技术领域
本发明涉及分子病毒学和免疫学领域，具体而言，本发明涉及人乳头瘤病毒18型 杂交瘤细胞系及其产生的单克隆抗体以及编码它们的序列，和它们进行诊断、预防和治疗 的应用。
背景技术
人乳头瘤病毒（HPV）是无包膜的双链小DNA病毒，主要侵及人的上皮组织，进而诱 发各种良、恶性增生病变。高危型HPV感染与多种恶性肿瘤的发生相关，低危型的HPV感染则 引起肛门和生殖疣。HPV感染的流行范围广，所引发的相关致死性的恶性肿瘤和多种性传播 疾病对人类健康具有严重的危害性，开发安全有效的预防或治疗性疫苗具有重大意义。
HPV病毒颗粒直径为55～60nm，核衣壳呈20面体对称，由72个主要衣壳蛋白L1的五 聚体及次要衣壳蛋白L2组成。大量研究证实，HPVL1蛋白是HPV疫苗的主要靶蛋白。在多种 表达系统中表达的HPVL1蛋白无需L2蛋白辅助即可形成在形态结构与天然病毒颗粒相似 的类病毒颗粒(Virus-L1keParticle，VLP)。重组HPVL1-VLP疫苗已经成功上市并用于预防 HPV感染及由此导致的宫颈癌、尖锐湿疣等疾病，并充分证明了L1-VLP具有与野生同型病毒 相同的抗原性和免疫原性，其结构与天然HPV高度相似，保留了天然病毒的绝大多数中和表 位，可诱导高滴度的中和抗体。
国家食品药品监督管理局（CFDA）在《预防用疫苗临床前研究技术指导原则》中指 出：“在生产工艺的各个环节和步骤中的产品均应建立相应的监控标准，以便后续工艺的进 行，保证产品的质量、工艺的稳定性”，同时要求“在半成品和成品阶段的质量控制至少包括 鉴别试验”
在HPV疫苗研发过程中，需要开展四个方面的测定，即型别鉴定实验、抗原含量检测和 体外效力测定。其方法均可以采用双抗体夹心法ELISA。因此，在疫苗研究中，单克隆抗体是 疫苗抗原质控的重要工具，尤其是具有特异性和中和活性的抗体在疫苗研发中具有不可替 代的作用。
目前国外已上市的人乳头瘤病毒疫苗主要有三种，分别是：2006年首次上市的由 16、18、6和11型人乳头瘤病毒L1重组蛋白构成的四价疫苗（Gardasil），2007年首次上市的 由16和18型乳头瘤病毒L1重组蛋白构成的二价疫苗（Cervarix），以及2014年12月首次上市 的由6、11、16、18、31、33、45、52和58型人乳头瘤病毒L1重组蛋白构成的九价疫苗（Gardasil 9）。本发明提供了最多可针对九价范围内HPV18的特异性和中和活性的单克隆抗体，利用其 中的两株制备的ELISA检测试剂盒，可以特异性地用于快速鉴别并定量HPV18L1蛋白，可以 广泛应用于临床检测和目前疫苗厂家生产疫苗过程中的质检，对女性的健康发展和公共卫 生防控将具有重要的意义。
发明内容
本发明的第一个目的是提供能够识别HPV18的单克隆抗体以及产生该抗体的杂交 瘤细胞系。
本发明的第二个目的是提供一种用于检测HPV18的双抗体夹心ELISA试剂盒。
本发明的第三个目的在于提供单克隆抗体的制备方法。
本发明的第四个目的在于提供HPV的抗原检测试剂盒的制备方法。
本发明实验目的是通过如下技术方案实现：
本发明提供的单克隆抗体，其是以HPV18L1五聚体蛋白作为免疫原，制备获得。具体地 说是HPV18L1五聚体蛋白作为免疫原免疫小鼠，采用杂交瘤技术经过细胞融合并筛选得到 能持续、稳定分泌抗HPV18L1的杂交瘤细胞株，由各细胞株分泌得到单克隆抗体。
在一个优选的实施方案中识别人乳头瘤病毒18型L1蛋白的单克隆抗体，由杂交瘤 细胞株1B1产生，其保藏编号：CGMCCNo.11294；分类命名：杂交瘤细胞；保藏单位名称：中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院 3号；保藏日期：2015年10月30日。
