行倍性检测来鉴定多倍体诱导的效果。虽然这两种方法被广泛使用于目前的多倍体诱导研究中，尤其是流式细胞仪检测法具有快速和准确率高等优点。但染色体制片时易引起染色体缺失，且鉴定过程耗时较长，无法及时地获得鉴定结果；而流式细胞仪检测时需要一定数量的细胞样品，这对发育早期的个体很难鉴定，还有价格昂贵，使用成本高。再者，这两种方法都要求操作者具有专业的实验操作水平。所以，这两种鉴定方法都无法对其多倍体率做出快速且及时地检测。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种设备简单、容易掌握、能够快速检测和统计出多倍体率的贝类多倍体倍性检测方法，该方法能即时了解了诱导方法的有效性，提高了诱导方法的准确性。
为实现上述目的，本发明的技术解决方案是：
本发明是一种贝类多倍体倍性检测方法，其操作步骤如下：当理化因子作用于贝类受精卵，抑制第1极体或第2极体释放来诱导贝类多倍体时，在早期胚胎发育的2-4细胞期，在显微镜下分别统计仅释放1个极体和释放2个极体的受精卵数，并计算多倍体率。
该方法包括三倍体率检测法和四倍体率检测法。四倍体率检测法又分为抑制第1极体释放时的四倍体率检测法和同时抑制第1极体和第2极体释放时的四倍体率检测法。
1、三倍体率检测法：
当理化因子作用于贝类受精卵，抑制第2极体释放来诱导贝类三倍体时，在早期胚胎发育的2-4细胞期，在显微镜下分别统计仅释放1个极体和释放2个极体的受精卵数，并计算三倍体率；计算公式：三倍体率＝仅释放1个极体的受精卵数/(仅释放1个极体的受精卵数+释放2个极体的受精卵数)×100％。
2、四倍体率检测法
(1)抑制第1极体释放时的四倍体率检测法
当理化因子作用于贝类受精卵，抑制第1极体的释放来诱导产生贝类四倍体时，在早期胚胎发育的2-4细胞期，显微镜下分别统计此细胞期内仅释放1个极体和释放2个极体的受精卵数，并计算四倍体率；计算公式：四倍体率＝仅释放1个极体未的受精卵数/(仅释放1个极体的受精卵数+释放2个极体的受精卵数)×100％。
(2)同时抑制第1极体和第2极体释放时的四倍体率检测法
当理化因子作用于贝类受精卵，同时抑制第1极体和第2极体的释放来诱导产生贝类四倍体时，在早期胚胎发育的2-4细胞期，显微镜下分别统计此细胞期内无极体释放的受精卵数和总受精卵数，并计算四倍体率；计算公式：四倍体率＝(无极体释放的卵数-对照组的无极体释放的卵数)/总卵数×100％。
(1)由于本发明在早期胚胎发育时期就可对贝类多倍体诱导实验和规模化养殖生产的多倍体率进行检测和统计，所以能直观、准确并即时地对诱导效果做出鉴定。
(2)由于本发明能直观、准确并即时地对诱导效果做出鉴定，有助于迅速调整各诱导参数至最佳组合，从而避免多倍体诱导的盲目性和常规染色体倍性检测的延迟性，缩短实验周期，节约成本。
(3)由于本发明只需通过简单的显微镜观察和细胞计数就能有效地对多倍体诱导效果做出鉴定，对工作人员的实验操作水平要求不高，在生产中的可操作性更强。
综上所述，本发明与常规贝类多倍体倍性检测法相比，能快速地检测和统计出多倍体率，更直观、准确且即时地鉴定多倍体诱导的有效性，避免了染色体倍性检测的延迟性和多倍体诱导的盲目性，缩短实验周期，节约实验成本。有利于人工诱导贝类多倍体技术在生产上的大规模推广应用。
【具体实施方式】
本发明是一种观察极体释放情况来检测和统计多倍体率，从而鉴定人工诱导多倍体有效性的方法，包括三倍体率检测法和四倍体率检测法；所述的三倍体率检测法，即理化因子抑制第2极体释放诱导贝类三倍体时，在早期胚胎发育的2-4细胞期，显微镜下分别统计仅释放1个极体和释放2个极体的受精卵数，并计算三倍体率，计算公式：三倍体率＝仅释放1个极体的受精卵数/(仅释放1个极体的受精卵数+释放2个极体的受精卵数)×100％；所述的四倍体率检测法因诱导方式的不同分为：抑制第1极体释放时的四倍体率检测法、同时抑制第1极体和第2极体释放时地四倍体率检测法。
所述的抑制第1极体释放时的四倍体率检测法，即理化因子抑制第1极体的释放来诱导产生贝类四倍体时，在早期胚胎发育的2-4细胞期，显微镜下分别统计此细胞期内第1极体未释放的受精卵数和第1极体释放的受精卵数，并计算四倍体率，计算公式：四倍体率＝仅释放1个极体的受精卵数/(仅释放1个极体的受精卵数+释放2个极体的受精卵数)×100％。
所述的同时抑制第1极体和第2极体释放时的四倍体率检测法，即理化因子同时抑制第1极体和第2极体释放来诱导产生贝类四倍体时，在早期胚胎发育的2-4细胞期，显微镜下分别统计此细胞期内无极体释放的受精卵数和总受精卵数，并计算四倍体率，计算公式：四倍体率＝(无极体释放的卵数-对照组的无极体释放的卵数)/总卵数×100％。
实验结果表明，这种用极体个数法即时鉴定多倍体率的检测方法所表达的多倍体率与成贝的多倍体率呈正相关性。
实施例1：抑制贝类受精卵第二极体的释放诱导三倍体：
在胚胎发育早期的2-4细胞期，镜检到1个极体的受精卵数有70个，2个极体的受精卵数有50个，则其三倍体率＝70/(70+50)×100％＝58.3％.
实施例2：抑制贝类受精卵第一极体的释放诱导四倍体：
在胚胎发育早期的2-4细胞期，镜检到1个极体的受精卵数有90个，2个极体的受精卵数有60个，则其四倍体率＝90/(90+60)×100％＝60.0％.
实施例3：抑制贝类受精卵第一极体和第二极体的释放诱导四倍体：
在胚胎发育早期的2-4细胞期，镜检到样品中无极体的卵数有80个，有极体的卵数40个(其中有1个极体的卵数15个，有2个极体的卵数25个)，即镜检的总卵数为120个，而对照组的无极体的卵数有20个，则其四倍体率＝(80-20)/(80+40)×100％＝50.0％。