相关申请的交叉引用
本申请要求2013年9月6日提交的美国临时申请S.N.61/874,659的权益。
关于联邦资助的研究或开发的声明
本发明是在由美国国家科学基金会(NSF)授予的批准号为1057331的政 府支持下进行的。政府对本发明具有一定的权利。
背景技术
光学器件、生物分析测定和生物成像探针经常利用表现出光学性质的成分， 诸如有机荧光团和半导体纳米颗粒。某些所需的光学性质包括：长的发光寿命、 激发带和发射带之间大的有效能量差，以及在整个可见光和近红外(NIR)光 谱范围内尖锐的发射带。镧系离子(Ln3+)含有独特的4f轨道，并表现出独特 的发光特性，包括在整个可见光和近红外(NIR)光谱范围内尖锐的发射带。 然而，Ln3+的f-f跃迁是拉波特(Laporte)禁阻，具有低吸收系数，导致直接激 发效率低并且需要合适的天线(antenna)进行敏化。
附图说明
参照下面详细的描述和附图，本发明实施例的特征和优点变得显而易见， 在附图中，类似的附图标记对应于相似(尽管可能不同)的组件。为了简便起 见，具有先前描述过的功能的附图标记或特征可以或可以不在它们出现的其它 附图中进行描述。
图1A和图1B分别是Dy3+[12-MC-4]2[24-MC-8]沿着a轴和c轴的X射线晶体结 构的黑白视图；
图2是Ln(III)MC配合物(2.04·10-5M、Ln(III)＝Gd、Nd、Yb、Er)和喹哪 啶异羟肟酸(quinaldichydroxamicacid)(quinHA)(2.42·10-4M)在298K下在 甲醇中的吸收光谱图，其中，quinHA的吸收光谱是放大16倍的；
图3是quinHA(10mg/mL)在77K下在甲醇中用290激发和Gd(III)MC(10 mg/mL)在298K和77K下在甲醇中用290nm或340nm激发的经校准并归一化的 发射光谱图；
图4是在使用喹哪啶异羟肟酸形成金属冠醚时Ln(III)[12-MC-4]2[24-MC-8] 金属冠醚配合物中能量迁移过程的简化图(CT＝基于配体的电荷转移态)；
图5示出了Yb(III)金属冠醚配合物的光谱，其中，左边的光谱是经校准并归 一化的激发(λem＝980nm)光谱，而右边的光谱是经校准并归一化的发射(在 420nm或370nm处的配体激发下)光谱，并且，其中上边的光谱是固态的配合 物，而下边的光谱是甲醇溶液中的配合物；
图6示出了Nd(III)金属冠醚配合物的光谱，其中，左边的光谱是激发(λem＝ 1064nm)光谱，而右边的光谱是发射(在420nm或370nm处的配体激发下)光 谱，并且，其中上边的光谱是固态的配合物，而下边的光谱是甲醇溶液中的配 合物；以及
图7示出了Er(III)金属冠醚配合物的光谱，其中，左边的光谱是激发(λem＝ 1525nm)光谱，而右边的光谱是发射(在370nm处的配体激发下)光谱，并且， 其中上边的光谱是固态的配合物，而下边的光谱是甲醇溶液中的配合物；
图8A和图8B是使用近红外(NIR)落射荧光显微镜获得的在用1μM的Yb(III) 金属冠醚配合物孵育24小时后的人类卵巢上皮癌(HeLa)细胞的图像的黑白视 图，其中，图8A是明场图像，而图8B是暴露于激发(λex＝377nm，使用50nm 带通滤光片)500ms后获得的在NIR范围(长通805nm滤光片)内的发射信号 图像；
图8C是图8A和图8B的合并图像；
图8D和图8E是使用NIR落射荧光显微镜获得的未经处理的HeLa细胞的图 像的黑白视图，其中，图8D是明场图像，而图8E是暴露于激发(λex＝377nm， 使用50nm带通滤光片)500ms后获得的在NIR范围(长通805nm滤光片)内的 自发荧光信号图像；
图8F是图8D和图8E的合并图像；
图9A和图9B是使用NIR落射荧光显微镜获得的在用5μM的Yb(III)金属冠 醚配合物孵育12小时后的HeLa细胞的图像的黑白视图，其中，图9A是明场图像， 而图9B是在暴露于激发(λex＝377nm，使用50nm带通滤光片)800ms后获得 的在NIR范围(长通805nm滤光片)内的发射信号图像；
图9C是图9A和图9B的合并图像；
图10A和图10B是使用NIR落射荧光显微镜获得的在用含有Yb(III)金属冠醚 配合物的珠粒(bead)孵育11小时后的HeLa细胞的图像的黑白视图，其中，图 10A是明场图像，而图10B是在暴露于激发(λex＝377nm，使用50nm带通滤光 片)13s后获得的在NIR范围(长通805nm滤光片)内的发射信号图像；
图10C是图10A和图10B的合并图像；
图11A和图11B是使用NIR落射荧光显微镜获得的在用含有Yb(III)金属冠醚 配合物的珠粒孵育11小时后的HeLa细胞的图像的黑白视图，其中，图11A是明 场图像，而图11B是在暴露于激发(λex＝377nm，使用50nm带通滤光片)13s 后获得的在NIR范围(长通805nm滤光片)内的发射信号图像；并且