本发明公开的单克隆抗体1B1，包含至少1个抗体重链可变区和至少1个抗体轻链 可变区，并且其中所述抗体轻链可变区具有CDR序列CDRL1、CDRL2或/和CDRL3，其中:
CDRL1包括SEQIDNO：1;
CDRL2包括SEQIDNO：2;
CDRL3包括SEQIDNO：3。
抗体重链可变区具有选自CDRH1、CDRH2或/和CDRH3，其中：
CDRH1包括SEQIDNO：4；
CDRH2包括SEQIDNO：5；
CDRH3包括SEQIDNO：6。
在一个优选的实施方案中人乳头瘤病毒18型L1蛋白的单克隆抗体或抗原结合片 段，包含至少1个抗体轻链可变区包括SEQIDNO：7和至少1个抗体重链可变区包括SEQID NO：8。
在一个优选的实施方案中本发明提供一种分离的核酸，该核酸编码本发明抗体的 至少一个轻链可变区SEQIDNO：7和重链可变区SEQIDNO：8。
在一个优选的实施方案中本发明提供一种核酸的表达载体，该载体转染宿主细胞 时所述核酸与宿主细胞识别的控制序列有效连接。
在一个优选的实施方案中本发明提供一种表达载体的宿主细胞。
在一个优选的实施方案中本发明提供另一种人乳头瘤病毒18型L1蛋白的单克隆 抗体，其特征在于该单克隆抗体由杂交瘤细胞株4C2产生，其保藏编号：CGMCCNo.11297；分 类命名：杂交瘤细胞；保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保 藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2015年10月30日。
由杂交瘤细胞株4C2产生的单克隆抗体，包含至少1个抗体重链可变区和至少1个 抗体轻链可变区，并且其中所述抗体轻链可变区具有CDR序列CDRL1、CDRL2或/和CDRL3，其 中:
CDRL1包括SEQIDNO：9;
CDRL2包括SEQIDNO：10;
CDRL3包括SEQIDNO：11。
由杂交瘤细胞株4C2产生的单克隆抗体的重链可变区具有选自CDRH1、CDRH2或/和 CDRH3，其中：
CDRH1包括SEQIDNO：12；
CDRH2包括SEQIDNO：13；
CDRH3包括SEQIDNO：14。
在一个优选的实施方案中本发明提供一种识别人乳头瘤病毒18型L1蛋白的单克 隆抗体或抗原结合片段，其特征在于其中包含至少1个抗体轻链可变区包括SEQIDNO：15 和至少1个抗体重链可变区包括SEQIDNO：16。
在一个优选的实施方案中本发明提供一种分离的核酸，其编码本发明抗体的至少 一个轻链可变区SEQIDNO：15和重链可变区SEQIDNO：16。
在一个优选的实施方案中本发明提供一种核酸的表达载体，其载体转染宿主细胞 时所述核酸与宿主细胞识别的控制序列有效连接。
在一个优选的实施方案中本发明提供一种包括表达载体的宿主细胞。
另一方面本发明提供一种检测HPV18L1的试剂盒，包括本发明公开的单克隆抗体 或抗原结合片段。
本发明公开的检测HPV18L1的试剂盒，还包括可检测的标记：放射性同位素、荧光 物质、发光物质、有色物质和/或酶。
另一方面本发明提供一种检测一种特异性检测人乳头瘤病毒18型L1蛋白的组合 物，该组合物包含本发明的单克隆抗体或抗原结合片段。
人乳头瘤病毒18型的单克隆抗体可按如下方法制备：
1)利用的人乳头瘤病毒18型L1蛋白的五聚体作为免疫原，纯化后免疫Balb/c小鼠，并 采血，用间接ELISA方法检测血清效价，选择血清效价高的Balb/c小鼠进行加强免疫，并从 该小鼠体内制备得到免疫脾细胞；
