技术领域
本发明涉及一种具有广泛宿主的穿梭表达载体。
背景技术
生物冶金是近二十年来冶金领域十分活跃的学科之一，已在铜、金、铀等金属的 提取方面实现了工业应用。生物冶金是通过利用微生物的作用将金属矿物氧化、还原 或络合分解，使金属离子进入溶液，进一步分离、富集、纯化而提取金属的技术。生 物冶金与常规物理、化学选冶方法相比，具有过程简单、成本低、能耗低、对环境污 染小等突出优点，特别适于贫矿、废矿、表外矿及难采、难选、难冶矿的堆浸和就地 浸出。在当今资源需求量较大、易开发资源越来越紧缺、环保要求不断提高的情况下， 微生物冶金技术的应用展现了特有的优越性和广阔的发展空间。
喜温嗜酸硫杆菌（Acidithiobacillus caldus）广泛分布于硫化矿床、酸性矿水 及土壤中，在细菌冶金、煤碳脱硫和含硫废水的处理、自然界的硫循环等方面发挥着 重要作用。当它和铁氧化冶金微生物混合培养时，可以有效促进金属离子的溶出，从 而提高冶金效率。因此，喜温嗜酸硫杆菌是一种重要的生物冶金微生物。但是在实际 应用过程中，该菌存在生长缓慢、细胞得率低以及对冶金环境适应性差等缺点，严重 限制了其应用范围。因此，要充分发挥喜温嗜酸硫杆菌在生物冶金的功能，对其进行 遗传改造势在必行。
为实现对喜温嗜酸硫杆菌的深入研究和功能改造，构建一个稳定而有效的遗传操 作系统的平台是非常必要的。现有技术中所用的遗传操作系统接合频率大多在10-4以 下，影响了喜温嗜酸硫杆菌的遗传操作效率（特别是敲除质粒的效率），因此，开发一 种高效的遗传操作系统是相关学者亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有广泛宿主的穿梭表达载体。
本发明提供了一种质粒，包括如下元件：复制原点oriV、复制蛋白Rep的编码基 因、接合起点oriT、接合蛋白Mob的编码基因和外源基因表达盒；所述外源基因表达 盒自上游至下游依次包括启动子、供外源基因插入的多克隆酶切位点（MCS）以及转录 终止序列。
所述复制原点oriV如序列表的序列1自5’末端第2041至2530位核苷酸所示。
所述接合起点oriT如序列表的序列1自5’末端第4234至4235位核苷酸所示。
所述复制蛋白Rep由复制蛋白RepA、复制蛋白RepB和复制蛋白RepC组成。所述 复制蛋白RepC的编码基因的反向互补序列如序列表的序列1自5’末端第81至755 位核苷酸所示。所述复制蛋白RepB的编码基因如序列表的序列1自5’末端第6337 至7425位核苷酸所示。所述复制蛋白RepA的编码基因的反向互补序列如序列表的序 列1自5’末端第946至1803位核苷酸所示。
所述接合蛋白Mob由接合蛋白MobE、接合蛋白MobD、结合蛋白MobC、结合蛋白 MobB和结合蛋白MobA组成。所述接合蛋白MobE的编码基因的反向互补序列如序列表 的序列1自5’末端第2461至3105位核苷酸所示。所述接合蛋白MobD的编码基因的 反向互补序列如序列表的序列1自5’末端第3065至3748位核苷酸所示。所述结合 蛋白MobC的编码基因的反向互补序列如序列表的序列1自5’末端第3761至4159位 核苷酸所示。所述结合蛋白MobB的编码基因如序列表的序列1自5’末端第4227至 4739位核苷酸所示。所述结合蛋白MobA的编码基因如序列表的序列1自5’末端第 4897至7425位核苷酸所示。
所述启动子具体可为连四硫酸盐水解酶基因tetH的启动子。所述连四硫酸盐水解 酶基因tetH的启动子如序列表的序列3自5’末端第76至156位核苷酸所示。
所述转录终止序列如序列表的序列5自5’末端第51至100位核苷酸所示。
所述多酶切克隆位点（MCS）具体可如序列表的序列4所示。
所述质粒还可包括一个以上的筛选基因。所述筛选基因可为卡那霉素抗性基因和/ 或链霉素筛选基因。所述卡那霉素抗性基因具体可如序列表的序列2自5’末端第469 至1263位核苷酸所示。所述链霉素筛选基因（aadA基因）具体可如序列表的序列6 自5’末端第132至950位核苷酸所示。
所述质粒具体可如序列表的序列7所示。
所述外源基因具体可如序列表的序列8所示。
