技术领域
本发明涉及精子的分离技术领域，具体而言，涉及将四溴化 1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯应用于精子分离。
背景技术
流式细胞仪分离动物X精子和Y精子,是动物性别控制的一条 新途径，其工作原理是：利用动物含有X染色体和含有Y染色体的 精液中DNA含量存在差异，借助荧光染料染色，然后根据发出的 荧光强度，通过计算机判别精子类别，再通过给精液液滴附加电荷， 根据静电原理，将含有X染色体的精液和Y染色体的精液分离。
在相关技术中，上述方法常用的荧光染料易发生聚集荧光猝灭 现象：当染料的浓度较高时，染料分子会聚集进而导致发射的荧光 强度骤降。当待分离的精液密度较高时，此时需要较高浓度的荧光 染料进行标记，但是高浓度的染料分子会发生聚集，进而发生聚集 荧光猝灭，导致精子的分离效果不理想。
发明内容
本发明的目的在于提供将四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基 胺基)]苯乙烯应用于精子分离，以解决上述的问题。
在本发明的实施例中提供了将四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙 氧基胺基)]苯乙烯应用于精子分离，包括下列步骤：
向待分离的精液中加入荧光染料和染色用工作液，再孵育，得 到混合液；其中，所述荧光染料为四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙 氧基胺基)]苯乙烯，并且所述待分离的精液中每含4亿个精子时， 至少加入7μg所述荧光染料；
采用流式细胞仪对所述混合液进行分离，得到分离的X精子和 Y精子。
本发明上述实施例的将四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺 基)]苯乙烯应用于精子分离，所用的荧光染料—四溴化1,1,2,2-四 -[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯(即TTAPE)是一种具有聚集诱 导发光现象的分子，即当荧光染料浓度较大或者聚集时，荧光染料 分子内旋转被冻结或者形成聚集体使其荧光发射显著增大，其灵敏 度高、背景噪音低。因而当待分离的精液密度较高需采用高浓度的 荧光染料时，也不会发生荧光猝灭的现象，从而避免了对分离效果 的不利影响。其中，TTAPE在本发明的应用中发射荧光的原理是： TTAPE与DNA的静电相互作用而结合，由于与DNA的结合，限 制了分子间转动，致使其发荧光。
具体实施方式
下面通过具体的实施例子对本发明做进一步的详细描述。
实施例一
该实施例提供了将四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)] 苯乙烯应用于精子分离，包括下列步骤：
第一步：向待分离的精液中加入荧光染料和染色用工作液 (staining talp)，再孵育，得到混合液。
第二步：采用流式细胞仪对混合液进行分离，得到分离的X精 子和Y精子。
其中，荧光染料为四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)] 苯乙烯，并且待分离的精液中每含4亿个精子时，至少加入7μg荧 光染料。
以上应用所用的荧光染料为四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧 基胺基)]苯乙烯(即TTAPE)，其是一种具有聚集诱导发光现象的分 子，即当荧光染料浓度较大或者聚集时，荧光染料分子内旋转被冻 结或者形成聚集体使其荧光发射显著增大，其灵敏度高、背景噪音 低。因而当待分离的精液密度较高需采用高浓度的荧光染料时，也 不会发生荧光猝灭的现象，从而避免了对分离效果的不利影响。由 此可见，TTAPE可替代现有技术中用于分离精子的其它染色体，采 用一种新型的发光原理—聚集诱导发光进行检测。
