技术领域
本发明属于水稻淀粉粒分离纯化方法的技术领域，具体涉及一种水稻A、B型淀粉粒分离纯化方法。
背景技术
淀粉是禾谷类作物胚乳的主要成分，以淀粉粒的形式存在。水稻胚乳中至少包含两种群体的淀粉粒，通常被人们称之为A型和B型淀粉粒。A型淀粉粒比较大，直径一般在10-38μm，呈透镜状，重量占胚乳总淀粉粒总量的70％–80％，但数量还不到总淀粉粒的10％；B型淀粉粒直径小于10μm，呈球形或不规则的多面体，重量占胚乳总淀粉粒总量不到30％，而数量占总淀粉粒数目的90％以上。
前人研究表明，水稻A、B型淀粉粒具有不同的形成机理和理化特性，进而影响到籽粒加工品质和食用品质。此外，水稻淀粉粒是由直链淀粉、支链淀粉和少量蛋白质和脂类物质组成，各自的数量在A、B型淀粉粒中存在一定的差异。特别是B型淀粉粒体积小、数量多，比表面积相对大，从而可以结合更多的蛋白质、直链淀粉、脂类和水。B型淀粉粒数目多，导致了面团吸水率高,而A型淀粉粒则相反。因此，不同品种A、B型淀粉粒分布的不同将改变米团的流变学特性。要准确地研究A、B型淀粉粒形成机理及理化特性，分离提纯出高纯度的A、B型淀粉粒是首要任务。
关于水稻A、B型淀粉粒分离纯化方法，国内外都有一些研究。韦存虚等提出了A、B型淀粉粒常量的分离纯化方法，即将分离的总淀粉在水溶液静置2小时，沉淀下来的主要为A型淀粉粒，悬浮液主要是B型淀粉粒，然后再用此方法多次分别纯化沉淀(A型淀粉粒)和悬浮液(B型淀粉粒)Peng等提出并比较了用10μm孔径的尼龙筛、80％(w/v)的麦芽糖溶液、80％(w/v)的蔗糖溶液和70％与100％(v/v)细胞分离液微量分离纯化A、B型淀粉粒的4种方法，最终实验结果表明用70％与100％(v/v)细胞分离液分离纯化淀粉粒的效果最好。尽管A、B型淀粉粒在常量与微量水平分离纯化已有方法，但各自纯度还需进一步提高。
有鉴于此，有必要提出一种新的水稻A、B型淀粉粒分离纯化方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种水稻A、B型淀粉粒分离纯化方法，该方法具有A、B型淀粉粒纯度高，操作简便、可行性高的优点。
为了实现上述目的，所采用的技术方案为：
一种水稻A、B型淀粉粒分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备水稻总淀粉粒：
在3-5℃的温度下，将水稻籽粒浸泡在质量分数为0.8-1.2％的氢氧化钠溶液46-50小时后，去除种皮，取出胚乳，用水清洗胚乳2-3次，得水稻籽粒胚乳；
向水稻籽粒胚乳中加水，并研磨10-12分钟，得研磨液；
将研磨液在4000-6000g的离心力下离心4-6分钟后，研磨液分层，上层为上清液，下层为沉淀物，收集沉淀物，得水稻总淀粉粒沉淀；
用氯化铯溶液洗涤水稻总淀粉粒沉淀3-4次，得水稻总淀粉粒粗品；所述用氯化铯溶液洗涤水稻总淀粉粒沉淀指：向水稻总淀粉粒沉淀中加入水，使水稻总淀粉粒沉淀悬浮后，加入氯化铯溶液，再离心；所述氯化铯溶液中：氯化铯的质量与氯化铯溶液的体积比为8-12g：100ml；
将水稻总淀粉粒粗品先用wash buffer离心洗涤2-3次，再用水离心洗涤2-3次，之后再用体积分数为70-80％的乙醇溶液离心洗涤2-3次，得水稻总淀粉粒湿品；风干水稻总淀粉粒湿品，得水稻总淀粉粒；
(2)分离纯化水稻A、B型淀粉粒：
向水稻总淀粉粒中加水，使水稻总淀粉粒悬浮，得水稻总淀粉粒悬浮液；将水稻总淀粉粒悬浮液平铺在体积分数为75-85％的细胞分离液表面，在18-22g的离心力下离心18-22分钟后，分层，上层为B型淀粉粒悬浮液，下层为A型淀粉粒沉淀；
用体积分数为90-100％的细胞分离液洗涤A型淀粉粒沉淀2-3次，得A型淀粉粒粗品；所述用体积分数为90-100％的细胞分离液洗涤A型淀粉粒沉淀指：向A型淀粉粒沉淀中加入水，使A型淀粉粒沉淀悬浮，得A型淀粉粒沉淀悬浮液；将A型淀粉粒沉淀悬浮液平铺在体积分数为95-100％的细胞分离液表面后，再离心；
将A型淀粉粒粗品先用水离心洗涤2-3次，再用体积分数为70-80％的乙醇溶液离心洗涤2-3次，得A型淀粉粒湿品；风干A型淀粉粒湿品，得A型淀粉粒；
将B型淀粉粒悬浮液在4000-6000g的离心力下离心18-22分钟后，得B型淀粉粒沉淀；向B型淀粉粒沉淀中加入体积分数为75-85％的细胞分离液，在18-22g的离心力下离心18-22分钟后，分层得上层悬浮液1和下层沉淀1；将上层悬浮液1在4000-6000g的离心力下离心18-22分钟后，分层得下层沉淀2和上层悬浮液2；向下层沉淀2中加入体积分数为75-85％的细胞分离液，在18-22g的离心力下离心18-22分钟后，分层得上层悬浮液3和下层沉淀3，下层沉淀3为B型淀粉粒粗品；