图11C是图11A和图11B的合并图像。
具体实施方式
金属冠醚是由环化形成重复[MNO]x亚单元的四齿配体制成的金属配合物， 其中，M是过渡金属离子。与冠醚相似，能够合成一系列尺寸的金属冠醚，并 且向内的氧原子能够结合到中心金属离子(即，配位中心金属)。本文公开的示 例性金属冠醚配合物是具有过渡金属(M2+)、四齿异羟肟酸配体(L2-)，和镧 系离子(Ln3+)或其它稀土金属离子的三组分超分子组装，其中，该四齿异羟 肟酸配体(L2-)在并入到金属冠醚配合物中后能够向中心离子转移能量和/或产 生基于配体的电荷转移态。
特别是，本文公开的实例利用四齿配体喹哪啶异羟肟酸或其衍生物：
合适的喹哪啶异羟肟酸衍生物的实例可以包括结合到上面结构1所示的3位至8位上的R基团的任意组合。在一个实例中，R基团独立地选自-H、-D(氘)、-OH、-SH、-NH2、-NO2、-F、-Cl、-Br、-I、-CF3、-OCH3、-SO3H、-CH3和-CN。在另一个实例中，在结构1的3位至8位中任一位置上的R基团也可以是稠合芳环。稠合芳环的实例包括苯、萘、菲、或芘。应理解的是，稠合芳环上的各个位置也可以具有结合到其上的R基团(例如，-H、-D(氘)、-OH等)。在再进一步的实例中，在结构1的3位至8位中任一位置上的R基团也可以是稠合杂环。稠合杂环的实例包括呋喃、噻吩、吡咯、吡啶、咪唑、噻唑、嘧啶、吲哚、异吲哚、吲嗪、嘌呤、咔唑、二苯并呋喃、噁唑或异噁唑。应理解的是，稠合杂环上的各个位置也可以具有结合到其上的R基团(例如，-H、-D(氘)、-OH等)。在另外一个实例中，结构1的R基团可以是酰胺、发色团区或识别区，诸如生物素、糖、寡核苷酸、肽(例如，RGD)、抗体等等。在另外其它的实例中，R基团可以是＝O、＝N、-N3、-NR’H、-NR’2、-NR’3+、-COOH、-COOR’、-CH2-R’、-CHR2、-CHR’R”、-CR’R”R”’、-OR’等等，其中，R’、R”和R”’可以独立地选自上述R基团中的任何一种。
其它衍生物的实例包括在3位至8位处的具有氮、氧或硫(代替碳)的由喹 哪啶异羟肟酸衍生的杂环。应理解的是，这些衍生物能够在3位至8位处单独或 组合地含有氮原子、氧原子或硫原子。
这种配体或其衍生物提供了具有独特的分子结构的配合物。此外，这种配 体或其衍生物有效地吸收激发光，并将所得能量转移到Ln3+离子。已意外地发 现，由喹哪啶异羟肟酸配体或其衍生物形成的金属冠醚配合物提供了近可见光 基于配体的电荷转移吸收、显著高的量子产率(表现出强的近红外发光)和长 发光寿命的组合。具有这些性能的配合物可以用于多种应用，诸如生物分析测 定、生物成像、生物医学分析、电信(例如，掺铒光纤放大器)、能量转换、光 伏、显示技术(例如，作为有机发光二极管OLED中的电致发光材料)、安全印 刷(例如，作为在安全油墨、防伪标签、条形码或其它识别码中的成分)和光 学材料。对于OLED，配合物可以并入到聚合物基质中，例如，以确保电子传 导。对于任何应用，可以对R基团进行选择以改变使用金属冠醚配合物的制剂 中的金属冠醚配合物的溶解度或两亲性。
本文公开的金属冠醚配合物具有通式Ln(III)[12-MC-4]2[24-MC-8]。通常， MC是具有由二价过渡金属离子(M(II)或M2+)和上述异羟肟酸配体(HA)(本 文提及的异羟肟酸配体包括喹哪啶异羟肟酸或其衍生物)组成的重复亚单元的 金属冠醚大环。
Ln(III)是键合(例如，经由配位键合)到封端冠(cappingcrown)[12-MC-4] 的中心离子。应理解的是，Ln3+可以包括任何镧系离子，诸如，镝(Dy3+)、镱 (Yb3+)、钕(Nd3+)、钆(Gd3+)、铽(Tb3+)、铕(Eu3+)、铒(Er3+)、镧(La3+)、 铈(Ce3+)、镨(Pr3+)、钷(Pm3+)、钐(Sm3+)、钬(Ho3+)、铥(Tm3+)或镥 (Lu3+)。在整个申请中，“Ln3+”、“Ln(III)”或“镧系元素”可以被其它稀土金 属离子(诸如钇(Y3+)和钪(Sc3+))代替。
所述金属冠醚配合物包括两个封端冠，每个封端冠被称为[12-MC-4]。 [12-MC-4]封端冠的示例性结构如下所示，其中具有50％热位移参数和部分编号 方案：
结构2和结构3示出了与各个封端冠的四个向内的异羟肟酸盐氧原子键合的 Ln(III)离子(在这些实例中为Dy)。在结构2中，这些向内的异羟肟酸盐氧原子 被标记为O6、O6A、O6B和O6C；而在结构3中，这些向内的异羟肟酸盐氧原子 被标记为O4、O4A、O4B和O4C。在制备金属冠醚配合物的方法(将在下面讨 论)中，HA配体环化形成在[12-MC-4]中重复四次的重复亚单元[M(II)HA]。其 结果是，各个[12-MC-4]封端冠在其大环中总共具有12个原子(即，4个Zn、4 个O和4个N)。
