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1、(10)申请公布号 CN 103614419 A (43)申请公布日 2014.03.05 CN 103614419 A (21)申请号 201310627393.4 (22)申请日 2013.11.29 C12P 7/18(2006.01) C12R 1/12(2006.01) (71)申请人 内蒙古科技大学 地址 014010 内蒙古自治区包头市昆区阿尔 丁大街 7 号 (72)发明人 潘建刚 蔡禄 张艾艾 高国日 张金艳 (74)专利代理机构 包头市专利事务所 15101 代理人 庄英菊 (54) 发明名称 一种利用浮萍为原料制备 2,3- 丁二醇的方 法 (57) 摘要 本 发 明 涉。
2、 及 一 种 利 用 浮 萍 为 原 料 制 备 2,3- 丁二醇的方法， 属于环境生物技术和生物质 能源领域。本发明以水生植物浮萍为主要原料， 采用液态发酵方法制备 2,3- 丁二醇。生产工艺 包括 ： 添加 - 淀粉酶和糖化酶对浮萍悬液进行 糖化处理 ； 向液体种子培养基中接种多黏芽孢 杆菌， 通过摇床震荡培养获得液态种子 ； 向装有 预处理好的浮萍细胞液发酵罐中接种体积比为 6-8% 的液态种子， 通过发酵得到液态发酵产物。 本发明不仅解决了浮萍在污水净化过程中因大量 繁殖而可能导致的二次污染， 而且也为 2,3- 丁二 醇的生物炼制提供了可再生的原料来源。特别是 该法作为非粮作物的 2。
3、,3- 丁二醇发酵的替代法， 还可以有效缓解世界范围内粮食短缺的紧张局 面。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103614419 A CN 103614419 A 1/1 页 2 1. 一种利用浮萍为原料制备 2,3- 丁二醇的方法， 其特征在于， 1）发酵培养基的制 备 ： 采用下列原料， 质量体积比为 ： 浮萍淀粉水解液总糖浓度 80.0g/L， 酵母膏 6.0g/L， (NH4)2HPO41.0g/L， KCl0.2g/L，。
4、 MgSO4 7H2O0.3g/L， CaCO33g/L， pH6.0， 将上述培养基在 115 下， 高压灭菌 30min 备用 ； 2） 发酵条件的设定 ： 然后按 6%-8%(V:V) 的接种量接入液态种子， 先在 30、 200r/min 条件下发酵 24h， 接着在温度不变的情况下调整转速 160r/min， 发酵 24h， 以利于 2,3- 丁二醇的合成， 最后通过高效液相色谱检测 2,3 一丁二醇的含量。 权 利 要 求 书 CN 103614419 A 2 1/3 页 3 一种利用浮萍为原料制备 2,3- 丁二醇的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种利用浮萍为原料制备 2,。
5、3- 丁二醇的方法， 属于环境生物技术和 生物质能源领域。 背景技术 0002 当今世界面临资源短缺和环境污染两大难题， 发展低碳、 环保的循环经济发展模 式已经迫在眉睫， 而生物制造产业已成为当前发展低碳经济的重要途径之一。2,3- 丁二醇 作为一种重要的化工原料和液体燃料， 广泛应用于化工、 能源、 食品以及航空航天等多个等 领域， 因此它已经成为当前生物制造产物发展的重要领域之一。 就其自身而言， 它是一种极 具价值的液体燃料， 因而常备用作航空燃料 ； L-2,3- 丁二醇由于极低的凝固点而用作抗冻 剂。 作为合成前体， 由它合成的化合物则具有更广泛的功能， 如双乙酰是一种具有很高价值。
6、 的风味剂， 3- 羟基 -2- 丁酮 ( 乙偶姻 ) 是一种天然食用香料， 二者广泛应用在食品工业中 ； 1,3- 丁二烯则用于合成橡胶、 合成树脂的生产 ； 甲乙酮不仅是一种高价值的液体燃料添加 剂， 而且也常用作低沸点溶剂， 在粘结剂、 涂料、 燃料、 润滑剂、 油墨等行业应用十分广泛 （戴 建英， 孙亚琴， 孙丽慧， 李丹， 董悦生， 修志龙 . 生物基化学品 2,3- 丁二醇的研究进展 . 过程 工程学报,2010,10(1):200-208.） 。 目前用于2,3-丁二醇生产的方法主要有化学法和生物 发酵法两大类 , 化学法采用的是石油化工路线， 需高温高压， 且工艺复杂、 污染严。