将B型淀粉粒粗品先用水离心洗涤2-3次，再用体积分数为70-80％的乙醇溶液离心洗涤2-3次，得B型淀粉粒湿品；风干B型淀粉粒湿品，得B型淀粉粒。
进一步的，所述步骤(1)中，浸泡水稻籽粒的温度为4℃，浸泡时间为48小时。
进一步的，所述步骤(1)中，水稻籽粒的数量与氢氧化钠溶液的体积比为4-6粒：1.0-2.0ml。
再进一步的，所述步骤(1)中，水稻籽粒的数量与氢氧化钠溶液的体积比为5粒：1.5ml。
再进一步的，所述步骤(1)中，氢氧化钠溶液的质量分数为1.0％。
进一步的，所述步骤(1)中：
所述用氯化铯溶液洗涤中：离心力为4000-6000g，离心时间为4-6分钟；
所述用wash buffer离心洗涤中：离心力为4000-6000g，离心时间为4-6分钟；
所述用水离心洗涤中：离心力为4000-6000g，离心时间为4-6分钟；
所述用乙醇溶液离心洗涤中：离心力为4000-6000g，离心时间为18-22分钟；
所述步骤(2)中：
所述用细胞分离液洗涤A型淀粉粒沉淀中：离心力为9-11g，离心时间为18-22分钟；
所述用水离心洗涤A型淀粉粒粗品中：离心力为4000-6000g，离心时间为4-6分钟；
所述用乙醇溶液离心洗涤A型淀粉粒粗品中：离心力为4000-6000g，离心时间为18-22分钟；
所述用水离心洗涤B型淀粉粒粗品中：离心力为4000-6000g，离心时间为4-6分钟；
所述用乙醇溶液离心洗涤B型淀粉粒粗品中：离心力为4000-6000g，离心时间为18-22分钟。
再进一步的，所述步骤(1)中：
所述研磨液的离心过程中：离心力为5000g，离心时间为5分钟；
所述用氯化铯溶液洗涤中：离心力为5000g，离心时间为5分钟；
所述用wash buffer离心洗涤中：离心力为5000g，离心时间为5分钟；
所述用水离心洗涤中：离心力为5000g，离心时间为5分钟；
所述用乙醇溶液离心洗涤中：离心力为5000g，离心时间为20分钟；
所述步骤(2)中：
所述水稻总淀粉粒悬浮液平铺在体积分数为80％的细胞分离液表面，在20g的离心力下离心20分钟；
所述用细胞分离液洗涤A型淀粉粒沉淀中：离心力为10g，离心时间为20分钟；
所述用水离心洗涤A型淀粉粒粗品中：离心力为5000g，离心时间为5分钟；
所述用乙醇溶液离心洗涤A型淀粉粒粗品中：离心力为5000g，离心时间为20分钟；
所述B型淀粉粒悬浮液在5000g的离心力下离心20分钟；
所述B型淀粉粒沉淀中加入体积分数为75-85％的细胞分离液，在20g的离心力下离心20分钟；
所述上层悬浮液1在5000g的离心力下离心20分钟；
所述下层沉淀2中加入体积分数为75-85％的细胞分离液，在20g的离心力下离心20分钟；
所述用水离心洗涤B型淀粉粒粗品中：离心力为5000g，离心时间为5分钟；
所述用乙醇溶液离心洗涤B型淀粉粒粗品中：离心力为5000g，离心时间为20分钟。
再进一步的，所述步骤(1)中：
所述氯化铯溶液中：氯化铯的质量与氯化铯溶液的体积比为10g：100ml；
所述水稻总淀粉粒粗品先用wash buffer离心洗涤，再用水离心洗涤，之后再用体积分数为75％的乙醇溶液离心洗涤；
所述步骤(2)中：
所述A型淀粉粒沉淀用体积分数为100％的细胞分离液洗涤；
所述A型淀粉粒粗品先用水离心洗涤，再用体积分数为75％的乙醇溶液离心洗涤；
所述B型淀粉粒沉淀中加入体积分数为80％的细胞分离液；
所述下层沉淀2中加入体积分数为80％的细胞分离液；
所述B型淀粉粒粗品先用水离心洗涤，再用体积分数为75％的乙醇溶液离心洗涤。
再进一步的，所述细胞分离液为Percoll细胞分离液。
再进一步的，所述水为去离子水。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明所述的一种水稻A、B型淀粉粒分离纯化方法，用体积分数为75-85％的Percoll细胞分离液，将水稻A、B型淀粉粒分离开来；然后用体积分数为75-85％的Percoll细胞分离液多次纯化B型淀粉粒，用体积分数为90-100％的Percoll细胞分离液多次纯化A型淀粉粒，再用水和酒精洗涤水稻A、B型淀粉粒，可以提高水稻A、B型淀粉粒的纯度。并且用乙醇溶液洗涤水稻淀粉粒和水稻A、B型淀粉粒，可以去除淀粉中的酵母菌等，起到消毒的作用，使淀粉粒长时间保存；并且乙醇溶液与现有技术中常用的丙酮溶液相比，毒性低，安全性高。