上述金属冠醚配合物还包括包封冠(encapsulatingcrown)[24-MC-8]。 [24-MC-8]包封冠的示例性结构如下所示，具有50％热位移参数和部分编号方 案：
在此实例中，HA配体环化形成在[24-MC-8]中重复八次的重复亚单元 [M(II)HA]。其结果是，各个[24-MC-8]包封冠在其大环中总共具有24个原子(即， 8个Zn、8个O和8个N)。
结构4还示出了未键合的中心Ln(III))离子(例如，Dy1)。虚线表示中心冠 如何桥接到较小且凹的封端冠(结构2和结构3)。
如下面将要讨论的，形成金属冠醚配合物所使用的方法可以利用吡啶或一 些其它溶剂(例如，二甲基甲酰胺或甲醇)，因此包封冠(结构4)也可以具有 连接到其上的八个吡啶环或者一些其它配位溶剂分子。
二价过渡金属可以是任何过渡金属(II)离子。在本文公开的实例中，所 用的过渡金属离子是Zn2+。[24-MC-8](A)和[12-MC-4](B)中Zn2+的配位几 何如下所示：
Zn2+的配位几何示出不同的金属冠醚环通过桥氧原子连接，桥氧原子即 [12-MC-4]羧酸盐氧原子(用实线箭头标识)和[24-MC-8]异羟肟酸盐氧原子(用 虚线箭头标识)。换句话说，[24-MC-8]单元在其中心处具有空腔，而Ln3+离子 和两个[12-MC-4]单位之间形成的夹层式配合物通过桥氧原子结合在空腔内。如 上面在(B)中示出的，Ln3+离子结合到[12-MC-4]异羟肟酸盐氧原子(用点线 箭头标识)。
图1A和图1B示出了金属冠醚配合物10(即，Dy3+[12-MC-4]2[24-MC-8])的一个实例沿着a轴(图1A)和c轴(图1B)观察的X射线晶体结构的黑白视图；Dy3+离子被示为具有连接到其上的非阴影键的在配合物10中心处的大非阴影球体，氧原子被示为具有连接到其上的左倾斜交叉阴影键(例如，)的较小非阴影球体或者由短虚线键(例如，)的相交点表示，氮原子被示出为具有连接到其上的右倾斜交叉阴影键和/或粗实线键(例如，)的较小非阴影球体或者由粗实线键(例如，)的交叉点表示，Zn2+离子被示为具有连接到其上的斑点键和/或实线键(例如，)的斑点球体，并且HA配体和吡啶配体的环被示为虚线(例如，)。应理解的是，HA配体根据所选择的HA配体可以具有稍微不同的结构。
在制备金属冠醚配合物的方法的实例中，将在并入到金属冠醚配合物后能 够产生基于配体的电荷转移态的HA配体的实例、过渡金属盐和稀土金属盐溶解 在溶剂中以形成溶液。示例性溶剂包括二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、水和它 们的组合。
HA配体(即，喹哪啶异羟肟酸或其衍生物)可以在单个步骤中制备。在一 个实例中，首先，通过在约0℃下将盐酸羟胺和氢氧化钾混合在甲醇中，制备新 鲜的羟胺。可以搅拌(例如，约20分钟或更长)并过滤该溶液以除去氯化钾。 在搅拌下将喹哪啶酸和N-甲基吗啉混合在二氯甲烷中。将该溶液冷却至约0℃， 此时可添加氯甲酸乙酯。搅拌该反应约20分钟至1小时，然后过滤。在约0℃下 将羟胺溶液添加到滤液中。使该反应混合物升温至室温，并搅拌约1.5小时。然 后，可以在真空下使体积减少到约200mL，并添加水以诱导沉淀白色固体。通 过过滤收集固体，并且可以用热(约40℃)二氯甲烷使成为粉末，以得到白色 粉末状态的喹哪啶异羟肟酸。
可以使用任何过渡金属盐。在一个实例中，过渡金属盐是Co2+、Ni2+、Cu2+、 Zn2+、Rh2+、Pd2+、Ag2+、Cd2+、Ir2+、Pt2+、Au2+或Hg2+中任一种的三氟甲磺酸 盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、右旋樟脑磺酸盐、乙二磺酸盐、依托酸盐(estolate)、 乙磺酸盐(esylate)、萘磺酸盐、甲苯磺酸盐、氟化物、氯化物、溴化物、碘化 物、硝酸盐、硫酸盐、碳酸盐、乙酸盐、磺酸盐或磷酸盐。
稀土金属盐可以是Y3+、Sc3+、La3+、Ce3+、Pr3+、Nd3+、Pm3+、Sm3+、Eu3+、 Gd3+、Tb3+、Dy3+、Ho3+、Er3+、Tm3+、Yb3+或Lu3+中任一种的三氟甲磺酸盐、 甲磺酸盐、苯磺酸盐、右旋樟脑磺酸盐、乙二磺酸盐、依托酸盐、乙磺酸盐、 萘磺酸盐、甲苯磺酸盐、氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸盐、 碳酸盐、乙酸盐、磺酸盐或磷酸盐。
如上述提到的，将HA配体、过渡金属盐和稀土金属盐溶解在溶剂中以形成 溶液。然后，将碱添加到该溶液中。合适的碱的实例包括三乙胺(TEA)、三甲 胺或其它布朗斯特碱。在一个实例中，在将碱添加到该溶液中时，所得反应混 合物变成黄色。
然后，在预定温度下将反应混合物(即，溶液和碱)搅拌预定的一段时间。 在一个实例中，温度为室温(例如，约18℃～约22℃)，并且时间为约12小时～ 约24小时。
