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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610228088.1 (22)申请日 2016.04.13 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 国家林业局泡桐研究开发中心 地址 450008 河南省郑州市金水区纬五路 3 号 (72)发明人 傅建敏 乌云塔娜 韩卫娟 孙鹏 刁松锋 张嘉嘉 罗颖 张悦 (74)专利代理机构 北京权泰知识产权代理事务 所 ( 普通合伙 ) 11460 代理人 王道川 (54) 发明名称 利用 cpDNA 分子标记进行柿种质鉴定的方法 (57) 摘要 本发明涉及一种利用 cpDNA 分子标记进。
2、行柿 种质鉴定的方法， 所述柿 cpDNA 分子标记的扩增 引物如 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 2 所示。所述 利用 cpDNA 分子标记进行柿种质鉴定的方法包括 如下步骤 ： 利用分子标记引物 PCR 扩增标准种质 ； 利用分子标记引物 PCR 扩增目标种质， 目标种质 即为待鉴定的种质 ； 将以上两个步骤得到的扩增 结果进行比对， 根据比对结果是否一致进行种质 鉴定， 所用分子标记的正向引物和反向引物分别 如 SEQ ID NO ： 1 和 SEQ ID NO ： 2 所示。本发明操 作简单、 重现性好、 效率高， 可以有效的鉴别未知 材料为柿种或为其他柿属植物。
3、。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书6页 序列表1页 附图1页 CN 105648105 A 2016.06.08 CN 105648105 A 1.一种柿cpDNA分子标记的扩增引物， 其特征在于， 如SEQIDNO： 1或SEQIDNO： 2所 示。 2.一种权利要求1所述柿cpDNA分子标记的扩增引物的筛选方法， 其特征在于， 包括如 下步骤： 对标准种质的cpDNA测序； 对目标种质的cpDNA测序， 目标种质即为待鉴定的种质； 将以上两个步骤得到的测序结果进行比对， 获得差异区域并设计引物； 经过PCR扩增、 。
4、纯化 和重测序后， 筛选到能够有效鉴别柿种和其他柿属植物的扩增引物。 3.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 所述差异区域为大于20bp的片段。 4.根据权利要求2或3所述的方法， 其特征在于， 所述标准种质的数量为3个或3个以上。 5.一种利用cpDNA分子标记进行柿种质鉴定的方法， 其特征在于， 包括如下步骤： 利用 分子标记引物PCR扩增标准种质； 利用分子标记引物PCR扩增目标种质， 目标种质即为待鉴 定的种质； 将以上两个步骤得到的扩增结果进行比对， 根据比对结果是否一致进行种质鉴 定， 所用分子标记的正向引物和反向引物分别如SEQIDNO： 1和SEQIDNO： 2所示。 6。
5、.根据权利要求5所述的方法， 其特征在于， 所述利用分子标记引物PCR扩增步骤前还 包括提取标准种质和目标种质的叶绿体全基因组DNA。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述提取标准种质和目标种质的叶绿体全 基因组DNA包括如下步骤： 步骤1、 在1.5ml离心管中加入800 lCTABDNA提取缓冲液， 所述提取缓冲液包括pH8.0 100mMTris-HCl、 1.4MNaCl和pH8.020mMEDTA， 再加入30 l -巯基乙醇， 混匀后置于65 水浴预热； 步骤2、 取0.3g叶片， 加入液氮充分研磨至粉末状， 迅速转移至步骤1中的离心管中， 于 65水浴裂解2h， 期。