2、本发明所述的一种水稻A、B型淀粉粒分离纯化方法，该方法操作简便、可行性高。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明一种水稻A、B型淀粉粒分离纯化方法，达到预期发明目的，以下结合较佳实施例，对依据本发明提出的一种水稻A、B型淀粉粒分离纯化方法，其具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外，一或多个实施例中的特定特征、结构或特点可由任何合适形式组合。
在详细阐述本发明一种水稻A、B型淀粉粒分离纯化方法之前，有必要对本发明中提及的原料等做进一步说明，以达到更好的效果。
实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件进行。实施例中所用原料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明采用的原料有：
氢氧化钠，化学式为NaOH，相对分子质量为40.01，俗称烧碱、火碱、苛性钠，为一种具有强腐蚀性的强碱，一般为片状或颗粒形态。纯品是无色透明的晶体，密度2.130g/cm3，熔点318.4℃，沸点1390℃。氢氧化钠易溶于水(溶于水时放热)并形成碱性溶液，另有潮解性，易吸取空气中的水蒸气(潮解)和二氧化碳(变质)。NaOH是化学实验室其中一种必备的化学品，亦为常见的化工品之一。氢氧化钠在水处理中可作为碱性清洗剂，溶于乙醇和甘油；不溶于丙醇、乙醚；在高温下对碳钠也有腐蚀作用；与氯、溴、碘等卤素发生歧化反应；与酸类起中和作用而生成盐和水。
氯化铯，分子式为ClCs，分子量为168.3585，为一种无机盐，无色立方晶体，熔点645℃，沸点1290℃，相对密度3.988；易溶于水、乙醇、甲醇，不溶于丙酮。在空气中吸湿潮解。氯化铯，主要用作分析试剂和制取金属铯和含铯单晶的原料；可以用于制备导电玻璃；还可以用于通过密度梯度离心方法制备从DNA中分离RNA的溶液。
wash buffer，是一种洗涤缓冲液。它含有亚硫酸氢钠(SBS)、磷酸缓冲溶液等。本发明实施例中采用的wash buffer的生产厂家为生工生物工程(上海)股份有限公司
乙醇俗称酒精，是一种有机物，结构简式CH3CH2OH或C2H5OH，分子式C2H6O，是最常见的一元醇。乙醇液体密度是0.789g/cm3，乙醇气体密度为1.59kg/m3，相对密度(d15.56)0.816，式量(相对分子质量)为46.07g/mol，沸点是78.4℃，熔点是-114.3℃。乙醇在常温常压下是一种易燃、易挥发的无色透明液体，低毒性，纯液体不可直接饮用；具有特殊香味，并略带刺激；微甘，并伴有刺激的辛辣滋味。乙醇易燃，其蒸气能与空气形成爆炸性混合物，能与水以任意比互溶。乙醇能与氯仿、乙醚、甲醇、丙酮和其他多数有机溶剂混溶。乙醇的用途很广，可用乙醇制造醋酸、饮料、香精、染料、燃料等。医疗上也常用体积分数为70％～75％的乙醇作消毒剂等，在国防化工、医疗卫生、食品工业、工农业生产中都有广泛的用途。
Percoll细胞分离液是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。渗透压很低，粘度也很小，可形成高达1.3g/ml密度，采用预先形成的密度梯度时可在低离心力(200-1000g)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于Percoll扩散常数低，所形成的梯度十分稳定。此外，Percoll不穿透生物膜，对细胞无毒害，因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。本发明中优先选用的为体积分数为75-85％的细胞分离液和体积分数为90-100％的细胞分离液；体积分数为75-85％的细胞分离液的密度介于水稻A、B型淀粉粒之间，并更接近B型淀粉粒的密度，用它可以将水稻A、B型淀粉粒分离开来。
质量分数即质量百分比浓度，是物理学术语，指溶液中某种溶质的质量占全部溶液的质量的百分比。
体积分数，又名体积浓度，指在相同的温度和压力下，物质B的体积VB与溶液的体积V之比，称为物质B的体积分数，符号为表达式为其值可用小数或百分数表示。
w/v是质量体积百分比浓度，即100毫升溶液中所含溶质的克数。
本发明中所述离心洗涤的操作为：向待洗涤物中加入洗涤液后，再离心，固液分离，弃掉液体，保留固态物质。
在了解了上述原料等之后，下面将对本发明一种水稻A、B型淀粉粒分离纯化方法做进一步的详细介绍：
一实施例
实施例1-5中采用的水稻籽粒为总淀粉含量高的品种T-43，于2016年春种植于新疆石河子北泉镇天业农业研究所，按常规滴灌随水施肥栽培方法管理直到水稻正常成熟。
实施例1.