然后，用纯化方法对反应混合物进行纯化以产生高纯度的金属冠醚配合物。 合适的纯化方法的实例包括通过缓慢蒸发溶剂的重结晶、通过汽相扩散的重结 晶、通过溶剂分层的重结晶、高效液相色谱法(HPLC)或快速色谱法。在一个 实例中，在纯化过程中使用吡啶，这使得将吡啶配体引入到金属冠醚配合物10 中。
应理解的是，所得的金属冠醚配合物的性质(例如，激发波长)可以通过 选择配体进行调整。例如，不同的喹哪啶异羟肟酸衍生物可被并入到金属冠醚 配合物中以改变所得的金属冠醚配合物的激发波长。据信，改变金属冠醚配合 物的取代基将引起其电子结构以及相应的激发波长的变化。
在带负电荷的物质的存在下可以获得所形成的金属冠醚配合物10的电荷平 衡，带负电荷的物质为诸如未结合的抗衡离子(例如，三氟甲磺酸根、甲磺酸 根、苯磺酸根、右旋樟脑磺酸根、乙二磺酸根、依托酸根、乙磺酸根、萘磺酸 根、甲苯磺酸根、氟离子、氯离子、溴离子、碘离子、硝酸根、硫酸根、碳酸 根、乙酸根、磺酸根或磷酸根)。
本文公开的Ln(III)[12-MC-4]2[24-MC-8]金属冠醚配合物表现出所需的吸收 (ε[380nm]≈5.5·104M-1cm-1)。据信，这是由于结合的HA配体的基于配体的电 荷转移态。据信，通过该基于配体的电荷转移态的激发产生非常高的发光量子 产率，这是由多个参数导致的，包括高效地向镧系元素转移能量的敏化剂和保 护Ln3+离子不受溶剂环境影响。据信，本文在以下实例中报道的发光量子产率 对具有含C-H键的有机配体的Nd3+和Er3+配合物来说是无与伦比的。
因为Ln(III)[12-MC-4]2[24-MC-8]金属冠醚配合物表现出所需的吸收， Ln(III)[12-MC-4]2[24-MC-8]金属冠醚配合物在生物实验条件或其它实验条件下 可用作光学成像剂。在这些情况下，Ln(III)[12-MC-4]2[24-MC-8]金属冠醚配合 物可被并入到液体载体或固体载体中。例如，Ln(III)[12-MC-4]2[24-MC-8]金属 冠醚配合物可被并入到溶液(例如，DMF、二甲基亚砜(DMSO)、甲醇、乙醇、 水，以及它们的组合物)中或另一成分(例如，胶乳、二氧化硅、聚苯乙烯等) 的珠粒中，然后添加到含细胞的培养基中。然后，可以使用任何合适的光学成 像技术(诸如落射荧光显微镜或共焦荧光显微镜)分析孵育的细胞。
珠粒用于保护金属冠醚配合物不受外部环境影响，并且用于使金属冠醚配 合物向量化。并入Ln(III)[12-MC-4]2[24-MC-8]金属冠醚配合物的珠粒可以是聚 合物珠粒或二氧化硅珠粒。聚合物珠粒的实例包括由含丙烯醛基的单体和/或含 乙烯基的单体(例如，甲基丙烯酸酯、苯乙烯等)形成的聚合物珠粒。聚合物 珠粒的其它实例包括聚(乳酸)珠粒。珠粒的任何实例可以用适于与特定的靶向 部分结合的不同基团进行官能化。同样地，在一些实例中，将 Ln(III)[12-MC-4]2[24-MC-8]金属冠醚配合物并入到珠粒中能够控制靶向部分的 选择性检测。珠粒可以在其表面上被-NH2基团或-COOH基团涂覆，这使能够容 易地与靶向部分诸如，肽、蛋白质、抗体、寡核苷酸、糖共轭连接。在一个实 例中，通过以适当的浓度将金属冠醚配合物溶解在合适的溶剂中，然后用珠粒 孵育该溶液，来将金属冠醚配合物并入到珠粒中。在合适的孵育时间后，可以 通过任何合适的技术(诸如离心和倾析)，从该溶液中收集负载有金属冠醚配合 物的珠粒。
为了进一步说明本发明，在本文中给出了以下实施例。应理解的是，这些 实施例是为了说明性的目的提供的，并且应理解为非限制性的。
实施例
喹哪啶异羟肟酸的制备
通过首先制备新鲜的羟胺来制备喹哪啶异羟肟酸。通过在0℃下将盐酸羟胺 (12.0g,173mmol)和氢氧化钾(11.4g,173mmol)混合在甲醇(200mL)中 来制备新鲜的羟胺。搅拌该溶液20分钟，过滤以除去氯化钾，并置于一边。同 时，在搅拌下将喹哪啶酸(20.0g,116mmol)和N-甲基吗啉(14.0mL,127mmol) 混合在二氯甲烷(300mL)中。将该溶液冷却至0℃，此时添加氯甲酸乙酯(12.1 mL,127mmol)。搅拌该反应物20分钟，然后过滤。在0℃下将羟胺溶液添加到 滤液中。使该反应混合物升温至室温，并搅拌1.5小时。然后，在真空下使体积 减少到约200mL，并添加水(1L)以诱导沉淀白色固体。通过过滤收集固体， 并且用热二氯甲烷(800mL)使成为粉末，以得到白色粉末状态的喹哪啶异羟 肟酸(12.7g,58.2％)。熔点：146～148℃。电喷雾电离质谱(ESI-MS)：[M+H+]， C10H9N2O2，计算值为189.1，实测值为189.1；[M+Na+]，C10H8N2NaO2，计算 值为211.0，实测值为211.1。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.51(s,1H),9.18(s, 1H),8.53(d,J＝8.5Hz,1H),8.09–8.04(m,3H),7.84(m,1H),7.69(m,1H)。13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ161.7,150.3,146.0,137.6,130.4,129.2,128.6,128.0, 127.9,118.7。对于(C10H8N2O2)(H2O)，元素分析计算结果(实测结果)为，C:58.25 (58.25),H:4.89(4.94),N:13.59(13.65)。UV-vis(MeOH)，λmax,nm(logε)207(4.4), 238(4.5),300(br)(3.5)。