6、间振荡混匀3-5次； 步骤3、 水浴结束后， 取出离心管冷却， 于室温12000rpm离心12min； 步骤4、 离心后用移液枪将700 l上清液转入1.5ml另一离心管中， 加入700 l氯仿和异 戊醇的混合溶液， 其中氯仿与异戊醇的体积比为24:1， 轻轻颠倒混匀10min， 于4下 12000rpm离心10min； 步骤5、 重复2-3次步骤4， 直至无白色沉淀层为止； 步骤6、 将上清液转入1.5ml再一离心管中， 加入700 l预冷的异丙醇， 轻轻混匀至出现 透明絮状DNA沉淀， 于4下10000rpm离心6min， 弃上清液； 步骤7、 在步骤6后的离心管中加入1000 l预冷的体。
7、积百分比为75的乙醇溶液， 洗涤 沉淀2次， 每次10000rpm离心6min， 弃乙醇， 室温下风干至乙醇完全挥发； 步骤8、 在步骤7后的离心管中加入500 11MNaCl， 充分溶解DNA后， 加入2 l10mg/ml RNase， 于37水浴1h； 步骤9、 在步骤8后的离心管中再加入1ml无水乙醇， 混匀后-20沉淀DNA15h； 步骤10、 于4下8000rpm离心10min， 弃上清液， 体积百分比为75的乙醇溶液洗涤DNA 2次， 每次8000rpm离心6min， 弃乙醇， 室温风干至乙醇完全挥发； 步骤11、 再加入200 lTE缓冲液成分溶解DNA， DNA样品置于-20保。
8、存备用。 8.根据权利要求5-7任一项所述的方法， 其特征在于， 所述PCR扩增条件如下： 所述PCR扩增反应体系如下： 权利要求书 1/2 页 2 CN 105648105 A 2 所述PCR扩增程序为： (1)94预变性3min； (2)94变性45s； (3)52退火1min； (4)72 延伸50s； (5)返回步骤(2)， 重复35个循环； (6)4保存。 9.一种柿遗传资源多样性的分析方法， 为分子标记扩增分析法， 其特征在于， 利用权利 要求1所述柿cpDNA分子标记的扩增引物进行扩增分析。 10.一种包含权利要求1所述柿cpDNA分子标记的扩增引物的检测试剂盒。 权利要求书 2。
9、/2 页 3 CN 105648105 A 3 利用cpDNA分子标记进行柿种质鉴定的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种柿种质鉴定的方法， 特别是涉及一种利用cpDNA分子标记进行柿 种质鉴定的方法。 背景技术 0002 全世界的柿属(Diospyrosspp.)植物共190种左右， 其中有乔木、 灌木， 有落叶的 也有常绿性的， 大部分分布在热带和亚热带。 我国柿属植物资源丰富， 经济利用价值较高， 主要分布在西南和华南地区。 0003 左大勋(1984)等报道的我国柿属植物有58种和变种(型)(不包括国外引入种)， 其 中特有种27种。 中文版 中国植物志 (1987)中记载， 我国。
10、有64种和变种(型)， 其中有57种， 6 变种， 1变型， 1栽培种。 王仁梓(1988)等报道我国柿属植物共有66种， 包括从国外引入种。 英 文版 中国植物志 (1996)虽也记载我国柿属植物有64种和变种(60种、 4变种)， 但其内容却 与中文版 中国植物志 不尽一致。 张鸿龄(1994)、 罗正荣(1996)以及杨勇(2005)等报道均 和中文版 中国植物志 一致。 发明人根据 中国植物志 (中英文版)以及各地方 植物志 或 树木志 共计32份资料， 统计可知我国柿属植物共有78种和变种(型)(68种、 8变种、 2变 型)。 此外， 我国广袤的南方山区尤其是西南和华南山区存在着大。