2)制备骨髓瘤细胞(SP2/0)悬浮液并注射Balb/c小鼠，待小鼠长出实体瘤后制备骨髓 瘤细胞，将骨髓瘤细胞与步骤1）所述的免疫脾细胞进行融合，制备出杂交瘤细脆，检测筛选 效价高的杂交瘤细胞株并进行克隆扩大培养；
3)将步骤2）所述的建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液后腹腔注射小鼠，收集 小鼠腹水，纯化后经特异性鉴定和中和活性检测即得到人乳头瘤病毒18型的单克隆抗体。
人乳头瘤病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒的制备方法：
以单克隆抗体4C2作为捕获抗体包被酶标板，以单克隆抗体1B1经过辣根过氧化物酶标 记后作为检测抗体，以重组人乳头瘤病毒-18型VLP蛋白作为标准品配制标准曲线对照。该 试剂盒还包括浓缩洗涤液，样品稀释液干粉，酶标抗体稀释液干粉，底物液A，底物液B和终 止液等。其中所述的浓缩洗涤液，底物液A，底物液B，终止液的组分及配比如下：
浓缩洗涤液：Nacl8.18g，Na2HP04·12H2O3.58g，KCL0.2g，KH2PO40.25g，加双蒸水 至1000mL；
底物液A：3，3’，5’，5-四甲基联苯二胺200mg，无水乙醇100mL，加双蒸水至1000mL；
底物液B：Na2HPO414.6g，柠檬酸9.3g，0.75%浓度的过氧化氢尿素6.4mL，加双蒸水 至1000mL，调节pH至5.0~5.4；
终止液：1mol/L硫酸溶液。
另一方面本发明提供一种试剂盒在制备预防或检测人乳头瘤病毒18型L1感染的 检测组合物中的应用。
另一方面本发明提供一种组合物在制备预防或检测人乳头瘤病毒18型L1感染的 检测组合物中的应用。
本发明获得的单克隆抗体具有良好的特异性，实验表明，与HPV其它八个型别均没 有交叉反应，在目前已经上市的疫苗产品，九价是最多型别的产品，间接ELISA表明这些抗 体同时具有较高的效价，因此本发明获得的单克隆抗体可用于二价、三价或四价，目前最新 上市的九价疫苗以及包括HPV18型别的疫苗或组合物中关于HPV18蛋白的特异检测。
本发明采用双抗夹心法，利用两个单克隆抗体对HPV18进行特异检测和定量，既能 检测HPV18的五聚体，也能检测HPV18VLP，从而，本发明提供一种用于HPV18特异检测和定 量的试剂盒，其检测限：0.1ug/ml，线性范围：10-0.1ug/ml，用于检测具有高特异性、高敏感 性的优点，可以准确检测样品中具有生物活性的HPV18的水平，在临床检测和疫苗厂家生 产疫苗过程中的质检将会得到广泛应用。
附图说明
附图1：SDS-PAGE分析检测结果，检测显示，经纯化的各亚型单克隆抗体的纯度均 达到95％以上。
附图2：ELISA双抗体夹心法检测HPV18L1VLP标准曲线，纵坐标为OD450.的对数 值，横坐标为HPV18L1VLP浓度的对数值。
具体实施方法
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发 明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范 围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 实施例中未注明来源的试剂均为本领域常规试剂或市售可得的试剂。
实施例1、杂交瘤细胞系的建立
1、动物免疫