具体操作步骤如下：
(1)制备水稻总淀粉粒：
①：在3℃的温度下，将4粒成熟水稻籽粒浸泡在1.0ml的质量分数为1.2％的氢氧化钠溶液46小时后，用镊子去除种皮，取出胚乳，用2.0ml去离子水清洗胚乳2次，得水稻籽粒胚乳。
②：将水稻籽粒胚乳放入研钵，加1.0mL去离子水，并研磨10分钟，得研磨液。
③：将研磨液转入2.0mL离心管中，在4000g的离心力下离心6分钟后，研磨液分层，上层为上清液，下层为沉淀物，倒掉上清液(上清液为黄色胶状物)，收集沉淀物，得水稻总淀粉粒沉淀。
④：a：向水稻总淀粉粒沉淀中加入0.5mL去离子水，使水稻总淀粉粒沉淀悬浮后，(加水使水稻总淀粉粒沉淀悬浮是因为：水稻总淀粉粒沉淀中还含有一定量的蛋白等物质，直接加氯化铯溶液，形成的混合液不均一稳定，易影响实验结果；加水使水稻总淀粉粒沉淀悬浮可以提高溶液的均一稳定性，更有利于实验操作及结果)加入1.0mL 8％(w/v)氯化铯溶液，再在4000g的离心力下离心6分钟，倒掉上清液；b:重复a步骤3次，即用1.0mL 8％(w/v)氯化铯溶液洗涤水稻总淀粉粒沉淀3次，确保没有双缩脲反应，得水稻总淀粉粒粗品。上述氯化铯溶液中：氯化铯的质量与氯化铯溶液的体积比为8g：100ml，即氯化铯溶液的质量体积百分比浓度(w/v)为8％。
⑤：将水稻总淀粉粒粗品先用1.0mL wash buffer离心洗涤2次，离心力为6000g，离心时间为4分钟；再用去离子水离心洗涤3次，离心力为4000g，离心时间为6分钟；之后再用体积分数为70％的乙醇溶液离心洗涤3次，离心力为4000g，离心时间为22分钟，得水稻总淀粉粒湿品；风干水稻总淀粉粒湿品，得水稻总淀粉粒。水稻总淀粉粒-20℃贮藏备用。
(2)分离纯化水稻A、B型淀粉粒：
⑥：向0.5g水稻总淀粉粒中加0.5mL去离子水，使水稻总淀粉粒悬浮，得水稻总淀粉粒悬浮液；将水稻总淀粉粒悬浮液用移液枪吸出平铺在1.0ml体积分数为75％的细胞分离液(Percoll细胞分离液)表面，在22g的离心力下离心18分钟后，分层，上层为B型淀粉粒悬浮液，下层为A型淀粉粒沉淀。
⑦：a:向A型淀粉粒沉淀中加入去离子水，使A型淀粉粒沉淀悬浮，得A型淀粉粒沉淀悬浮液；将A型淀粉粒沉淀悬浮液用移液枪吸出平铺在1.5ml的体积分数为90％的细胞分离液(Percoll细胞分离液)的表面，再在9g的离心力下离心22分钟，上清液移出倒掉，沉淀即为洗涤后的A型淀粉粒。b：重复a步骤3次，即用体积分数为90％的细胞分离液(Percoll细胞分离液)洗涤A型淀粉粒沉淀3次，得A型淀粉粒粗品。
⑧：将A型淀粉粒粗品先用去离子水离心洗涤2次，离心力为6000g，离心时间为4分钟；再用体积分数为70％的乙醇溶液离心洗涤3次，离心力为4000g，离心时间为22分钟，得A型淀粉粒湿品；风干A型淀粉粒湿品，得A型淀粉粒。
⑨：将B型淀粉粒悬浮液在4000g的离心力下离心22分钟后，得B型淀粉粒沉淀；向B型淀粉粒沉淀中加入1.0ml体积分数为75％的细胞分离液(Percoll细胞分离液)，在18g的离心力下离心22分钟后，分层得上层悬浮液1和下层沉淀1；将上层悬浮液1在6000g的离心力下离心18分钟，分层得下层沉淀2和上层悬浮液2；向下层沉淀2中加入1.0ml体积分数为75％的细胞分离液(Percoll细胞分离液)，在22g的离心力下离心18分钟后，分层得上层悬浮液3和下层沉淀3，下层沉淀3为B型淀粉粒粗品。
⑩将B型淀粉粒粗品先用水离心洗涤2次，离心力为6000g，离心时间为4分钟；再用体积分数为70％的乙醇溶液离心洗涤3次，离心力为4000g，离心时间为22分钟，得B型淀粉粒湿品；风干B型淀粉粒湿品，得B型淀粉粒。
本发明实施例所述的一种水稻A、B型淀粉粒分离纯化方法，用体积分数为75％的Percoll细胞分离液，将水稻A、B型淀粉粒分离开来；然后用体积分数为75％的Percoll细胞分离液多次纯化B型淀粉粒，用体积分数为90％的Percoll细胞分离液多次纯化A型淀粉粒，再用水和酒精洗涤水稻A、B型淀粉粒，可以提高水稻A、B型淀粉粒的纯度。并且用乙醇溶液洗涤水稻淀粉粒和水稻A、B型淀粉粒，可以去除淀粉中的酵母菌等，起到消毒的作用，使淀粉粒长时间保存；并且乙醇溶液与现有技术中常用的丙酮溶液相比，毒性低，安全性高。并且所述分离纯化方法是微量法，与常量法相比，无需使用大型仪器，可以降低能耗，还有所述分离纯化方法操作简便、可行性高。
实施例2.