11、量的野生柿属资源， 这些 野生资源的分类地位不明确， 为柿(品)种还是其他柿属植物需要更进一步鉴别。 0004 由此可见， 我国柿属植物资源种类记载不一， 地方植物志与国家植物志对柿属植 物的统计不尽一致， 许多柿属植物资源分类地位不明确， 这对我国柿属植物资源的收集、 保 存以及利用造成一定影响， 进而影响柿属植物杂交育种工作的开展。 0005 目前主要是从形态学和分子生物学进行植物资源鉴别分类， 传统的形态鉴别法依 赖于表型差异， 而表型的形态性状却受气候、 环境、 营养状态以及生物期等多种因素影响， 且形态鉴别法工作量大、 鉴别周期长、 成本高。 在木本植物的鉴别分类研究中， 多应用RA。
12、PD、 SSR、 AFLP等分子标记技术， 但是这些标记大多是采用无全基因组序列信息的技术开发得 到， 虽具有一定的应用价值， 但随机性强、 稳定性差。 并且由于柿属植物资源倍性复杂， 其核 基因组结构和序列也是复杂多变， 而相较于核基因， 叶绿体基因组结构和序列非常保守， 但 至今未发现关于利用cpDNA分子标记进行柿属植物资源种间系统进化和亲缘关系研究的报 道。 发明内容 0006 本发明为了解决上述问题而提供了一种利用cpDNA分子标记进行柿种质鉴定的方 法， 该方法所利用的cpRNA分子标记鉴别能力强且重现性好， 能够有效的鉴别未知资源为柿 种或为其他柿属植物， 同时为我国柿属植物资源。
13、的鉴别、 遗传进化分析及亲缘关系分析提 供重要技术支持， 对我国柿属植物杂交育种及开发利用具有重大的意义。 0007 本发明提供了一种柿cpDNA分子标记的扩增引物， 如SEQIDNO： 1或SEQIDNO： 2 所示。 说明书 1/6 页 4 CN 105648105 A 4 0008 本发明还提供了一种所述柿cpDNA分子标记的扩增引物的筛选方法， 包括如下步 骤： 对标准种质的cpDNA测序； 对目标种质的cpDNA测序， 目标种质即为待鉴定的种质； 将以 上两个步骤得到的测序结果进行比对， 获得差异区域并设计引物； 经过PCR扩增、 纯化和重 测序后， 筛选到能够有效鉴别柿种和其他柿属。
14、植物的扩增引物。 0009 进一步地， 所述差异区域为大于20bp的片段。 0010 更进一步地， 所述标准种质的数量为3个或3个以上。 0011 本发明还提供了一种利用cpDNA分子标记进行柿种质鉴定的方法， 包括如下步骤： 利用分子标记引物PCR扩增标准种质； 利用分子标记引物PCR扩增目标种质， 目标种质即为 待鉴定的种质； 将以上两个步骤得到的扩增结果进行比对， 根据比对结果是否一致进行种 质鉴定， 所用分子标记的正向引物和反向引物分别如SEQIDNO： 1和SEQIDNO： 2所示。 0012 所述利用分子标记引物PCR扩增步骤前还包括提取标准种质和目标种质的叶绿体 全基因组DNA。。
15、 0013 进一步地， 所述提取标准种质和目标种质的叶绿体全基因组DNA包括如下步骤： 0014 步骤1、 在1.5ml离心管中加入800 lCTABDNA提取缓冲液， 所述提取缓冲液包括 pH8.0100mMTris-HCl、 1.4MNaCl和pH8.020mMEDTA， 再加入30 l -巯基乙醇， 混匀后置 于65水浴预热； 0015 步骤2、 取0.3g叶片， 加入液氮充分研磨至粉末状， 迅速转移至步骤1中的离心管 中， 于65水浴裂解2h， 期间振荡混匀3-5次； 0016 步骤3、 水浴结束后， 取出离心管冷却， 于室温12000rpm离心12min； 0017 步骤4、 离心后。
16、用移液枪将700 l上清液转入1.5ml另一离心管中， 加入700 l氯仿 和异戊醇的混合溶液， 其中氯仿与异戊醇的体积比为24:1， 轻轻颠倒混匀10min， 于4下 12000rpm离心10min； 0018 步骤5、 重复2-3次步骤4， 直至无白色沉淀层为止； 0019 步骤6、 将上清液转入1.5ml再一离心管中， 加入700 l预冷的异丙醇， 轻轻混匀至 出现透明絮状DNA沉淀， 于4下10000rpm离心6min， 弃上清液； 0020 步骤7、 在步骤6后的离心管中加入1000 l预冷的体积百分比为75的乙醇溶液， 洗涤沉淀2次， 每次10000rpm离心6min， 弃乙醇， 。