1）抗原制备：利用大肠杆菌表达系统，制备HPV18型的L1蛋白的五聚体蛋白，透射电镜 观察(100，000倍)，结果显示，视野中可见直径为10nm左右的五聚体，将五聚体蛋白稀释至 10μg/ml。
2）基础免疫：将抗原与福氏完全佐剂等体积混合并充分乳化，分点皮下注射，每只 Balb/c小鼠每次注射量为10μg。
3）加强免疫：加强免疫采用抗原与福氏不完全佐剂的乳化液。在进行细胞融合前3 天，经腹腔注射含15ug抗原的生理盐水溶液。
2、杂交瘤细胞的制备
按常规方法收集小鼠的脾细胞与SP2/0细胞按10:1的比例以500g/L的PEG4000进行融 合。用HAT培养液选择培养，融合后10～15天，取上清采用间接ELISA法筛选杂交瘤细胞株。 对所得阳性克隆株采用有限稀释法进行亚克隆。间接ELISA法的操作步骤如下：用200ng/孔 的HPV18VLP包板，用免疫小鼠血清1:2000作为阳性对照，无克隆生长的培养基上清和正 常小鼠血清作为阴性对照，每孔加1:2000HRP-山羊抗小鼠IgG100μl，最后测定450nmOD 值。凡OD450值大于阴性对照2倍以上者，即可初步判定为阳性克隆。
3、杂交瘤细胞系的建立
将步骤2获得的阳性克隆继续克隆化，将上述杂交瘤细胞系在含有10%胎牛血清的DMEM 培养基中继续进行培养、传代，培养到10代后，杂交瘤细胞系仍然能够生长良好、稳定传代， 获得稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
实施例2抗HPV18的单克隆抗体的制备
选择成年BALB/c小鼠，腹腔接种降植烷，每只小鼠0.5ml。7-10天后腹腔接种杂交瘤细 胞，每只小鼠1×106-2×106个。间隔5天后，待腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即 可用16号针头采集腹水。
将腹水离心（13000r/min30分钟），除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清。用 ProteinG～SepharoseCL-4B进行纯化，上柱液为20mM的PBS缓冲液，柱层析洗脱液为： pH2.7,20mM的甘氨酸缓冲液，得到抗HPV18的单克隆抗体。SDS-PAGE检测显示，经纯化的单 克隆抗体的纯度均达到95％以上，具体见附图1。
实施例3：抗体的亚型鉴定
采用间接ELISA法，使用抗小鼠各种IgG亚型的抗体鉴定上述杂交瘤细胞产生的抗体的 IgG亚型。
结果表明，10株克隆，3A2克隆为IgG2a,3D2和4H1为IgG3,其余均为IgG1，结果见表 1。
表1ELISA鉴定抗体亚型（OD450值*）
*：所有数值均为复孔的平均值
实施例4：ELISA检测抗体与HPV18VLP反应性
通过间接法ELISA验证纯化抗体能否可以方便、快速的检测HPV18，并且通过使用不同 浓度的抗体，可以初步判断抗体的亲和力。
将HPV18VLP以200ng/孔包被于96孔板，然后以1ug/ml、0.2ug/ml和0.04ug/ml 的抗体使用浓度添加到各个孔里，通过ELISA检测各个单克隆纯化抗体与HPV18VLP的结合 强度。结果表明，10株抗体，在本实验所使用的浓度中均能与HPV18VLP结合，使用浓度大于 0.05ug/ml时信号强度均大于1，结果见表2。
表2ELISA检测抗体与HPV18VLP结合强度
*：所有数值均为复孔的平均值
实施例5：抗体的特异性鉴定