具体操作步骤如下：
(1)制备水稻总淀粉粒：
①：在5℃的温度下，将6粒成熟水稻籽粒浸泡在2.0ml的质量分数为0.8％的氢氧化钠溶液50小时后，用镊子去除种皮，取出胚乳，用3.0ml去离子水清洗胚乳3次，得水稻籽粒胚乳。
②：将水稻籽粒胚乳放入研钵，加2.0mL去离子水，并研磨12分钟，得研磨液。
③：将研磨液转入2.0mL离心管中，在6000g的离心力下离心4分钟后，研磨液分层，上层为上清液，下层为沉淀物，倒掉上清液(上清液为黄色胶状物)，收集沉淀物，得水稻总淀粉粒沉淀。
④：a：向水稻总淀粉粒沉淀中加入0.5mL去离子水，使水稻总淀粉粒沉淀悬浮后，(加水使水稻总淀粉粒沉淀悬浮是因为：水稻总淀粉粒沉淀中还含有一定量的蛋白等物质，直接加氯化铯溶液，形成的混合液不均一稳定，易影响实验结果；加水使水稻总淀粉粒沉淀悬浮可以提高溶液的均一稳定性，更有利于实验操作及结果)加入1.0mL 12％(w/v)氯化铯溶液，再在6000g的离心力下离心4分钟，倒掉上清液；b:重复a步骤4次，即用1.0mL 12％(w/v)氯化铯溶液洗涤水稻总淀粉粒沉淀4次，确保没有双缩脲反应，得水稻总淀粉粒粗品。上述氯化铯溶液中：氯化铯的质量与氯化铯溶液的体积比为12g：100ml，即氯化铯溶液的质量体积百分比浓度(w/v)为12％。
⑤：将水稻总淀粉粒粗品先用1.0mL wash buffer离心洗涤3次，离心力为4000g，离心时间为6分钟；再用去离子水离心洗涤2次，离心力为6000g，离心时间为4分钟；之后再用体积分数为80％的乙醇溶液离心洗涤2次，离心力为6000g，离心时间为18分钟，得水稻总淀粉粒湿品；风干水稻总淀粉粒湿品，得水稻总淀粉粒。水稻总淀粉粒-20℃贮藏备用。
(2)分离纯化水稻A、B型淀粉粒：
⑥：向0.5g水稻总淀粉粒中加0.5mL去离子水，使水稻总淀粉粒悬浮，得水稻总淀粉粒悬浮液；将水稻总淀粉粒悬浮液用移液枪吸出平铺在1.0ml体积分数为85％的细胞分离液(Percoll细胞分离液)表面，在18g的离心力下离心22分钟后，分层，上层为B型淀粉粒悬浮液，下层为A型淀粉粒沉淀。
⑦：a:向A型淀粉粒沉淀中加入去离子水，使A型淀粉粒沉淀悬浮，得A型淀粉粒沉淀悬浮液；将A型淀粉粒沉淀悬浮液用移液枪吸出平铺在装有1.0ml的体积分数为95％的细胞分离液(Percoll细胞分离液)的2.0ml离心管液面上，再在11g的离心力下离心18分钟，上清液移出倒掉，沉淀即为洗涤后的A型淀粉粒；b：重复a步骤2次，即用体积分数为95％的细胞分离液(Percoll细胞分离液)洗涤A型淀粉粒沉淀2次，得A型淀粉粒粗品。
⑧：将A型淀粉粒粗品先用去离子水离心洗涤3次，离心力为4000g，离心时间为6分钟；再用体积分数为80％的乙醇溶液离心洗涤2次，离心力为6000g，离心时间为18分钟，得A型淀粉粒湿品；风干A型淀粉粒湿品，得A型淀粉粒。
⑨：将B型淀粉粒悬浮液在6000g的离心力下离心18分钟后，得B型淀粉粒沉淀；向B型淀粉粒沉淀中加入1.0ml体积分数为85％的细胞分离液(Percoll细胞分离液)，在22g的离心力下离心18分钟后，分层得上层悬浮液1和下层沉淀1；将上层悬浮液1在4000g的离心力下离心22分钟，分层得下层沉淀2和上层悬浮液2；向下层沉淀2中加入1.0ml体积分数为85％的细胞分离液(Percoll细胞分离液)，在18g的离心力下离心22分钟后，分层得上层悬浮液3和下层沉淀3，下层沉淀3为B型淀粉粒粗品。
⑩将B型淀粉粒粗品先用水离心洗涤3次，离心力为4000g，离心时间为6分钟；再用体积分数为80％的乙醇溶液离心洗涤2次，离心力为6000g，离心时间为18分钟，得B型淀粉粒湿品；风干B型淀粉粒湿品，得B型淀粉粒。
本发明实施例所述的一种水稻A、B型淀粉粒分离纯化方法，用体积分数为85％的Percoll细胞分离液，将水稻A、B型淀粉粒分离开来；然后用体积分数为85％的Percoll细胞分离液多次纯化B型淀粉粒，用体积分数为95％的Percoll细胞分离液多次纯化A型淀粉粒，再用水和酒精洗涤水稻A、B型淀粉粒，可以提高水稻A、B型淀粉粒的纯度。并且用乙醇溶液洗涤水稻淀粉粒和水稻A、B型淀粉粒，可以去除淀粉中的酵母菌等，起到消毒的作用，使淀粉粒长时间保存；并且乙醇溶液与现有技术中常用的丙酮溶液相比，毒性低，安全性高。并且所述分离纯化方法是微量法，与常量法相比，无需使用大型仪器，可以降低能耗，还有所述分离纯化方法操作简便、可行性高。
实施例3.
