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1、10申请公布号CN104245931A43申请公布日20141224CN104245931A21申请号201380021290122申请日20130418201210325720120427JP201211958320120525JPC12N9/96200601C12N9/0420060171申请人协和梅迪克斯株式会社地址日本东京都72发明人荒武知子金城健太74专利代理机构中原信达知识产权代理有限责任公司11219代理人于洁王海川54发明名称胆固醇氧化酶的稳定化方法57摘要本发明提供胆固醇氧化酶的稳定化方法、胆固醇氧化酶的保存方法及胆固醇氧化酶的稳定化组合物。一种胆固醇氧化酶的稳定化方法及胆固。
2、醇氧化酶的保存方法，其特征在于，使酮酸在水性介质中与胆固醇氧化酶共存；一种胆固醇氧化酶的稳定化组合物，其特征在于，使酮酸在水性介质中与胆固醇氧化酶共存。本发明的胆固醇氧化酶的稳定化方法、胆固醇氧化酶的保存方法及胆固醇氧化酶的稳定化组合物在代谢综合征等的临床诊断中有用。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014102286PCT国际申请的申请数据PCT/JP2013/0615292013041887PCT国际申请的公布数据WO2013/161676JA2013103151INTCL权利要求书1页说明书7页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页10申请。
3、公布号CN104245931ACN104245931A1/1页21一种胆固醇氧化酶的稳定化方法，其特征在于，使酮酸或其盐在水性介质中与胆固醇氧化酶共存。2如权利要求1所述的稳定化方法，其中，酮酸为选自由丙酮酸、酮戊二酸和草酰乙酸组成的组中的酮酸。3一种胆固醇氧化酶的保存方法，其特征在于，使酮酸或其盐在水性介质中与胆固醇氧化酶共存。4如权利要求3所述的保存方法，其中，酮酸为选自由丙酮酸、酮戊二酸和草酰乙酸组成的组中的酮酸。5一种胆固醇氧化酶的稳定化组合物，其特征在于，使酮酸或其盐在水性介质中与胆固醇氧化酶共存。6如权利要求5所述的稳定化组合物，其中，酮酸为选自由丙酮酸、酮戊二酸和草酰乙酸组成的组。
4、中的酮酸。权利要求书CN104245931A1/7页3胆固醇氧化酶的稳定化方法技术领域0001本发明涉及胆固醇氧化酶的稳定化方法、胆固醇氧化酶的保存方法及胆固醇氧化酶的稳定化组合物。背景技术0002胆固醇氧化酶是以胆固醇和氧分子作为底物的氧化还原酶。临床检查中，经常进行使用胆固醇氧化酶的胆固醇的测定。临床检查中使用通过比色法来测定样本中的胆固醇的方法等，该比色法中，使胆固醇氧化酶作用于样本中的胆固醇而生成过氧化氢，使生成的过氧化氢在过氧化物酶存在下与氧化显色型色原体反应而生成色素，并测定生成的色素的吸光度。0003胆固醇的测定中使用的胆固醇氧化酶是不稳定的，在含有胆固醇氧化酶的测定试剂的保存中。
5、失活，存在测定试剂的性能变差的问题。0004针对该问题，已知如下方法向含有胆固醇氧化酶的溶液中添加碱金属的氯化物和/或碱土金属的氯化物的胆固醇氧化酶的稳定化方法参考专利文献1、通过与选自牛血清白蛋白、葡聚糖、聚乙二醇中的水溶性载体发生化学键合而使溶液状态下的胆固醇氧化酶稳定化的方法参考专利文献2、通过向含有胆固醇氧化酶的溶液中添加牛血清白蛋白和赖氨酸而使胆固醇氧化酶稳定化的方法参考专利文献3、通过与蛋白质分解物共存而使干燥状态的胆固醇氧化酶稳定化的方法参考专利文献4等。0005现有技术文献0006专利文献0007专利文献1日本特开昭52143285号公报0008专利文献2日本特开平606284。