Ln3+[12-MC-4]2[24-MC-8]的制备
根据本文公开的方法制备几种金属冠醚配合物。
通过将喹哪啶异羟肟酸(200mg,1.06mmol)、三氟甲磺酸锌(385mg,1.06 mmol)和三氟甲磺酸镝(81mg,0.13mmol)溶解在15mL二甲基甲酰胺中，来 制备DyZn16(quinHA)16(OTf)3(即，具有(OTf)3、5个水分子和3个DMF分子的 Dy3+[12-MC-4]2[24-MC-8])。添加三乙胺(296μL,2.12mmol)。该溶液立即变 为黄色，并在室温下搅拌过夜。然后，将该溶液置于一边以缓慢蒸发，这在两 周内产生黄色板状晶体。通过过滤来收集晶体，并将该晶体空气干燥，以得到 DyZn16(quinHA)16(OTf)3(29mg,8.4％)。ESI-MS：[M]3+，C160H96DyN32O32Zn16， 计算值为1395.8；实测值为1395.7。对于 (C163H96DyF9N32O41S3Zn16)(H2O)5(C3H7NO)3，元素分析计算结果(实测结果)为， C:41.79(41.81),H:2.59(2.81),N:9.92(10.23)。
使用相似的过程来形成YZn16(quinHA)16(OTf)3(即，具有(OTf)3、5个水分 子和3个DMF分子的Y3+[12-MC-4]2[24-MC-8])(96mg,28％)，不同之处在于： 使用三氟甲磺酸钇(70mg,0.13mmol)。ESI-MS：[M]3+，C160H96N32O32YZn16， 计算值为1371.1；实测值为1371.2。1HNMR(400MHz,CD3OD)δ8.36(d,J＝4.7 Hz,8H),8.34(d,J＝4.7Hz,8H),8.22(d,J＝8.5Hz,8H),8.09(d,J＝8.5Hz,8 H),7.73(d,J＝7.6Hz,8H),7.52(d,J＝8.5Hz,8H),7.49(d,J＝8.0Hz,8H),7.25 (m,16H),7.19(d,J＝8.5Hz,8H),7.09(m,8H),6.95(m,8H)。对于 (C163H96F9N32O41S3YZn16)(H2O)5(C3H7NO)3，元素分析计算结果(实测结果)为， C:42.42(42.48),H:2.63(2.90),N:10.07(10.40)。
也使用相似的过程来形成YbZn16(quinHA)16(OTf)3(即，具有(OTf)3、5个水 分子和3个DMF分子的Yb3+[12-MC-4]2[24-MC-8])(96mg,28％)，不同之处在于： 使用三氟甲磺酸镱(81mg,0.13mmol)。ESI-MS：[M]3+，C160H96N32O32YbZn16， 计算值为1399.3；实测值为1399.4。对于 (C163H96F9N32O41S3YbZn16)(H2O)5(C3H7NO)3，元素分析计算结果(实测结果)为， C:41.70(41.73),H:2.58(2.74),N:9.89(9.98)。
也使用相似的过程来形成NdZn16(quinHA)16(OTf)3(即，具有(OTf)3、5个水 分子和3个DMF分子的Nd3+[12-MC-4]2[24-MC-8])(58mg,34％)，不同之处在于： 使用三氟甲磺酸钕(77mg,0.13mmol)。ESI-MS：[M]3+，C160H96N32NdO32Zn16， 计算值为1389.7；实测值为1389.2。对于 (C163H96F9N32NdO41S3Zn16)(H2O)5(C3H7NO)3，元素分析计算结果(实测结果)为， C:41.94(41.76),H:2.60(2.76),N:9.95(10.08)。
也使用相似的过程来形成GdZn16(quinHA)16(OTf)3(即，具有(OTf)3、4个水 分子和4个DMF分子的Gd4+[12-MC-4]2[24-MC-8])(67mg,39％)，不同之处在于： 使用三氟甲磺酸钆(79mg,0.13mmol)。ESI-MS：[M]3+，C160H96GdN32O32Zn16， 计算值为1394.0；实测值为1393.2。对于 (C163H96F9GdN32O41S3Zn16)(H2O)4(C3H7NO)4，元素分析计算结果(实测结果)为， C:42.09(41.84),H:2.66(3.03),N:10.10(10.26)。