具体操作步骤如下：
(1)制备水稻总淀粉粒：
①：在4℃的温度下，将5粒成熟水稻籽粒浸泡在1.5ml的质量分数为1.0％的氢氧化钠溶液48小时后，用镊子去除种皮，取出胚乳，用2.0ml去离子水清洗胚乳3次，得水稻籽粒胚乳。
②：将水稻籽粒胚乳放入研钵，加1.5mL去离子水，并研磨11分钟，得研磨液。
③：将研磨液转入2.0mL离心管中，在5000g的离心力下离心5分钟后，研磨液分层，上层为上清液，下层为沉淀物，倒掉上清液(上清液为黄色胶状物)，收集沉淀物，得水稻总淀粉粒沉淀。
④：a：向水稻总淀粉粒沉淀中加入0.5mL去离子水，使水稻总淀粉粒沉淀悬浮后，(加水使水稻总淀粉粒沉淀悬浮是因为：水稻总淀粉粒沉淀中还含有一定量的蛋白等物质，直接加氯化铯溶液，形成的混合液不均一稳定，易影响实验结果；加水使水稻总淀粉粒沉淀悬浮可以提高溶液的均一稳定性，更有利于实验操作及结果)加入1.0mL 10％(w/v)氯化铯溶液，再在5000g的离心力下离心5分钟，倒掉上清液；b:重复a步骤3次，即用1.0mL 10％(w/v)氯化铯溶液洗涤水稻总淀粉粒沉淀3次，确保没有双缩脲反应，得水稻总淀粉粒粗品。上述氯化铯溶液中：氯化铯的质量与氯化铯溶液的体积比为10g：100ml，即氯化铯溶液的质量体积百分比浓度(w/v)为10％。
⑤：将水稻总淀粉粒粗品先用1.0mL wash buffer离心洗涤2次，离心力为5000g，离心时间为5分钟；再用去离子水离心洗涤3次，离心力为5000g，离心时间为5分钟；之后再用体积分数为75％的乙醇溶液离心洗涤2次，离心力为5000g，离心时间为20分钟，得水稻总淀粉粒湿品；风干水稻总淀粉粒湿品，得水稻总淀粉粒。水稻总淀粉粒-20℃贮藏备用。
(2)分离纯化水稻A、B型淀粉粒：
⑥：向0.5g水稻总淀粉粒中加0.5mL去离子水，使水稻总淀粉粒悬浮，得水稻总淀粉粒悬浮液；将水稻总淀粉粒悬浮液用移液枪吸出平铺在1.0ml体积分数为80％的细胞分离液(Percoll细胞分离液)表面，在20g的离心力下离心20分钟后，分层，上层为B型淀粉粒悬浮液，下层为A型淀粉粒沉淀。
⑦：a:向A型淀粉粒沉淀中加入去离子水，使A型淀粉粒沉淀悬浮，得A型淀粉粒沉淀悬浮液；将A型淀粉粒沉淀悬浮液用移液枪吸出平铺在装有1.0ml的体积分数为100％的细胞分离液(Percoll细胞分离液)的2.0ml离心管液面上，再在10g的离心力下离心20分钟，上清液移出倒掉，沉淀即为洗涤后的A型淀粉粒；b：重复a步骤2次，即用体积分数为100％的细胞分离液(Percoll细胞分离液)洗涤A型淀粉粒沉淀2次，得A型淀粉粒粗品。
⑧：将A型淀粉粒粗品先用去离子水离心洗涤2次，离心力为5000g，离心时间为5分钟；再用体积分数为75％的乙醇溶液离心洗涤3次，离心力为5000g，离心时间为20分钟，得A型淀粉粒湿品；风干A型淀粉粒湿品，得A型淀粉粒。
⑨：将B型淀粉粒悬浮液在5000g的离心力下离心20分钟后，得B型淀粉粒沉淀；向B型淀粉粒沉淀中加入1.0ml体积分数为80％的细胞分离液(Percoll细胞分离液)，在20g的离心力下离心20分钟后，分层得上层悬浮液1和下层沉淀1；将上层悬浮液1在5000g的离心力下离心20分钟，分层得下层沉淀2和上层悬浮液2；向下层沉淀2中加入1.0ml体积分数为80％的细胞分离液(Percoll细胞分离液)，在20g的离心力下离心20分钟后，分层得上层悬浮液3和下层沉淀3，下层沉淀3为B型淀粉粒粗品。
⑩将B型淀粉粒粗品先用水离心洗涤3次，离心力为5000g，离心时间为5分钟；再用体积分数为75％的乙醇溶液离心洗涤2次，离心力为5000g，离心时间为20分钟，得B型淀粉粒湿品；风干B型淀粉粒湿品，得B型淀粉粒。
本发明实施例所述的一种水稻A、B型淀粉粒分离纯化方法，用体积分数为80％的Percoll细胞分离液，将水稻A、B型淀粉粒分离开来；然后用体积分数为80％的Percoll细胞分离液多次纯化B型淀粉粒，用体积分数为100％的Percoll细胞分离液多次纯化A型淀粉粒，再用水和酒精洗涤水稻A、B型淀粉粒，可以提高水稻A、B型淀粉粒的纯度。并且用乙醇溶液洗涤水稻淀粉粒和水稻A、B型淀粉粒，可以去除淀粉中的酵母菌等，起到消毒的作用，使淀粉粒长时间保存；并且乙醇溶液与现有技术中常用的丙酮溶液相比，毒性低，安全性高。并且所述分离纯化方法是微量法，与常量法相比，无需使用大型仪器，可以降低能耗，还有所述分离纯化方法操作简便、可行性高。
实施例4.