6、6号公报0009专利文献3日本特开平8187095号公报0010专利文献4日本特开2005114368号公报发明内容0011发明所要解决的问题0012本发明的目的在于提供适于长期保存的胆固醇氧化酶的稳定化方法、胆固醇氧化酶的保存方法及胆固醇氧化酶的稳定化组合物。0013用于解决问题的手段0014本发明人为了解决该问题而反复进行了深入研究，结果发现了通过使酮酸或其盐在水性介质中与胆固醇氧化酶共存而使胆固醇氧化酶保持稳定的见解，从而完成了本发明。即，本发明涉及下述16项。00151一种胆固醇氧化酶的稳定化方法，其特征在于，使酮酸或其盐在水性介质中与胆固醇氧化酶共存。00162如1所述的稳定化方法，。
7、其中，酮酸为选自由丙酮酸、酮戊二酸和草说明书CN104245931A2/7页4酰乙酸组成的组中的酮酸。00173一种胆固醇氧化酶的保存方法，其特征在于，使酮酸或其盐在水性介质中与胆固醇氧化酶共存。00184如3所述的保存方法，其中，酮酸为选自由丙酮酸、酮戊二酸和草酰乙酸组成的组中的酮酸。00195一种胆固醇氧化酶的稳定化组合物，其特征在于，使酮酸或其盐在水性介质中与胆固醇氧化酶共存。00206如5所述的稳定化组合物，其中，酮酸为选自由丙酮酸、酮戊二酸和草酰乙酸组成的组中的酮酸。0021发明效果0022根据本发明，提供适于长期保存的胆固醇氧化酶的稳定化方法、胆固醇氧化酶的保存方法及胆固醇氧化酶的。
8、稳定化组合物。具体实施方式0023本发明的胆固醇氧化酶的稳定化方法是特征在于使酮酸或其盐在水性介质中与胆固醇氧化酶共存的方法。0024本发明的胆固醇氧化酶的保存方法是特征在于使酮酸或其盐在水性介质中与胆固醇氧化酶共存的方法。0025本发明的胆固醇氧化酶的稳定化组合物是特征在于使酮酸或其盐在水性介质中与胆固醇氧化酶共存的组合物。0026在本发明中，“稳定”是指即使将胆固醇氧化酶长期保存也可维持胆固醇氧化酶的酶活性，具体而言是指，将胆固醇氧化酶的水溶液在5下保存2周，在5下保存2周后的胆固醇氧化酶活性为胆固醇氧化酶水溶液刚制备后的胆固醇氧化酶活性的75以上。胆固醇氧化酶活性例如可以通过以下的方法来。
9、测定。0027制备含有胆固醇和检测用试剂的胆固醇氧化酶活性评价用试剂。作为检测用试剂，可以使用例如含有过氧化物酶和后述的氧化显色型色原体的试剂。向样本AXL中添加胆固醇氧化酶活性评价用试剂YL，在37下进行5分钟反应，测定反应5分钟后的反应液的吸光度E1A。进一步在37下进行5分钟反应，测定反应10分钟后的反应液的吸光度E2A，算出从E2A中减去E1A而得到的吸光度差EA。除了使用蒸馏水代替样本A作为样本以外，通过同样的方法测定在37下反应5分钟后的反应液的吸光度E1O，进一步在37下进行5分钟反应，测定反应10分钟后的反应液的吸光度E2O，算出从E2O中减去E1O而得到的吸光度差EO。从EA。
10、中减去EO，得到关于样本A的吸光度差EA。由该吸光度差EA算出胆固醇氧化酶的活性。在使用4氨基安替比林4AA与N乙基N3甲基苯基N琥珀酰乙二胺EMSE的组合作为氧化显色型色原体的情况下，通过以下的式I算出胆固醇氧化酶的活性。0028胆固醇氧化酶活性U/MLEA/169XY/XI0029由上述式I可知，胆固醇氧化酶活性与EA成比例，因此，可以使用EA作为胆固醇氧化酶活性的指标。0030胆固醇氧化酶的稳定化可以通过例如以下的方法来评价。作为含有胆固醇氧化酶说明书CN104245931A3/7页5的样本，对于向缓冲液中添加胆固醇氧化酶和酮酸而制备的样本A而言，制备刚制备后的样本A刚制备后和将样本A刚。
11、制备后在5下保存2周后的样本A保存后。另外，对于向缓冲液中仅添加胆固醇氧化酶而制备的、不含酮酸的样本A而言，制备刚制备后的样本A刚制备后和将样本A刚制备后在5下保存2周后的样本A保存后。使用样本A刚制备后作为样本，在37下进行5分钟的样本A刚制备后与胆固醇氧化酶活性评价用试剂的反应，测定反应液的吸光度E1A刚制备后，进一步在37下进行5分钟反应，测定反应10分钟后的反应液的吸光度E2A刚制备后，算出从E2A刚制备后中减去E1A刚制备后而得到的吸光度差EA刚制备后。除了使用蒸馏水代替样本A刚制备后作为样本以外，通过同样的方法测定在37下反应5分钟后的反应液的吸光度E10，进一步在37下进行5分钟。