复制原点oriV及复制蛋白Rep使得质粒具有广泛宿主能力。接合起点oriT及接 合蛋白Mob使得质粒具有高效接合转移的能力。连四硫酸盐水解酶基因tetH的启动子 能够被喜温嗜酸硫杆菌（Acidithiobacillus caldus）SM-1中的转录蛋白识别，使得 插入基因能够在喜温嗜酸硫杆菌（Acidithiobacillus caldus）SM-1中启动转录。
本发明还保护一种表达外源基因的方法（方法甲），包括如下步骤：
（1）将外源基因插入以上所述质粒的任一多克隆位点，得到重组质粒；
（2）将所述重组质粒转化宿主菌并在宿主菌中表达所述外源基因。
所述方法甲中，所述宿主菌可为喜温嗜酸硫杆菌（Acidithiobacillus caldus）， 具体可为喜温嗜酸硫杆菌（Acidithiobacillus caldus）SM-1。所述方法甲中，所述 宿主菌可为大肠杆菌，如大肠杆菌SM10。
本发明还保护另一种表达外源基因的方法（方法乙），包括如下步骤：
（1）将外源基因插入以上所述质粒的任一多克隆位点，得到重组质粒；
（2）将所述重组质粒转化宿主菌，得到供体菌；
（3）通过共培养，将所述供体菌中的所述重组质粒导入所述受体菌，得到重组菌；
（4）培养所述重组菌，表达所述外源蛋白。
所述方法乙中，所述宿主菌可为大肠杆菌，如大肠杆菌SM10。所述方法乙中，所 述受体菌可为喜温嗜酸硫杆菌（Acidithiobacillus caldus），具体可为喜温嗜酸硫杆 菌（Acidithiobacillus caldus）SM-1。
本发明还保护以上任一所述的质粒在喜温嗜酸硫杆菌的遗传转化中的应用。
所述喜温嗜酸硫杆菌具体可为喜温嗜酸硫杆菌（Acidithiobacillus caldus） SM-1。
本发明提供的质粒具有广泛宿主能力，可在宿主中稳定复制，且具有高的接合转 移频率。本发明对于喜温嗜酸硫杆菌的遗传转化具有重大价值。
附图说明
图1为pLAtcE-eGFP在大肠杆菌中表达后的荧光检测结果
图2为pLAtcE-eGFP在喜温嗜酸硫杆菌中表达后的荧光检测结果。
图3为PCR扩增基因鉴定质粒的结果。
图4为重组质粒pLAtcE的结构示意图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实 验，结果取平均值。pET-28a-c(+)载体：郑州威瑞生物技术有限公司，69864-3。大肠 杆菌SM10：Biomedal，BS3303。喜温嗜酸硫杆菌（Acidithiobacillus caldus）SM-1： 参考文献：You XY,Guo X,Zheng HJ,Zhang MJ,Liu LJ,Zhu YQ,Zhu B,Wang SY, Zhao GP,Poetsch A,Jiang CY,Liu SJ.Unraveling the Acidithiobacillus caldus complete genome and its central metabolisms for carbon assimilation.J Genet Genomics.2011,38(6):243-52。
实施例1、穿梭表达载体（重组质粒pLAtcE）的构建
一、构建质粒pLAtc-Kmr
1、合成序列表的序列1所示的双链DNA分子（8144bp）。序列表的序列1中，自 5’末端第81至755位核苷酸为复制蛋白RepC的编码基因的反向互补序列，第946 至1803位核苷酸为复制蛋白RepA的编码基因的反向互补序列，第2041至2530位核 苷酸为复制原点oriV，第2461至3105位核苷酸为接合蛋白MobE的编码基因的反向 互补序列，第3065至3748位核苷酸为接合蛋白MobD的编码基因的反向互补序列，第 3761至4159位核苷酸为结合蛋白MobC的编码基因的反向互补序列，第4234至4235 位核苷酸为接合起点oriT，第4227至4739位核苷酸为结合蛋白MobB的编码基因， 第4897至7425位核苷酸为结合蛋白MobA的编码基因，第6337至7425位核苷酸为复 制蛋白RepB的编码基因。
2、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子(1333bp)。序列表的序列2中，第5’ 末端第469至1263位核苷酸为卡那霉素抗性基因。