具体操作步骤如下：
(1)制备水稻总淀粉粒：
①：在5℃的温度下，将4粒成熟水稻籽粒浸泡在1.5ml的质量分数为0.9％的氢氧化钠溶液47小时后，用镊子去除种皮，取出胚乳，用3.0ml去离子水清洗胚乳2次，得水稻籽粒胚乳。
②：将水稻籽粒胚乳放入研钵，加1.0mL去离子水，并研磨12分钟，得研磨液。
③：将研磨液转入2.0mL离心管中，在4500g的离心力下离心5分钟后，研磨液分层，上层为上清液，下层为沉淀物，倒掉上清液(上清液为黄色胶状物)，收集沉淀物，得水稻总淀粉粒沉淀。
④：a：向水稻总淀粉粒沉淀中加入0.5mL去离子水，使水稻总淀粉粒沉淀悬浮后，(加水使水稻总淀粉粒沉淀悬浮是因为：水稻总淀粉粒沉淀中还含有一定量的蛋白等物质，直接加氯化铯溶液，形成的混合液不均一稳定，易影响实验结果；加水使水稻总淀粉粒沉淀悬浮可以提高溶液的均一稳定性，更有利于实验操作及结果)加入1.0mL 9％(w/v)氯化铯溶液，再在4500g的离心力下离心6分钟，倒掉上清液；b:重复a步骤3次，即用1.0mL 9％(w/v)氯化铯溶液洗涤水稻总淀粉粒沉淀3次，确保没有双缩脲反应，得水稻总淀粉粒粗品。上述氯化铯溶液中：氯化铯的质量与氯化铯溶液的体积比为9g：100ml，即氯化铯溶液的质量体积百分比浓度(w/v)为9％。
⑤：将水稻总淀粉粒粗品先用1.0mL wash buffer离心洗涤3次，离心力为4500g，离心时间为6分钟；再用去离子水离心洗涤3次，离心力为4500g，离心时间为6分钟；之后再用体积分数为75％的乙醇溶液离心洗涤2次，离心力为4500g，离心时间为21分钟，得水稻总淀粉粒湿品；风干水稻总淀粉粒湿品，得水稻总淀粉粒。水稻总淀粉粒-20℃贮藏备用。
(2)分离纯化水稻A、B型淀粉粒：
⑥：向0.5g水稻总淀粉粒中加0.5mL去离子水，使水稻总淀粉粒悬浮，得水稻总淀粉粒悬浮液；将水稻总淀粉粒悬浮液用移液枪吸出平铺在1.0ml体积分数为80％的细胞分离液(Percoll细胞分离液)表面，在21g的离心力下离心19分钟后，分层，上层为B型淀粉粒悬浮液，下层为A型淀粉粒沉淀。
⑦：a:向A型淀粉粒沉淀中加入去离子水，使A型淀粉粒沉淀悬浮，得A型淀粉粒沉淀悬浮液；将A型淀粉粒沉淀悬浮液用移液枪吸出平铺在装有1.0ml的体积分数为100％的细胞分离液(Percoll细胞分离液)的2.0ml离心管液面上，再在11g的离心力下离心20分钟，上清液移出倒掉，沉淀即为洗涤后的A型淀粉粒；
b：重复a步骤3次，即用体积分数为100％的细胞分离液(Percoll细胞分离液)洗涤A型淀粉粒沉淀3次，得A型淀粉粒粗品。
⑧：将A型淀粉粒粗品先用去离子水离心洗涤3次，离心力为4500g，离心时间为5分钟；再用体积分数为75％的乙醇溶液离心洗涤3次，离心力为4500g，离心时间为19分钟，得A型淀粉粒湿品；风干A型淀粉粒湿品，得A型淀粉粒。
⑨：将B型淀粉粒悬浮液在4500g的离心力下离心21分钟后，得B型淀粉粒沉淀；向B型淀粉粒沉淀中加入1.0ml体积分数为85％的细胞分离液(Percoll细胞分离液)，在19g的离心力下离心21分钟后，分层得上层悬浮液1和下层沉淀1；将上层悬浮液1在4500g的离心力下离心21分钟，分层得下层沉淀2和上层悬浮液2；向下层沉淀2中加入1.0ml体积分数为85％的细胞分离液(Percoll细胞分离液)，在21g的离心力下离心19分钟后，分层得上层悬浮液3和下层沉淀3，下层沉淀3为B型淀粉粒粗品。
⑩将B型淀粉粒粗品先用水离心洗涤3次，离心力为4500g，离心时间为4分钟；再用体积分数为75％的乙醇溶液离心洗涤2次，离心力为4500g，离心时间为21分钟，得B型淀粉粒湿品；风干B型淀粉粒湿品，得B型淀粉粒。
本发明实施例所述的一种水稻A、B型淀粉粒分离纯化方法，用体积分数为80％的Percoll细胞分离液，将水稻A、B型淀粉粒分离开来；然后用体积分数为85％的Percoll细胞分离液多次纯化B型淀粉粒，用体积分数为100％的Percoll细胞分离液多次纯化A型淀粉粒，再用水和酒精洗涤水稻A、B型淀粉粒，可以提高水稻A、B型淀粉粒的纯度。并且用乙醇溶液洗涤水稻淀粉粒和水稻A、B型淀粉粒，可以去除淀粉中的酵母菌等，起到消毒的作用，使淀粉粒长时间保存；并且乙醇溶液与现有技术中常用的丙酮溶液相比，毒性低，安全性高。并且所述分离纯化方法是微量法，与常量法相比，无需使用大型仪器，可以降低能耗，还有所述分离纯化方法操作简便、可行性高。
实施例5.