12、反应，测定反应10分钟后的反应液的吸光度E2O，算出从E2O中减去E1O而得到的吸光度差EO。从EA刚制备后中减去EO，得到关于样本A刚制备后的吸光度差EA刚制备后。0031除了使用样本A保存后代替样本A刚制备后作为样本以外，通过与上述同样的方法算出关于样本A保存后的吸光度差EA保存后。同样地，使用样本A刚制备后代替样本A刚制备后作为样本，算出关于样本A刚制备后的吸光度差EA刚制备后，使用样本A保存后代替样本A刚制备后作为样本，算出关于样本A保存后的吸光度差EA保存后。样本A中的胆固醇氧化酶的残留率通过以下的式II算出。0032残留率EA保存后/EA刚制备后100II0033同样地，样本A中的。
13、胆固醇氧化酶的残留率通过以下的式III算出。0034残留率EA保存后/EA刚制备后100III0035在通过上述式II算出的样本A中的胆固醇氧化酶的残留率为75以上且高于通过上述式III算出的样本A中的胆固醇氧化酶的残留率的情况下，可以评价为胆固醇氧化酶利用酮酸得到了稳定化。0036本发明中的胆固醇氧化酶是分类为EC1136的酶，为催化以下的反应的酶。0037胆固醇O2胆甾4烯酮H2O20038作为催化上述反应的胆固醇氧化酶，可以列举例如来源于动物、植物或微生物的胆固醇氧化酶、以及通过基因工程方法制造的胆固醇氧化酶等，也可以使用胆固醇氧化酶CHODI，龟甲万公司制造、胆固醇氧化酶CHOPEWL。
14、，龟甲万公司制造、胆固醇氧化酶CHOCE，龟甲万公司制造、胆固醇氧化酶COO321，东洋纺织公司制造等市售品。0039本发明中，作为水性介质，只要是能够稳定保持胆固醇氧化酶的水性介质则没有特别限制，可以列举例如去离子水、蒸馏水、缓冲液等，优选缓冲液。本发明中的胆固醇氧化酶在水性介质中的浓度通常为001300U/ML。作为缓冲液，优选在能够稳定保持胆固醇氧化酶的PH范围内具有缓冲能力的缓冲剂，可以列举例如磷酸缓冲液、硼酸缓冲液、GOODS缓冲液等。作为GOODS缓冲液中使用的GOODS缓冲剂，可以列举例如2吗啉代乙烷磺酸MES、三羟甲基氨基甲烷TRIS、双2羟乙基亚氨基三羟甲基甲烷BISTRIS。
15、、N2乙酰胺亚氨基二乙酸ADA、哌嗪N,N双2乙烷磺酸PIPES、N2乙酰胺2氨基乙烷磺酸ACES、N,N双2羟乙基2氨基乙烷磺酸BES、3吗啉代丙烷磺酸MOPS、N三羟甲基甲基2氨基乙烷磺酸TES、242羟乙基1哌嗪基乙烷磺酸HEPES、哌嗪N,N双2羟基丙烷磺酸POPSO、N三羟甲基甲基甘氨酸TRICINE、N,N双2羟乙基甘氨酸BICINE、N三羟甲说明书CN104245931A4/7页6基甲基3氨基丙烷磺酸TAPS、N环己基2氨基乙烷磺酸CHES、N环己基3氨基2羟基丙烷磺酸CAPSO、N环己基3氨基丙烷磺酸CAPS等。0040本发明中，胆固醇氧化酶通常在PH为59的水性介质中保存，优。
16、选在PH为68的水性介质中保存。0041本发明中的酮酸只要是使胆固醇氧化酶稳定化的酮酸则没有特别限制，可以列举例如丙酮酸、酮戊二酸、草酰乙酸等。本发明中，酮酸可以为盐，作为盐，可以列举例如锂盐、钠盐、钾盐、铵盐、钙盐、镁盐等。0042本发明中的酮酸在水性介质中的浓度只要是使胆固醇氧化酶稳定化的浓度则没有特别限制，通常为00540MMOL/L。0043本发明的胆固醇氧化酶的保存方法是使酮酸或其盐在水性介质中与胆固醇氧化酶共存来保存的方法。本发明的胆固醇氧化酶的保存方法中使用的胆固醇氧化酶及其浓度以及酮酸及其浓度可以列举与上述胆固醇氧化酶稳定化方法同样的物质及其浓度。本发明的胆固醇氧化酶的保存方法。