17、室温下风干至乙醇完全挥发； 0021 步骤8、 在步骤7后的离心管中加入500 11MNaCl， 充分溶解DNA后， 加入2 l 10mg/mlRNase， 于37水浴1h； 0022 步骤9、 在步骤8后离心管中再加入1ml无水乙醇， 混匀后-20沉淀DNA15h； 0023 步骤10、 于4下8000rpm离心10min， 弃上清液， 体积百分比为75的乙醇溶液洗 涤DNA2次， 每次8000rpm离心6min， 弃乙醇， 室温风干至乙醇完全挥发； 0024 步骤11、 再加入200 lTE缓冲液成分溶解DNA， DNA样品置于-20保存备用。 0025 优选地， 所述PCR扩增条件如下：。
18、 0026 所述PCR扩增反应体系如下： 说明书 2/6 页 5 CN 105648105 A 5 0027 0028 所述PCR扩增程序为： (1)94预变性3min； (2)94变性45s； (3)52退火1min； (4)72延伸50s； (5)返回步骤(2)， 重复35个循环； (6)4保存。 0029 本发明还提供了一种柿遗传资源多样性的分析方法， 为分子标记扩增分析法， 利 用所述柿cpDNA分子标记的扩增引物进行扩增分析。 0030 本发明还提供了一种包含所述柿cpDNA分子标记的扩增引物的检测试剂盒。 0031 本发明通过对5份柿属植物材料的叶绿体全基因组测序后比对， 确定差异。
19、区域并 设计引物， 经过PCR扩增、 纯化和重测序， 筛选到1对可用于鉴别柿种和其他柿属植物的特异 性引物， 所述特异性引物可以有效的鉴别未知材料为柿种或为其他柿属植物。 该方法具有 操作简单、 重现性好、 效率高等特点， 对研究柿种间系统发育以及柿新种的鉴别提供重要的 技术手段， 也为我国柿属植物资源的鉴别、 遗传进化分析及亲缘关系分析提供重要技术支 持， 对我国柿属植物杂交育种及开发利用具有重大的意义。 附图说明 0032 图1为本发明利用cpDNA分子标记进行柿种质鉴定的方法中鉴别云南野毛柿为其 他柿属植物的系统发育树图。 具体实施方式 0033 下面通过具体实施例进一步说明本发明利用c。
20、pDNA分子标记进行柿种质鉴定的方 法的技术方案。 0034 第一实施例、 柿属植物材料的获得 0035 从中国林业科学研究院经济林研发中心柿种质资源圃采集了15份柿属植物材料， 从中国科学院西双版纳植物园采集1份待鉴别柿属植物材料-云南野毛柿(学名D.spp.)， 从 目前的文献记载和传统形态分类学无法鉴别云南野毛柿为柿种或为其他柿属植物， 来自中 国林科院的15份样品具体信息如表1所示。 0036 表1、 15个柿属植物材料的具体信息 说明书 3/6 页 6 CN 105648105 A 6 0037 0038 第二实施例、 柿属植物材料基因组DNA的提取 0039 采用改良的CTAB法从。
21、上述16份柿属植物材料样品的叶片中提取叶绿体全基因组 DNA(cpDNA)， 具体方法如下： 0040 步骤201、 在1.5ml离心管中加入800 lCTABDNA提取缓冲液， 所述提取缓冲液包 括100mMTris-HCl(pH8.0)、 1.4MNaCl和20mMEDTA(pH8.0)， 再加入30 l -巯基乙醇， 混 匀后置于65水浴预热； 0041 步骤202、 取0.3g叶片， 加入液氮充分研磨至粉末状， 迅速转移至步骤201中的离心 管中， 于65水浴裂解2h， 期间振荡混匀3-5次； 0042 步骤203、 水浴结束后， 取出离心管冷却， 于室温12000rpm离心12min。