3、同时将步骤1合成的双链DNA分子和步骤2合成的双链DNA分子为模板，采用 F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到双链环形DNA分子(9426bp)，命名为重组 质粒pLAtc-Kmr。
F1：5’-CTTTCTCCAGCAGCGATTCCGCAGTAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTG-3’；
R1：5’-GGGTGAGTGGCATTCGGTTGTTATCTGGCGACACGGAAATGTTGAATAC-3’。
二、构建APMT片段
1、合成序列表的序列3所示的双链DNA分子（168bp）。序列表的序列3中，自5’ 末端第76至156位核苷酸为喜温嗜酸硫杆菌SM-1基因组中的连四硫酸盐水解酶基因 tetH的启动子。
2、合成序列表的序列4所示的双链DNA分子（218bp）。序列表的序列4中，自5’ 末端第25至30位核苷酸为EcoRI酶切识别序列，第59至64位核苷酸为HindIII酶 切识别序列，第65-70位核苷酸为KpnI、Acc65I或Asp718I酶切识别序列，第77至 82位核苷酸为BamHI酶切识别序列，第118至123位核苷酸为EcoRV酶切识别序列， 第134至141位核苷酸为NotI酶切识别序列，第141至146位核苷酸为XhoI或SciI 酶切识别序列，第193至198位核苷酸为MluI酶切识别序列，第197至202位核苷酸 为HpaI酶切识别序列。
3、合成序列表的序列5所示的双链DNA分子（130bp）。序列表的序列5中，自5’ 末端第51至100位核苷酸为转录终止序列。
4、合成序列表的序列6所示的双链DNA分子（1011bp）。序列表的序列6中，自 5’末端第132至950位核苷酸为链霉素筛选基因（aadA基因）。
5、同时将步骤1合成的双链DNA分子、步骤2合成的双链DNA分子、步骤3合成 的双链DNA分子和步骤4合成的双链DNA分子作为模板，用F2和R2组成的引物对进 行PCR扩增，得到PCR扩增产物（1471bp，命名为APMT片段）。
F2：5’-CGTGCCTAGGTCTAGATGAAAATGCCG-3’；
R2：5’-AAGGACGTCTCGCCAATCCGGATATAGTTC-3’。
三、构建重组质粒pLAtcE
1、以步骤一构建的重组质粒pLAtc-Kmr为模板，用F3和R3组成的引物对进行PCR 扩增，得到PCR扩增产物（约9412bp）。
F3：5’-ATCGACGTCCAACCGAATGCCACTCACCC-3’；
R3：5’-TCACCTAGGCAGCGACACGGAAATGTTGAATACTC-3’。
2、用限制性内切酶AvrII和AatII双酶切步骤1得到的PCR扩增产物，回收酶切 产物。
3、用限制性内切酶AvrII和AatII双酶切步骤二得到的APMT片段，回收酶切产 物。
4、将步骤2的酶切产物和步骤3的酶切产物连接，得到重组质粒。重组质粒 pLAtcE。重组质粒pLAtcE的测序结果如序列表的序列7所示（10885bp）。重组质粒 pLAtcE的结构示意图见图4。
实施例2、穿梭表达载体（重组质粒pLAtcE）的应用
一、构建重组质粒pLAtcE-eGFP
1、合成序列表的序列8所示的双链DNA分子（eGFP基因）。
2、以步骤1合成的双链DNA分子为模板，用F4和R4组成的引物对进行PCR扩增， 得到PCR扩增产物。
F4：5’-CCCGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGCCGAGCTGTTC-3’；
R4：5’-CCCAAGCTTTCACTTGTACAGCTCATCCATGCCGTG-3’。
3、用限制性内切酶EcoRI和HindIII双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产 物。
4、用限制性内切酶EcoRI和HindIII双酶切重组质粒pLAtcE，回收载体骨架。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pLAtcE-eGFP。 根据测序结果对重组质粒pLAtcE-eGFP进行结构描述如下：在重组质粒pLAtcE的 EcoRI和HindIII酶切位点之间插入了序列表的序列8所示的双链DNA分子。