HPV-16L1VLP、HPV-18L1VLP和HPV-58L1VLP通过碱变性和热变性处理，使之二级 或三级结构破坏，一级结构保存。再与单克隆抗体进行反应，采用间接法ELISA对其进行检 测。通过本实验，不仅可以鉴定抗体对HPV-16L1VLP、HPV-18L1VLP和HPV-58L1VLP三 种VLP的识别情况，还能鉴定该抗体是否是构象型识别抗体。若蛋白质变性后与单抗反应的 OD450值明显降低，则证明该单抗为构象型识别抗体。
实验步骤：VLP变性蛋白处理：0.2M碳酸钠，0.01MDTT，pH10.6室温孵育30分钟 后煮沸5分钟。包被：将VLP蛋白稀释至2μg/ml。以100μl/孔加至96孔酶标板，4℃包被过 夜。封闭：将包被好酶标板甩干。以300μl/孔封闭液（2%BSA）加至板内，室温放置1-2小 时。样品稀释：用样品稀释液将抗体样品分别稀释至0.3μg/ml，混匀，100μl/孔加至酶标 板内，室温放置1h。加二抗：将封闭后酶标板甩干，HRP标记羊抗鼠二抗以1:4000浓度，100 μl/孔加至酶标板内，室温放置1h。显色：每孔300μl洗板5次，甩干。用卫生纸擦拭底部。以 100μl/孔加入显色液，室温避光显色10分钟。终止：以100μl/孔加入终止液，终止反应。读 数：将酶标板放入酶标仪中，OD450进行读数和数据分析。
抗体的特异性检测结果如表3所示。结果表明，除了克隆7H8与HPV16、HPV58VLP 略有交叉反应，其它均为HPV18VLP特异的克隆。这些克隆除了7H8,识别未变性HPV18VLP 的数值均大于1，为明显阳性结果，而识别变性HPV18VLP的数值均小于0.1，为阴性结果。表 明这些单抗均为构象型识别单抗。而7H8则与变性的HPV18VLP有一定的交叉反应，表明该 株单抗也能识别线性表位。
表3抗体的特异性ELISA检测（OD450.数值*）
*所有数值均为复孔的平均值L：未变性蛋白D：变性处理蛋白
实施例6：抗体的中和活性检测
通过假病毒－细胞中和模型，检测各株抗体的中和活性能力。
先将各亚型抗体用PBS稀释成200ug/ml，然后将抗体进行4倍比梯度稀释，取50ul 各浓度抗体与50ul合适浓度的HPV18假病毒在96孔板中4℃孵育一小时，以假病毒和PBS 的混合液为对照。然后将各混合液分别加入预先铺有293FT细胞的96孔板中在细胞培养箱 中培养72小时。之后收集细胞，用流式细胞术检测荧光，计算荧光抑制率，荧光抑制率＝ （1－实验组/对照组）×100％。将荧光抑制率大于50％和90％分别作为该单抗对HPV18假 病毒的中和滴度。表4结果表明，所有克隆均有一定的抑制反应，本发明的这些单抗均有中 和活性。
表4各亚型抗体的抑制率滴度
实施例7：抗体的中和血清体外ELISA竞争实验
利用竞争性ELISA实验，检测制备的抗体与世界卫生组织（WHO）的抗HPV18中和抗体国 际标准品（1stWHOReferenceReagent2007,Anti-humanpapillomavirustype18 serum,NIBSC10/140）是否有竞争性。WHO的标准品是人源的多抗血清，购自英国国家生物 制品检定所（NationalInstituteforBiologicalStandardsandControl，NIBSC）。通 过本实验，可以分析各株单抗的表位和国际标准品表位的相关性。
首先，把HPV18VLP稀释至100ng/ml,100ul/孔加入96孔板中，4℃孵育过夜。将96 孔板洗涤后用2%BSA封闭液室温封闭2小时，然后将100ul0.5IU/ml的国际标准品和 100ul0.3ug/ml的HRP标记抗体加入96孔板中，以100ulPBS作为国际标准品的对照。室温 孵育1.5小时后洗板，终止反应，显色，用酶标仪OD450读数。计算抑制率＝（1－实验组OD./ 对照组OD.）×100％。