7、重 ； 相比 而言， 生物发酵法则可以弥补上述缺陷， 特别是对于 2,3- 丁二醇的手性结构特征， 生物发 酵法则具有化学法无法比拟的优势。 而生物发酵法生产又常以淀粉、 乳清和糖蜜为原料， 需 要指出的是后两者的资源有限， 而淀粉又将与我国粮食短供需的不足相矛盾， 因此寻求廉 价的非粮物质发酵原料已经成为制约该产业发展的瓶颈问题， 特别是关于利用浮萍为原料 发酵生产 2,3- 丁二醇的研究还没有报道。 0003 浮萍是一种漂浮的单子叶水生植物， 在全世界广泛分布， 常见于静止或流动性不 大的水体及湖泊的港湾部分， 共有 4 属 40 个种， 其中以芜萍、 紫背浮萍、 稀脉浮萍、 三叉浮 萍、。
8、 槐叶萍和满江红较为常见。浮萍不仅可以吸收污染水体中的氮、 磷等营养物质， 而且 其生长速率高并可以耐受多种污水条件， 因此该类植物是污水处理生态工程中重要的水 生植物类群 ( 张营 , 郜炜 , 景逵 , 曲文杰 , 李崇 . 凤眼莲和浮萍对水中硝基苯的净化及 动力学研究 . 辽宁大学学报自然科学版， 2013， 40(1):92-96)。此外， 浮萍的营养成分也 非常丰富， 蛋白质含量高， 纤维含量低， 淀粉含量因不同种而有很大变化， 通常约 25% 左右 （Klass DLDuckweed Plants for Waste-water Reuse and Biomass Producti。
9、onM Chicago:Institute of Gas Technology， 1993:423-432 ） 。如果种植条件适宜， 其生产能 力也非常可观， 每公顷每年大约能生产淀粉 11.4t( 赵昭， 姚广保， 张艺琼， 赵玄 . 猪场污水 中浮萍生物量和淀粉含量变化研究.四川大学学报(自然科学版),2012,49(3):693-698)。 因此， 它可以作为一种非常好的天然培养基， 满足微生物对碳源、 氮源的需求， 特别是它的 再生能力很强， 因此它是极好的 2,3- 丁二醇非粮发酵的替代原料， 目前以浮萍为原料制备 燃料乙醇、 生物柴油和丁醇的报道较多， 但是利用它为原料发酵产 2,。
10、3- 丁二醇的研究并未 说 明 书 CN 103614419 A 3 2/3 页 4 出现。 0004 浮萍是一类可再生资源， 它在净化污水的同时， 也为生物能源的炼制提供了丰富 的原料， 特别是浮萍在净化污水后将大量繁殖， 其巨大的数量如果不能及时处理， 也将造成 水体的二次污染， 因此将浮萍的生物能源处理与污水治理耦合进行， 将会取长补短， 起到事 半功倍的效果， 因此该技术具有广阔的发展前景。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种利用浮萍为原料制备 2,3- 丁二醇的方法。 0006 技术解决方案 ： 0007 制备方法如下 ： 0008 1） 发酵培养基的制备 ： 采用下列原料，。
11、 质量体积比为 ： 浮萍淀粉水解液总糖浓度 80.0g/L， 酵 母 膏 6.0g/L， (NH4)2HPO41.0g/L， KCl0.2g/L， MgSO47H2O0.3g/L， CaCO33g/L， pH6.0， 将上述培养基在 115下， 高压灭菌 30min 备用 ； 0009 2）发酵条件的设定 ： 然后按 6%-8%(V:V) 的接种量接入液态种子， 先在 30、 200r/min 条件下发酵 24h， 接着在温度不变的情况下调整转速 160r/min， 发酵 24h， 以利于 2,3- 丁二醇的合成， 最后通过高效液相色谱检测 2,3 一丁二醇的含量。 0010 本发明生产的 2。
12、,3- 丁二醇具有环境友好的特点， 不仅解决了浮萍在污水净化过 程中因大量繁殖而可能导致的二次污染， 而且也为 2,3- 丁二醇的生物炼制提供了可再生 的原料来源。特别是该法作为非粮作物的 2,3- 丁二醇发酵的替代法， 还可以有效缓解世界 范围内粮食短缺的紧张局面。 附图说明 0011 图 1 为本发明流程图。 具体实施方式 0012 浮萍淀粉水解液的制备 ： 将浮萍洗净、 干燥， 然后粉碎过 60 目筛， 利用无菌水按 1:8 的体积比例将其调制成悬浊液， 然后向其中加入中温 - 淀粉酶和 0.2% 的 CaCl2， 于 60液化数分钟， 期间用碘液检测淀粉的降解效果， 直至颜色由蓝色变为。
13、棕橙色为止。 接着 在沸水浴状态下将过量的 - 淀粉酶酶活灭活。 0013 待其冷却后， 在 pH 值约为 4.5 的条件下再向其中加入糖化酶使其充分降解为单 糖， 多余的糖化酶再在沸水浴条件下灭活， 最后利用 3,5- 二硝基水杨酸法测定其还原糖 的含量 （具体方法参照陈毓荃主编 . 生物化学实验方法和技术， 北京 ： 科学出版社， 2002） 。 其原理是利用还原糖能在碱性条件下与二硝基水杨酸发生氧化还原反应， 而反应终产物 3- 氨基 -5- 硝基水杨酸在沸水浴条件下呈现出棕红色， 且该产物颜色的深浅与还原糖的量 成正比。 0014 种子制备及培养 ： 发酵菌种选取多黏芽孢杆菌(Baci。