二、构建重组菌
将重组质粒pLAtcE-eGFP导入大肠杆菌SM10，得到重组菌。
三、重组菌的荧光检测
1、将步骤二构建的重组菌接种至含50μg/ml卡那霉素和50μg/ml链霉素的LB 液体培养基中，37℃条件下200rpm培养3h，得到OD600nm=0.4的培养体系。
2、向步骤1的培养体系中加入连四硫酸钾（使其浓度为3mg/ml），37℃、200rpm 振荡培养3h。
3、用荧光显微镜检测步骤2得到的培养体系的eGFP荧光发生情况。照片见图1， 可以观察到绿色荧光。
四、重组菌对喜温嗜酸硫杆菌的接合转移能力
Starky液体培养基：含3g/L(NH4)2SO4、3g/L KH2PO4、0.5g/L MgSO4·7H2O、0.25g/L CaCl2·2H2O和10g/L硫，其它为水。
洗涤液：含3g/L(NH4)2SO4、3g/L KH2PO4、0.5g/L MgSO4·7H2O和0.25g/L CaCl2·2H2O，其它为水。
Starky固体培养基的制备方法：溶液A：(NH4)2SO4 0.6g、KH2PO4 0.6g、MgSO4·7H2O 0.1g、CaCl2·2H2O 0.05g，加蒸馏水至100ml，自然pH4.8，15磅/cm2灭菌20min； 溶液B：琼脂粉2g、蒸馏水100mL，15磅/cm2灭菌20min；溶液C：K2S4O6 0.15g/mL， 其余为水，过滤灭菌；溶液A和溶液B分别煮沸后冷却至80℃混合，然后加入4mL溶 液C混匀，制备固体平板。
大肠杆菌-喜温嗜酸硫杆菌接合培养基：在Starky-K2S4O6固体培养基中加入酵母 粉，使其浓度为0.05g/100ml。
以步骤二得到的重组菌为供体菌，以喜温嗜酸硫杆菌SM-1为受体菌，在大肠杆菌 -喜温嗜酸硫杆菌接合培养基的滤膜(滤膜放置在培养基上面)上进行接合，具体步骤如 下：
1、在37℃条件下培养供体菌至对数后期，离心收集供体菌，用洗涤液洗涤2次。
2、在40℃条件下培养受体菌至稳定期，离心收集供体菌，用洗涤液洗涤2次。
3、用洗涤液重悬供体菌、得到供体菌浓度为100μg/mL的供体菌菌液，用洗涤液 重悬受体菌、得到受体菌浓度为100μg/mL的受体菌菌液，将供体菌菌液和受体菌菌 液按照1:2的体积比混合，然后涂布于大肠杆菌-喜温嗜酸硫杆菌接合培养基平板的硝 酸纤维素滤膜上，37℃培养72h，然后用洗涤液洗涤平板并收集菌体，用Starky液体 培养基稀释后涂布含于含有50μg/ml卡那霉素和50μg/ml链霉素的Starky固体培养 基平板，长出的菌落即为抗生素阳性菌落。
接合频率=得到的抗生素阳性菌落的数量/用于进行该实验的供体菌的数量 =1.50×10-3。
4、将抗生素阳性菌落进行PCR鉴定。
用于PCR鉴定eGFP基因的引物对如下：
CCCGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGCCGAGCTGTTC；
CCCAAGCTTTCACTTGTACAGCTCATCCATGCCGTG；
靶序列片段为719bp。
用于鉴定Kmr基因的引物对如下：
AACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTG；GCGACACGGAAATGTTGAATAC；
靶序列片段大小为1280bp。
用于鉴定Smr基因的引物对如下：
GCCTAGGTCTAGATGAAAAT，AACTGCAGGAGCTCAGCCAATCGACTG；
靶序列片段大小为985bp。
结果均获得合适大小的阳性条带。
回收各个目的条带并测序，证实为eGFP基因、Kmr基因Smr基因序列。
5、将抗生素阳性菌落涂平板后在荧光显微镜下观察，结果有绿色荧光，如图2 所示。
6、从抗生素阳性菌落中提取质粒并转化大肠杆菌SM10，在含50μg/ml卡那霉素 和50μg/ml链霉素的LB固体培养基平板上培养，挑取阳性克隆扩大培养并提取质粒 进行步骤4相同的PCR鉴定。
结果见图3，均获得合适大小的阳性条带。
回收各个目的条带并测序，确实为eGFP基因、Kmr基因Smr基因序列。