22、； 0043 步骤204、 离心后用移液枪将700 l上清液转入1.5ml另一离心管中， 加入700 l氯 仿和异戊醇的混合溶液(氯仿和异戊醇体积比24： 1)， 轻轻颠倒混匀10min， 于4下 12000rpm离心10min； 0044 步骤205、 重复2-3次步骤204， 直至无白色沉淀层为止； 0045 步骤206、 将上清液转入1.5ml再一离心管中， 加入700 l预冷的异丙醇， 轻轻混匀 至出现透明絮状DNA沉淀， 于4下10000rpm离心6min， 弃上清液； 0046 步骤207、 在步骤206后的离心管中加入1000 l预冷的体积百分比为75的乙醇溶 液， 洗涤沉淀2次。
23、， 每次10000rpm离心6min， 弃乙醇， 室温下风干至乙醇完全挥发； 0047 步骤208、 在步骤207后的离心管中加入500 11MNaCl， 充分溶解DNA后， 加入2 l RNase(10mg/ml)， 于37水浴1h； 0048 步骤209、 在步骤208后的离心管中再加入1ml无水乙醇， 混匀后-20沉淀DNA 说明书 4/6 页 7 CN 105648105 A 7 15h； 0049 步骤210、 于4下8000rpm离心10min， 弃上清液， 体积百分比为75的乙醇溶液洗 涤DNA2次， 每次8000rpm离心6min， 弃乙醇， 室温风干至乙醇完全挥发； 0050。
24、 步骤211、 再加入200 lTE缓冲液(10mMTris-HCl、 1mMEDTA， pH8.0)溶解DNA， DNA样品置于-20保存备用。 0051 第三实施例、 引物的筛选 0052 1、 确定目的基因片段 0053 选取代表性柿品种(磨盘柿)及其他柿属植物(金枣柿、 君迁子、 浙江柿以及油柿) 材料的叶绿体总DNA样品； 0054 将上述5份柿属植物材料的cpDNA进行测序， 通过多序列比对， 确定一个大于20bp 的插入/缺失目的基因片段； 0055 2、 筛选引物 0056 根据上述目的基因片段设计引物， 按照下述体系(如表2所示)和条件进行PCR扩 增： 0057 表2、 P。
25、CR反应体系 0058 0059 PCR反应条件为： 0060 0061 上述方法获得的PCR产物通过Gelred染色的浓度为2.0的琼脂糖凝胶电泳检测。 采用Bio-red公司凝胶成像系统观察并记录谱带。 利用UniQ柱型回收试剂盒(上海生物工程 有限公司)回收纯化扩增产物， 所得产物在自动测序仪上进行双向测序。 0062 通过上述PCR扩增反应和重测序， 最终筛选出一对可用于鉴别柿种和其他柿属植 说明书 5/6 页 8 CN 105648105 A 8 物的特异性引物。 引物信息如下： 0063 正向引物： 5 -TCAAAGAGGGAGGTTTCT-3 ， 如SEQIDNO： 1所示； 。
26、0064 反向引物： 5 -CCGTTATTCGGAGGTTCG-3 如SEQIDNO： 2所示。 0065 第四实施例、 系统发育树的构建 0066 利用第三实施例中所述方法和筛选的引物对16份柿属植物材料进行PCR扩增反应 和重测序。 0067 对15份柿属植物材料和待鉴别柿属植物材料-云南野毛柿所测得序列用Clustal X软件(Thompson,1997)进行对位排列， 然后利用MEGA软件， 使用邻近法(TheNeighbor- Jioning， NJ)建立起始树， 再采用最大似然法(MaximumCompositeLikelihood， ML)找到最 似然树， 并利用bootstrap(1000次重复)检验各分支的置信度。 0068 图1的结果表明： 经上述方法鉴定， 云南野毛柿为其他柿属植物， 即用1对引物就可 将其鉴别为其他柿属植物。 说明书 6/6 页 9 CN 105648105 A 9 0001 序列表 1/1 页 10 CN 105648105 A 10 图1 说明书附图 1/1 页 11 CN 105648105 A 11 。