也使用相似的过程来形成TbZn16(quinHA)16(OTf)3(即，具有(OTf)3、5个水 分子和3个DMF分子的Tb3+[12-MC-4]2[24-MC-8])(39mg,23％)，不同之处在于： 使用三氟甲磺酸铽(79mg,0.13mmol)。ESI-MS：[M]3+，C160H96N32O32TbZn16， 计算值为1394.5；实测值为1394.1。对于 (C163H96F9N32O41S3TbZn16)(H2O)5(C3H7NO)3，元素分析计算结果(实测结果)为， C:41.82(41.50),H:2.59(2.71),N:9.92(9.90)。
也使用相似的过程来形成EuZn16(quinHA)16(OTf)3(即，具有(OTf)3、7个水 分子和1个DMF分子的Eu3+[12-MC-4]2[24-MC-8])(69mg,40％)，不同之处在于： 使用三氟甲磺酸铕(78mg,0.13mmol)。ESI-MS：[M]3+，C160H96EuN32O32Zn16， 计算值为1392.2；实测值为1391.8。对于 (C163H96EuF9N32O41S3Zn16)(H2O)7(C3H7NO)，元素分析计算结果(实测结果)为， C:41.34(41.00),H:2.45(2.90),N:9.58(9.80)。
也使用相似的过程来形成ErZn16(quinHA)16(OTf)3(即，具有(OTf)3、5个水 分子和3个DMF分子的Er3+[12-MC-4]2[24-MC-8])(35mg,20％)，不同之处在于： 使用三氟甲磺酸铒(80mg,0.13mmol)。ESI-MS：[M]3+，C160H96ErN32O32Zn16， 计算值为1397.3；实测值为1397.1。对于 (C163H96ErF9N32O41S3Zn16)(H2O)5(C3H7NO)3，元素分析计算结果(实测结果)为， C:41.15(41.49),H:2.71(2.86),N:9.76(10.16)。
光物理测量
对置于2.4mm内径的石英毛细管或透明石英池(quartzSuprasilcell)中的 样品收集发光数据。用配备有可见光光电倍增管(PMT)(220-800nm,R928P；滨 松公司)、冷却至77K的NIR固态InGaAs探测器(800-1600nm,DSS-IGA020L； Jobin-Yvon)或NIRPMT(950-1450nm,H10330-45；950-1650nm,H10330-75； 滨松公司)的Horiba-Jobin-YvonFluorolog3荧光分光光度计测量发射光谱和激 发光谱。全部光谱均就仪器功能进行校准。
由Nd:YAG激光器(YG980；Quantel)提供的355nm激发下测定发光寿命，同时通过上述PMT(H10330-75)在NIR内检测信号。然后将检测器的输出信号馈送到500MHz带通数字示波器(TDS754C；Tektronix)，并然后输送到PC，用Origin进行处理。发光寿命是至少三次独立测量的平均值。
根据使用积分球(GMPSA)的绝对方法，用Fluorolog3荧光分光光度计测 定在NIR内的量子产率。每个样品在略微不同的实验条件下测量数次。量子产 率测定的估算实验误差为10％。
光物理性质
配体quinHA由于喹啉部分内的π*←π跃迁在UV区表现出多个吸收带。如图 2所示，长波长吸收的临界点位于340nm。在脱质子并形成金属冠醚骨架 Ln(III)[12-MC-4]2[24-MC-8]时，在近可见光区出现宽吸收，并且表观最大值位 于380nm(ε≈5.5·104M-1cm-1)，截止点位于470nm。在图2中，示出了Gd(III)、 Nd(III)、Yb(III)和Er(III)的结果。这些结果表明，考虑到Zn(II)既不参与金属到 配体的电荷转移(MLCT)也不参与配体到金属的电荷转移(LMCT)，并且吸 收光谱与镧系元素(III)离子的选择没有关系，那么认为该谱带是由quinHA配 体的基于配体的电荷转移产生的。
如图3所示，当在室温下用290nmUV激发时，quinHA没有显示任何可检测 的发射。在77K下，强绿色的发光以510nm为中心，具有在325～460nm范围内 的弱谱带。在延迟100μs后，在325～460nm范围内的弱谱带消失，所以它能被 归属为短寿命的荧光，而绿色发光是磷光。由0-0跃迁确定的quinHA的三重态的 能量因此能够被推定为21000cm-1(476nm)。