17、中的保存期间只要是胆固醇氧化酶得到稳定保存的期间则没有特别限制，通常为12年。另外，本发明的胆固醇氧化酶的保存方法中的保存温度只要是胆固醇氧化酶得到稳定保存的温度则没有特别限制，通常为545，优选030，特别优选210。0044本发明的胆固醇氧化酶的保存方法中，除了酮酸或其盐以外，还可以使表面活性剂、防腐剂、蛋白质等与胆固醇氧化酶共存。作为表面活性剂，可以列举例如非离子性表面活性剂、阳离子性表面活性剂、阴离子性表面活性剂、两性表面活性剂等。作为防腐剂，可以列举例如叠氮化物、螯合剂等。作为叠氮化物，可以列举例如叠氮化钠等。作为螯合剂，可以列举例如乙二胺四乙酸EDTA或其盐等。作为盐，可以列举例如。
18、钠盐、钾盐等。作为蛋白质，可以列举例如白蛋白等，作为白蛋白，可以列举例如牛血清白蛋白BSA等。0045本发明的胆固醇氧化酶的稳定化组合物中，除了含有胆固醇氧化酶和酮酸或其盐以外，还可以含有基于过氧化氢测定体系的测定对象成分的测定方法中使用的试剂和试剂盒中通常含有的构成要素。作为测定对象成分，可以列举总胆固醇TC、高密度脂蛋白中的胆固醇HDLC、中间密度脂蛋白中的胆固醇IDLC、低密度脂蛋白中的胆固醇LDLC、超低密度脂蛋白中的胆固醇VLDLC、残粒样脂蛋白中的胆固醇RLPC、小而密低密度脂蛋白中的胆固醇SDLDLC、HDL亚级分中的胆固醇HDL2C、HDL3C、游离型胆固醇FC等。0046例如。
19、，在胆固醇TC、HDLC、LDLC、IDLC、VLDLC、RLPC、SDLDLC、HDL2C、HDL3C、FC的测定方法中使用的试剂和试剂盒中，除了含有胆固醇氧化酶以外，还含有胆固醇酯酶、过氧化物酶、氧化显色型色原体等。0047作为氧化显色型色原体，可以列举无色型色原体、氧化耦合型色原体等。0048无色型色原体具有在过氧化物酶的存在下与过氧化氢反应而单独生成色素的功能。作为无色型色原体，可以列举例如四甲基联苯胺、邻苯二胺、10N羧甲基氨甲酰基3,7双二甲氨基10H吩噻嗪CCAP、10N甲基氨甲酰基3,7双二甲氨基10H吩噻嗪MCDP、N羧甲基氨基羰基4,4双二甲氨基二苯胺钠盐DA64、10N羧。
20、甲基氨基羰基3,7双二甲氨基10H吩噻嗪钠盐DA67、4,4双二甲氨基二苯胺、双3双4氯苯基甲基4二甲氨基苯基胺BCMA说明书CN104245931A5/7页7等。0049氧化耦合显色型色原体具有在过氧化物酶的存在下与过氧化氢反应而生成色素的功能。在该生成色素的反应中，使用一对氧化耦合显色型色原体的组合。作为一对氧化耦合显色型色原体的组合，可以列举耦合剂与苯胺类的组合、耦合剂与酚类的组合。0050作为耦合剂，可以列举例如4氨基安替比林4AA、3甲基2苯并噻唑啉酮肼32等。0051作为苯胺类，可以列举N3磺丙基苯胺、N乙基N2羟基3磺丙基3甲基苯胺TOOS、N乙基N2羟基3磺丙基3,5二甲基苯胺。
21、MAOS、N乙基N2羟基3磺丙基3,5二甲氧基苯胺DAOS、N乙基N3磺丙基3甲基苯胺TOPS、N2羟基3磺丙基3,5二甲氧基苯胺HDAOS、N,N二甲基3甲基苯胺、N,N二3磺丙基3,5二甲氧基苯胺、N乙基N3磺丙基3甲氧基苯胺、N乙基N3磺丙基苯胺、N乙基N3磺丙基3,5二甲氧基苯胺、N3磺丙基3,5二甲氧基苯胺、N乙基N3磺丙基3,5二甲基苯胺、N乙基N2羟基3磺丙基3甲氧基苯胺、N乙基N2羟基3磺丙基苯胺、N乙基N3甲基苯基N琥珀酰乙二胺EMSE、N乙基N3甲基苯基N乙酰基乙二胺、N乙基N2羟基3磺丙基4氟3,5二甲氧基苯胺FDAOS等。0052作为酚类，可以列举苯酚、4氯苯酚、3甲基。
22、苯酚、3羟基2,4,6三碘苯甲酸HTIB等。0053本发明的胆固醇氧化酶的稳定化组合物中，可以含有上述的表面活性剂、防腐剂、蛋白质等。0054以下，通过实施例更详细地对本发明进行说明，但本发明的范围不受这些实施例的任何限定。另外，在本实施例、比较例和试验例中，使用下述制造商的试剂和酶。0055MOPS同仁化学研究所公司制造、EMSE公司制造、4AA公司制造、KI化成公司制造、PGM50聚氧化乙烯辛基苯基醚，和光纯药工业公司制造、胆酸钠公司制造、胆固醇纯正化学公司制造、2丙醇和光纯药工业公司制造、X100西格玛公司制造、丙酮酸钠关东化学公司制造、酮戊二酸二钠MP公司制造、草酰乙酸关东化学公司制造。