另外，上述应用还具有另外的一个优点：由于TTAPE在光源 的照射下不会发生猝灭现象，因此上述应用中的所有步骤不需要在 避光条件下操作。由此可见，本发明的应用降低了对操作条件的要 求，更易推广。
其中，TTAPE在本发明的应用中发射荧光的原理是：TTAPE 与DNA的静电相互作用而结合，由于与DNA的结合，限制了分子 间转动，致使其发荧光。
上述应用中所用的荧光染料TTAPE通常采用如下的制备方法：
第一步：DHBP(4，4’二羟基二苯酮)3克和碳酸钾5克，50mL 丙酮加入到4mL 1，2-二溴乙烷中，将混合物以回流方式搅拌、加 热24小时，过滤，蒸干溶剂。粗产物用硅胶柱(氯仿)得到4，4’- 二羟基苯丙酮(BBEBP)白色粉末。产物经过红外和核磁测试的验 证。
第二步：1克BBEBP在50mL四氢呋喃(THF)悬浮液中，加 入四氯化钛0.26mL和锌粉0.31克，沸腾20小时，反应混合物冷却 到室温，过滤。真空干燥，溶剂挥发，粗产物过硅胶柱(氯仿/环己 烷1：4)。产物经过红外和核磁共振光谱测试。
第三步：在250mL烧瓶中，磁力搅拌，溶解100mg1,1,2,2-四- (溴乙氧基)四苯乙烯(TBEPE)在100mLTHF中，然后加入过量 的三乙基胺(5mL)，保持回流3天。在此过程中，间断加入10mL 水，减压蒸馏，水溶液用氯仿洗三次，溶剂挥发之后真空50℃干燥 得到TTAPE。
上述制备方法的化学反应式如下，“reflux”是指回流，“Et3N”是 指三乙胺：
另外，上述应用中所用的工作液(染色用工作液、蛋黄工作液) 均可采用现有技术中的配制方法，例如：
染色用工作液(staining talp)的配制
配方如表1所示，该表中的配方是指每配制1L染色用工作液 所需的试剂量。
表1 染色用工作液的配方
试剂 所需的质量(g) 羟乙基哌嗪乙磺酸(40.00mM) 9.50
六水氯化镁(0.40mM) 0.08 氯化钠(95.00mM) 5.50 氯化钾(3.00mM) 0.22 碳酸钠(0.30mM) 0.04 碳酸氢钠(10.00mM) 0.84 丙酮酸(2.00mM) 0.23 葡萄糖(5.00mM) 0.90 乳酸溶液 3.65 牛血清蛋白 3.00
具体的配制方法：按表1数据称量所需试剂依次放入盛有该配 液总量3/4的超纯水烧杯中充分溶解。溶解后用NaOH溶液将pH 值调为7.40，将溶液完全移入体积相对应的容量瓶内，用超纯水反 复冲洗烧杯内壁移入容量瓶填充至刻度后充分混匀；配置完毕后用 板式过滤器进行过滤灭菌。滤后得到滤液每1000毫升液添加庆大霉 素针剂2.5mL。清晰标明溶液名称、配置日期。5℃下贮存，有效期 7-10天。
另外，经过试验证明：采用本发明的上述应用方法分离精子的 分选速度为25000个/s，收集速度为3000～5000个/s，X精子分选 准确率为80％以上。精子自采集后到完成性别分离约需5～6h。分 选后冻前精子活力达到0.5～0.7，分选后解冻精子活力0.3～0.4。
此外，实施例一的应用还可以进一步改进，以达到更多的技术 效果。例如：
针对第一步
优选地，孵育的时间为：40-50min。这个孵育时间可以保证荧 光染料能够和DNA有效的完全结合，若时间太短可能导致部分染 料还没有和DNA结合，时间太长可能会导致活精比例下降。
优选地，待分离的精液为：活力≥0.6，密度≥10亿/mL的精液。 这个指标的精液的分离效果较好，并且冷冻之后活精的比例也高。
优选地，向待分离的精液中加入荧光染料和染色用工作液的步 骤之前还包括：用孔径为45-55μm的过滤器过滤待分离的精液。采 用该工序可以过滤掉精子粘结而成的精子团，避免这些精子团影响 分离效果。