具体操作步骤如下：
(1)制备水稻总淀粉粒：
①：在4℃的温度下，将5粒成熟水稻籽粒浸泡在1.6ml的质量分数为1.1％的氢氧化钠溶液49小时后，用镊子去除种皮，取出胚乳，用3.0ml去离子水清洗胚乳3次，得水稻籽粒胚乳。
②：将水稻籽粒胚乳放入研钵，加1.5mL去离子水，并研磨11分钟，得研磨液。
③：将研磨液转入2.0mL离心管中，在5500g的离心力下离心5分钟后，研磨液分层，上层为上清液，下层为沉淀物，倒掉上清液(上清液为黄色胶状物)，收集沉淀物，得水稻总淀粉粒沉淀。
④：a：向水稻总淀粉粒沉淀中加入0.5mL去离子水，使水稻总淀粉粒沉淀悬浮后，(加水使水稻总淀粉粒沉淀悬浮是因为：水稻总淀粉粒沉淀中还含有一定量的蛋白等物质，直接加氯化铯溶液，形成的混合液不均一稳定，易影响实验结果；加水使水稻总淀粉粒沉淀悬浮可以提高溶液的均一稳定性，更有利于实验操作及结果)加入1.0mL 11％(w/v)氯化铯溶液，再在5500g的离心力下离心5分钟，倒掉上清液；b:重复a步骤3次，即用1.0mL 11％(w/v)氯化铯溶液洗涤水稻总淀粉粒沉淀3次，确保没有双缩脲反应，得水稻总淀粉粒粗品。
上述氯化铯溶液中：氯化铯的质量与氯化铯溶液的体积比为11g：100ml，即氯化铯溶液的质量体积百分比浓度(w/v)为11％。
⑤：将水稻总淀粉粒粗品先用1.0mL wash buffer离心洗涤2次，离心力为5500g，离心时间为6分钟；再用去离子水离心洗涤3次，离心力为5500g，离心时间为5分钟；之后再用体积分数为75％的乙醇溶液离心洗涤2次，离心力为5500g，离心时间为20分钟，得水稻总淀粉粒湿品；风干水稻总淀粉粒湿品，得水稻总淀粉粒。水稻总淀粉粒-20℃贮藏备用。
(2)分离纯化水稻A、B型淀粉粒：
⑥：向0.5g水稻总淀粉粒中加0.5mL去离子水，使水稻总淀粉粒悬浮，得水稻总淀粉粒悬浮液；将水稻总淀粉粒悬浮液用移液枪吸出平铺在1.0ml体积分数为80％的细胞分离液(Percoll细胞分离液)表面，在20g的离心力下离心22分钟后，分层，上层为B型淀粉粒悬浮液，下层为A型淀粉粒沉淀。
⑦：a:向A型淀粉粒沉淀中加入去离子水，使A型淀粉粒沉淀悬浮，得A型淀粉粒沉淀悬浮液；将A型淀粉粒沉淀悬浮液用移液枪吸出平铺在装有1.0ml的体积分数为100％的细胞分离液(Percoll细胞分离液)的2.0ml离心管液面上，再在10g的离心力下离心22分钟，上清液移出倒掉，沉淀即为洗涤后的A型淀粉粒；
b：重复a步骤2次，即用体积分数为100％的细胞分离液(Percoll细胞分离液)洗涤A型淀粉粒沉淀2次，得A型淀粉粒粗品。
⑧：将A型淀粉粒粗品先用去离子水离心洗涤3次，离心力为5500g，离心时间为5分钟；再用体积分数为75％的乙醇溶液离心洗涤3次，离心力为5500g，离心时间为20分钟，得A型淀粉粒湿品；风干A型淀粉粒湿品，得A型淀粉粒。
⑨：将B型淀粉粒悬浮液在5500g的离心力下离心20分钟后，得B型淀粉粒沉淀；向B型淀粉粒沉淀中加入1.0ml体积分数为80％的细胞分离液(Percoll细胞分离液)，在20g的离心力下离心22分钟后，分层得上层悬浮液1和下层沉淀1；将上层悬浮液1在5500g的离心力下离心20分钟，分层得下层沉淀2和上层悬浮液2；向下层沉淀2中加入1.0ml体积分数为80％的细胞分离液(Percoll细胞分离液)，在20g的离心力下离心22分钟后，分层得上层悬浮液3和下层沉淀3，下层沉淀3为B型淀粉粒粗品。
⑩将B型淀粉粒粗品先用水离心洗涤3次，离心力为5500g，离心时间为5分钟；再用体积分数为75％的乙醇溶液离心洗涤3次，离心力为5500g，离心时间为20分钟，得B型淀粉粒湿品；风干B型淀粉粒湿品，得B型淀粉粒。
本发明实施例所述的一种水稻A、B型淀粉粒分离纯化方法，用体积分数为80％的Percoll细胞分离液，将水稻A、B型淀粉粒分离开来；然后用体积分数为80％的Percoll细胞分离液多次纯化B型淀粉粒，用体积分数为100％的Percoll细胞分离液多次纯化A型淀粉粒，再用水和酒精洗涤水稻A、B型淀粉粒，可以提高水稻A、B型淀粉粒的纯度。并且用乙醇溶液洗涤水稻淀粉粒和水稻A、B型淀粉粒，可以去除淀粉中的酵母菌等，起到消毒的作用，使淀粉粒长时间保存；并且乙醇溶液与现有技术中常用的丙酮溶液相比，毒性低，安全性高。并且所述分离纯化方法是微量法，与常量法相比，无需使用大型仪器，可以降低能耗，还有所述分离纯化方法操作简便、可行性高。
二实验测试
1、A、B型淀粉粒扫描电镜观察及统计
称取实施例1-5微量法分离得到的水稻A、B型淀粉粒各0.05g，悬浮于1.0mL去离子水中，即A、B型淀粉粒溶液的浓度都为0.05g/mL(w/v)。用枪吸取溶液20μL点在锡箔纸上，等溶液风干后，剪下有淀粉颗粒痕迹的锡箔纸用导电双面胶固定于样品台上，再用离子溅射仪镀金膜，最后在JSM-6490LV扫描电镜下观察与拍照。
利用SAS8.0统计软件对每个样品淀粉粒的大小，A、B型淀粉粒各自的数目，以A型淀粉粒中混入B型淀粉粒的数目和B型淀粉粒中混有A型淀粉粒的数目进行统计分析。
2.微量法A、B型淀粉粒的分离纯化效果
通过扫描电镜拍照、计数和统计。A、B型淀粉粒的纯度如表1所示。
表1 A、B型淀粉粒的纯度
如表1所示，微量法分离的A型淀粉粒纯度在98.7％—99.5％之间，B型淀粉粒纯度在99.5％—99.9％之间；A、B型淀粉粒的纯度较高。
以上所述，仅是本发明实施例的较佳实施例而已，并非对本发明实施例作任何形式上的限制，依据本发明实施例的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明实施例技术方案的范围内。