23、、过氧化物酶东洋纺织公司制造、CHOCE胆固醇氧化酶，龟甲万公司制造。0056实施例10057通过以下的方法，对由酮酸带来的胆固醇氧化酶的稳定化效果进行研究。00581样本0059制备包含下述组成的样本A样本A0A3和样本B样本B0B3。0060样本A样本A0A30061MOPSPH7020MMOL/L0062CHOCE2KU/L0063酮酸参考表1，样本A0为未添加0064样本B样本B0B30065MOPSPH7020MMOL/L说明书CN104245931A6/7页80066X10010067CHOCE2KU/L0068酮酸参考表1，样本B0为未添加00692胆固醇氧化酶活性测定用试剂00。
24、70制备包含下述组成的试剂A和试剂B。0071试剂A00720073试剂B0074胆固醇的2丙醇溶液5MG/ML0075向试剂A50ML中添加试剂B2ML，充分搅拌，制成胆固醇氧化酶活性测定用试剂。00763关于刚制备后的样本的吸光度差0077向反应皿中添加刚制备后的样本A124L和上述2的胆固醇氧化酶活性测定用试剂225L，在主波长546NM、副波长800NM下测定在37下加热5分钟后的反应液的吸光度E1A1刚制备后，进一步在37下加热5分钟，在主波长546NM、副波长800NM下测定反应10分钟后的反应液的吸光度E2A1刚制备后，从E2A1刚制备后中减去E1A1刚制备后，得到EA1刚制备后。
25、。0078使用蒸馏水作为样本，进行同样的反应，从反应10分钟后的反应液的吸光度E2O中减去反应5分钟后的反应液的吸光度E1O，得到EO。从EA1刚制备后中减去EO，得到关于刚制备后的样本A1的吸光度差EA1刚制备后。00794关于在5下保存2周后的样本的吸光度差0080除了使用在5下保存2周后的样本A1代替刚制备后的样本A1以外，通过与上述3同样的方法，确定关于在5下保存2周后的样本A1的吸光度差EA1保存后。00815在5下保存2周后的样本中的胆固醇氧化酶的残留率0082由上述3中确定的EA1刚制备后和4中确定的EA1保存后，通过上述式II确定在5下保存2周后的样本中的胆固醇氧化酶相对于刚制。
26、备后的样本中的胆固醇氧化酶的残留率。将结果示于表1中。0083除了使用样本A2、样本A3和样本B1B3各样本代替样本A1作为样本以外，通过与上述15同样的方法确定在5下保存2周后的各样本中的胆固醇氧化酶相对于刚制备后的各样本中的胆固醇氧化酶的残留率。将结果示于表1中。说明书CN104245931A7/7页90084此外，使用样本A0和样本B0代替样本A1，并使用上述式III代替上述式II，除此以外，通过与上述15同样的方法确定在5下保存2周后的各样本中的胆固醇氧化酶相对于刚制备后的各样本中的胆固醇氧化酶的残留率。将结果示于表1中。0085表10086样本酮酸浓度残留率A061A1丙酮酸钠05G。
27、/L88A2酮戊二酸二钠05G/L91A3草酰乙酸05G/L80B071B1丙酮酸钠05G/L95B2酮戊二酸二钠05G/L85B3草酰乙酸05G/L790087由表1可知，无论是在使用不含表面活性剂的样本A0A3的情况下还是在使用含有表面活性剂的样本B0B3的情况下，与未共存酮酸时相比，胆固醇氧化酶的残留率在共存有酮酸时均更高，为75以上。与此相对，在未共存酮酸或其盐时，残留率低，低于75。因此可知，通过使酮酸或其盐在水性介质中与胆固醇氧化酶共存，可使胆固醇氧化酶稳定化。0088产业上的可利用性0089根据本发明，提供胆固醇氧化酶的稳定化方法、胆固醇氧化酶的保存方法及胆固醇氧化酶的稳定化组合物。本发明的胆固醇氧化酶的稳定化方法、胆固醇氧化酶的保存方法及胆固醇氧化酶的稳定化组合物在代谢综合征等的临床诊断中有用。说明书CN104245931A。