优选地，向待分离的精液中加入荧光染料和染色用工作液的步 骤之前还包括：在30-35℃下将荧光染料和染色用工作液预热。在 该温度下预热可以使荧光染料和DNA结合得更充分。
优选地，向待分离的精液中加入荧光染料和染色用工作液的步 骤之前还包括：向将待分离的精液中加入抗生素。加入抗生素防止： 精液中滋生细菌降低精子活性的问题。此外，为了增强效果，还可 以同时加入多种抗生素。
针对第二步
优选地，在进行第二步之前，孵育的步骤之后和分离的步骤之 前还包括：向混合液中加入蛋黄工作液(egg yolk talp)。蛋黄工作 液可以为精子提供营养，避免精子在分离过程中死亡。此外，为了 给精子提供一个良好的生长环境，还可以在加入蛋黄工作液的步骤 之前将蛋黄工作液预热，预热的温度为30-35℃。
优选地，向待分离的精液中加入荧光染料和染色用工作液的步 骤之前还包括：向将待分离的精液中加入抗生素。抗生素可以抑制 精液中细菌的生长，从而避免细菌滋生降低精子的活性。
优选地，向混合液中加入蛋黄工作液的步骤之后和分离的步骤 之前还包括：用孔径为45-55μm的过滤器过滤混合液。在分离之前 进一步过滤，除去精子团和其它杂质，以改善分离效果。
上文中提及的蛋黄工作液可采用现有技术中的配制方法，例如：
以配制1L蛋黄工作液为例，将957.5mL的staining talp液移入 容量瓶内，然后用移液管将2.6mL食品红溶液(FD)加入容量瓶； 用staining talp液填充至容量瓶的刻度后充分混匀；将用酒精消毒的 新鲜鸡蛋弃除蛋清后用无菌过滤纸去除剩余的蛋清，挤破膜将蛋黄 挤入量筒至所需体积的刻度处；用封口膜封好的量筒口后充分混匀。 再将溶液倒入烧杯用磁力搅拌器搅拌30分钟。5℃静置过夜(12小 时)；静置后的溶液吸去量筒上层5-10毫升液废弃，然后慢慢倾斜 量筒把上清液倒入烧杯(防止将沉淀物倒入)；用HCL溶液将pH 调至5.50，静置30分钟后吸去烧杯上层油状物。将剩余上清液分装 入离心管，两两平衡。放入离心机内离心(5℃、15557xg、30分钟)， 离心结束后吸去各个离心管上层油状物，将离心后溶液收集到试剂 瓶内用板式过滤器(上层1.2um的过滤膜，下层0.22um的过滤 膜)过滤除菌。滤后液每1000毫升添加庆大霉素针剂2.6mL。清晰 标明溶液名称、配置日期。5℃下贮存，有效期14天。
其中，FD的配制方法为：以配制100mL为例，准确称取5g 食品红，完全溶解于盛有100mL的超纯水的试剂瓶中；扎紧瓶口进 行高压灭菌(121℃，30分钟)；灭菌后分装，标明名称。5℃冷藏备 用。
实施例二
TTAPE在精子分离中的应用，包括下列步骤：
首先，循环水浴锅设定温度34℃，提前30分钟预热；4％egg yolk talp液在使用前放置水浴锅内预热15分钟；用移液枪准确吸取联合 抗生素(css)加入装有新鲜精液的离心管中(比例是1mL新鲜原 精对应20微升css)轻轻摇匀；准确计算精子密度、精液一次使用 量，staining talp液使用量；梯度染色以≥34微升梯度进行染色。
其次，每样品管精子总数为4亿、体积为4mL；用微量加样器 吸取荧光染料加入样样管内，标明序号、批次；然后将一定量的预 热后的staining talp液加入上样管内混匀；将摇匀精液用移液枪准确 吸取一定量的新鲜精液加入到上样管内。摇匀后放入水浴锅内暗室 孵育45分钟；向已孵育好的样品中加入2mL 4％egg yolk talp液， 摇匀后再用50微米过滤器过滤到另一洁净上样管内，标明序号、批 次，送到流式细胞仪分离室，进行分离。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在 本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。