14、llus polymyxa)， 其原因主要 是因为该菌种不仅能够利用多种还原糖碳源， 特别是它还能够分泌淀粉酶。利用液体种子 培养基制备发酵所需液态种子。培养基 (g/L) 配制方法如下 ： 取浮萍淀粉水解液还原糖浓 度为 2.0， 葡萄糖 3.0， 酵母膏 5.0， (NH4)2HPO41.0， KCl0.2， MgSO47H2O0.3， pH6.0， 用高压灭 说 明 书 CN 103614419 A 4 3/3 页 5 菌锅在115灭菌25-30min备用。 接种方法是先用接种环将目的菌种接种到100ml液体种 子培养基中， 再用摇床在 30、 150r/min 条件下培养 24h 即得。
15、到液态种子。 0015 发酵培养基 (g/L) 的制备 ： 浮萍淀粉水解液总糖浓度 80.0， 酵母膏 6.0， (NH4)2HPO41.0， KCl0.2， MgSO47H2O0.3， CaCO33， pH6.0。同样， 以上培养基在 115下 , 高 压灭菌 30min 备用。然后按 5-10%(V:V) 的接种量将入液态种子， 先在 30、 200r/min 条 件下发酵 24h， 使其有利于种子的菌体生长， 接下来在温度不变的情况下调整转速 160r/ min， 发酵 24h， 以利于 2,3- 丁二醇的合成 （杨欢欢 , 高健 , 徐虹 , 邵荣 . 利用菊芋菊粉制 备 R,R-2,。
16、3- 丁二醇发酵工艺条件的优化 . 食品与发酵工业， 2011,37(11):6-10） 。从而提 高目的产物产量。 0016 2,3- 丁二醇的提取和定量分析 ： 采用高效液相色谱法从发酵液中分离纯化 2,3-丁二醇。 具体方法参照张媛丽的方法 （(张媛丽.菊芋发酵液中2,3一丁二醇的盐析萃 取 . 大连理工大学 2011 届硕士毕业论文 ,16-25） 。其工艺流程如下 ： 先将发酵液在 8000r/ min 的条件下离心 20min， 以去除发酵液中大量的残渣和细小微粒， 再用滤膜过滤， 之后再 将所得上清液经高效液相色谱分离纯化。鉴于检测浓度的问题， 所得上清液要进行适当的 倍数稀释。。
17、 色谱条件如下 ： 玻璃管填充色谱柱， 填料为Chromsorb101,5mm2m ； 检测器为 FID， 柱温为 170， 汽化室的温度为 200， 检测器的温度为 220 ； 载气为 N2， 流速 50ml/ min， 样品进样量为 1ul， 采用外标法测定产物的含量。 0017 实施例 1 0018 用 250ml 的三角瓶进行摇瓶发酵培养。发酵培养基的总体积为 60ml， 其中各成分 的质量体积比例如下 ： 浮萍淀粉水解液总糖浓度 80.0g/L， 酵母膏 6.0g/L， (NH4)2HPO41.0g/ L， KCl0.2g/L， MgSO47H2O0.3g/L， CaCO33g/L，。
18、 pH6.0。将上述培养基在 115下， 高压灭菌 30min备用。 然后按8%(V:V)的接种量将入液态种子， 先在30、 200r/min条件下发酵24h， 接着在温度不变的情况下调整转速160r/min， 发酵24h， 以利于2,3-丁二醇的合成， 最后通 过高效液相色谱检测 2,3 一丁二醇的含量。 0019 实施例 2 0020 取 8g 浮萍粉 （淀粉含量 30%， 蛋白质含量 15%） 、 3.6g 酵母膏、 6.0g(NH4)2HPO4、 1.2g KCl、 1.8gMgSO4 7H2O， 加入 48.4ml 的蒸馏水， 置于 250ml 的三角瓶中， 用盐酸和氢氧化钠调 节 PH 值至 6.0， 并向制备好的液体培养基中加入质量体积浓度为 0.2% 的 CaCl2以保证酶解 效果， 然后分别用中温淀粉酶和糖化酶使淀粉糖化， 115灭菌30分钟， 最后向其中加 入经过干热灭菌的， CaCO34.8g， 然后按 6%(V:V) 的接种量将种子液接种到发酵培养基中， 在 30、 160r/min 条件下于发酵 60h 后， 利用高效液相色谱检测发酵产物的类型并对其进行 定量。 说 明 书 CN 103614419 A 5 1/1 页 6 图 1 说 明 书 附 图 CN 103614419 A 6 。