Gd(III)的基态和激发态之间的能隙非常高，因此，相应金属冠醚配合物中 的Gd(III)离子不可能用300～400nm激发进行敏化。据信，在不存在向Ln(III)离 子转移能量的情况下该特征可用于确定金属冠醚配合物的能级。在室温下用340 nm使Gd(III)金属冠醚配合物UV激发至基于配体的电荷转移带，从而产生最大 位于580～590nm的弱宽带发射(图3)。将温度降低至77K使谱带轻微锐化和最 大值移位到545～555nm(图3)。如图3所示，在应用100μs的时间延迟后，观察 到进一步蓝移至510nm。在实验误差范围内，由Gd(III)金属冠醚配合物的光谱 确定的三重态的位置与quinHA的位置一样，20920cm-1(478nm)。分别由quinHA 和Gd3+[12-MC-4]2[24-MC-8]的吸收和发射(荧光)光谱的交叉部分来确定最低 激发单重态的位置和基于配体的电荷转移(CT)态的位置，并且发现位于29850 cm-1(335nm)和21560cm-1(565nm)。quinHA配体的能级(单重态、三重态 和CT)相对于Yb(III)、Nd(III)和Er(III)镧系离子的能级的提议示意图和可能的 能量迁移路径示于图4中。
记录了在420nm或370nm下激发的处于固态和溶液(CH3OH/CD3OD)状 态的Ln(III)金属冠醚配合物(Ln(III)＝Yb,Nd,Er)的发光光谱。所有研究的金 属冠醚配合物均表现出由Yb3+化合物、Nd3+化合物和Er3+化合物各自的 2F5/2→2F7/2跃迁(图5)、4F3/2→4IJ(J＝9/2,11/2,13/2)跃迁(图6)和4I13/2→4I15/2跃迁(图7)所产生的在NIR范围内的特征发射。稀释的甲醇溶液(0.1mg/mL) 的激发光谱与相应的吸收光谱匹配得很好(参见图2)，同时随着浓度增加(1 mg/mL)和对于固态样品，观察到谱带向较长波长扩张。定量的光物理参数总 结在表1中。
表1
a在298K下测量的数据，用370nm激发测量量子产率，用355nm激发测量寿命。括号内的数字表示标准偏差(2σ)；估计的相对误差；τobs,±2％；±10％。b根据下列公式计算内球水合数：qYb＝2×(kCH3OH-kCD3OD-0.1)(以μs计)以及qNd＝290×(kCH3OH-kCD3OD)-0.4(以ns计).
固态和氘代甲醇(即，CD3OD，甲醇-d4)中的Nd(III)和Er(III)金属冠醚配 合物的量子产率被认为是在具有含C-H的有机配体的镧系元素化合物中目前所 报道的最高的。Yb(III)金属冠醚配合物的量子产率接近于最大的公开数值。
使用Yb(III)金属冠醚的NIR落射荧光显微镜
为了证明镧系元素(III)金属冠醚配合物在生物条件下作为光学成像剂保持 并操作的能力，对HeLa(人类卵巢上皮癌)细胞进行两个落射荧光显微镜实验， 并在下面进行描述。Yb(III)金属冠醚的制备和NIR落射荧光显微镜的描述对于 两个实验均适用。
Yb(III)金属冠醚溶液或珠粒的制备
如上所述制备Yb3+[12-MC-4]2[24-MC-8]，并将其以适当的浓度溶解在 DMSO中，直接使用或者用珠粒进行孵育以并入到其中。
NIR落射荧光显微镜观察
用配备有EMCCD演变512(EMCCDEvolve512)光度照相机(Roper Scientific)的Axio观察仪Z1(AxioObserverZ1)荧光倒置显微镜(蔡司，勒佩 克，法国)进行NIR落射荧光显微镜观察。EMCCDEvolve512光度照相机连接 到驱动采集软件Axiovision(蔡司)的计算机。倒置显微镜配备有蔡司物镜(浸 没平场复消色差透镜63×(数值孔径(NA)＝1.4)、平场荧石物镜40×(NA＝ 0.75)、平场复消色差透镜20×(NA＝0.8))。蔡司HXP-120光源(金属卤化物) 用作激发系统，并与如下的UV立方滤光片元件组合：带通50nm滤光片的377nm 用于激发，和长通805nm滤光片用于在NIR范围内的Yb(III)发射。
NIR落射荧光显微镜-实验1
HeLa细胞获得自ATCC(莫尔塞姆，法国)，并在37℃下在5％CO2的湿润气 氛中生长。每3～4天，将5×105个细胞接种到25cm2的塑料瓶中。细胞在补充有 10％牛胎儿血清(FBS)、1％青霉素/链霉素和1％L-谷氨酰胺以及1％的100x非必 需氨基酸溶液的最低必需培养基(MEM)中进行培养。在实验前一天，将7×103个细胞接种到8孔LabTek腔室盖玻片(Nunc,DutsherS.A.,布吕马特，法国)。
然后，一些细胞用在补充有2％FBS和1％的二甲基亚砜(DMSO)的培养基(Invitrogen公司)中稀释的1μM的Yb3+[12-MC-4]2[24-MC-8]中进行孵育。在37℃下24小时后，用冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)将细胞冲洗两次，并且用不含酚红的培养基改变并替换细胞培养基。作为对照，以相同方式处理其它HeLa细胞，但不加入Yb3+[12-MC-4]2[24-MC-8]。这些细胞在本文中被称为未经处理的细胞。
用NIR落射荧光显微镜观察用Yb3+[12-MC-4]2[24-MC-8]孵育24小时之后的 经处理的细胞和未经处理的细胞。通过暴露于明场以及暴露于激发(λex＝377 nm，使用50nm带通滤光片)，来获得经处理的和未经处理的细胞的图像。图8A 是明场图像，而图8B是在暴露于激发500ms后所获得的在NIR范围(长通805nm 滤光片)内的经处理的细胞的发射信号图像。图8C是图8A和图8B合并在一起的 图像。激发用Yb3+[12-MC-4]2[24-MC-8]孵育的HeLa细胞时，明确地检测到在NIR 范围内的发射。这与未经处理的细胞截然不同。图8D是明场图像，而图8E是在 暴露于激发500ms后所获得的在NIR范围(长通805nm滤光片)内的未经处理 的细胞的发射信号图像。图8F是图8D和图8E合并在一起的图像。如图8E和图8F 所示，对于未经处理的HeLa细胞未检测到在NIR范围内的发射。
NIR落射荧光显微镜-实验2
获得自ATCC(莫尔塞姆，法国)的HeLa细胞系在补充有10％热灭活的胎牛血清(FBS)、1％的100x非必需氨基酸溶液、1％的L-谷氨酰胺(GlutaMAX)和1％的链霉素/青霉素抗生素的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)中进行培养。将细胞以3×104个细胞/孔的密度接种在8孔LabTek腔室盖玻片(Nunc,DutsherS.A.,布吕马特，法国)中，并且在5％湿润的CO2气氛中在37℃下培养。24小时后，除去细胞培养基，并用冰冷的将细胞洗涤两次。一些细胞用Yb3+[12-MC-4]2[24-MC-8]在补充有2％的FBS的培养基中的5μM的溶液在5％CO2气氛中在37℃下孵育11小时或12小时。其它细胞用在补充有2％的FBS的OPTIMEM培养基中的并入有Yb3+[12-MC-4]2[24-MC-8]的珠粒在5％CO2气氛中在37℃下孵育11小时或12小时。在落射荧光成像之前，用冰冷的PBS或/和冰冷的具有1％吐温20的PBS洗涤细胞两次，以便除去非特异性结合的金属冠醚。
12小时后用NIR落射荧光显微镜观察在Yb3+[12-MC-4]2[24-MC-8]的5μM溶 液中处理的细胞。暴露于激发波长下800ms。明场图像示于图9A中，发射图像 示于图9B中，并且合并图像(图9A和图9B)示于图9C中。
11小时后用NIR落射荧光显微镜观察用含有Yb3+[12-MC-4]2[24-MC-8]的珠 粒处理的细胞。暴露于激发波长下13s。明场图像示于图10A中，发射图像示于 图10B中，并且合并图像(图10A和图10B)示于图10C中。
11小时后用NIR落射荧光显微镜观察用含有Yb3+[12-MC-4]2[24-MC-8]的珠 粒处理的细胞。暴露于激发波长下8s。明场图像示于图11A中，发射图像示于 图11B中，并且合并图像(图11A和图11B)示于图11C中。
在这两个NIR落射荧光显微镜实验中，使用短的暴露时间明确地检测到用 Yb3+[12-MC-4]2[24-MC-8]孵育的经处理的细胞在NIR范围内的Yb(III)发射。实 验1和实验2表明，Yb3+[12-MC-4]2[24-MC-8]在适于活体HeLa细胞的实验条件下 能够使用。用短暴露时间观察到Yb3+[12-MC-4]2[24-MC-8]的发射证实这些化合 物可以生物条件下操作而不损失发光效率。因此，使用本文公开的金属冠醚配 合物可以在NIR范围内进行高灵敏度的检测。
本文公开的镧系元素金属冠醚配合物是独特的，至少部分地因为它们由于 基于配体的跃迁(包括基于配体的电荷转移态)而在宽范围的紫外可见波长处 表现出吸收。Ln(III)离子的NIR发光被认为是通过激发这些配体的跃迁进行敏化 的。此外，镧系元素金属冠醚配合物的具体结构是多样的，并且Ln(III)离子和 有机配体之间可以具有相对大的距离。
应理解的是，本文提供的范围包括所述的范围和在所述范围内的任何值或 子范围。例如，约12小时至约24小时的范围应被解释为不仅包括明确叙述的约 12小时至约24小时的界限值，也包括单个值(诸如14.25小时、16小时、21.5小 时等)和子范围(诸如15小时至20小时等)。此外，当“约”用于描述一个值时， 这是指包括所述值的微小变化(至多+/-5％)。
在整个说明书中，“一个实施例”、“另一个实施例”、“实施例”等是指：与 该实施例结合进行描述的特定元件(例如，特征、结构和/或特性)包括在本文 描述的至少一个实施例中，并且可以或可以不存在于其它实施例中。此外，应 理解的是，除非上下文清楚地指出，否则针对任何实施例所描述的元件可以以 任何合适的方式在不同实施例中组合。
在描述和要求保护本文公开的实施例时，除非上下文清楚地指出，否则单 数形式“一”、“一个”、和“所述”包括复数形式。
虽然已经详细描述多个实施例，但可以对所公开的实施例进行修改对本领 域技术人员来说是显而易见的。因此，前面的描述应被认为是非限制性的。