抗体的中和血清体外ELISA竞争实验结果如表5所示，国际标准品对克隆抗体1B1、 3A4、4C12、4C2、4D6和4H5均有明显的强抑制（抑制率>30％）,国际标准品对克隆抗体4H1有 弱抑制（抑制率<20％）。以上结果表明，这些克隆均与国际标准品的表位有一定的相关性。
表5抗体的中和血清体外ELISA竞争实验
实施例8：抗体1B1和抗体4C2的亲和力鉴定
使用BIACORE3000（GE）生物传感器分析了抗原抗体结合及解离的动力学，计算了单克 隆抗体1B1和4C2与HPV18VLP的结合常数Ka,解离常数Kd和亲和力KD,以反映该抗体与HPV18 VLP的结合程度的强弱。
用pH5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液将HPV18VLP稀释至40μg/ml,按照制造商的说明 书(BIACORE3000生物传感器，美国GE公司)，将HPV18VLP偶联制芯片上，设置偶联水平为 4000RU。
用PBS缓冲液分别稀释抗体至0.3125，0.625，1.25，2.5，5，10和20nmol/L。检测 时，先抗体进样60秒，然后结合60秒，解离500秒，最后用10mM的pH5.0的醋酸-醋酸钠缓冲 液再生芯片。按照制造商的说明书进行抗原抗体结合的动力学分析，并且数据用Biacore 3000Evaluation软件进行分析。抗体1B1、4C2与HPV18VLP的亲和力检测结果如表6所示， 结果表明1B1、4C2抗体为特异性的，仅与HPV18VLP结合，与其它8种HPVVLP均不结合。
表6抗体1B1和抗体4C2的亲和力鉴定
aN/A：NotApplicable，表示不结合。
实施例9：克隆1B1和克隆4C2的可变区序列测定
将获得的1B1和4C2单克隆细胞分别提取mRNA，反转录为cDNA，使用可变区通用引物进 行高保真PCR扩增，将PCR产物片段插入到T载体内进行DNA序列测定，并将获得的序列翻译 成蛋白质的氨基酸序列。将获得的序列进行比对后未显示有相同序列，说明所获得的序列 为特异的序列。
序列见序列表。
利用上述鉴定的序列，通过已知的抗体工程技术，可以制备各种基因工程抗体，例 如嵌合抗体，人源化抗体，单链抗体，双抗体等，并保留其所源自的单克隆抗体的生物学特 性。
实施例10：HPV18检测试剂盒的组装
以单克隆抗体4C2作为捕获抗体包被酶标板，以单克隆抗体1B1经过辣根过氧化物酶标 记后作为检测抗体，以重组人乳头瘤病毒-18型VLP蛋白作为标准品配制标准曲线对照。
包被抗体4C2用pH9.60.05mol/L的碳酸盐缓冲溶液稀释成10μg/mL，在酶标板的 每孔加100μL，4℃下包被过夜，倾去包被液，用PBST洗涤2次，拍干，然后在每孔中加入200μL 3%的小牛血清白蛋白（BSA），放入37℃恒温箱中封闭2小时后，用PBS洗涤1次，加入10%的蔗 糖水溶液，室温保护1小时，拍干后经干燥后装铝箔袋抽真空后4℃保存。
用辣根过氧化物酶标记1B1的抗体，得1B1-HRP并保存。向酶标板中分别加入VLP样 品100μL/孔，37℃孵育1.5小时，经洗板后再加入1B1-HRP（0.5ug/ml）100μL/，37℃孵育1小 时，经洗涤拍干后加入显色剂进行显色，37℃温育10min，加入终止液50μL/孔，用酶标仪 450nm波长进行读数。
该试剂盒还包括浓缩洗涤液，样品稀释液干粉，酶标抗体稀释液干粉，底物液A，底 物液B和终止液等。其中所述的浓缩洗涤液，底物液A，底物液B，终止液的组分及配比如下：
浓缩洗涤液：Nacl8.18g，Na2HP04·12H2O3.58g，KCL0.2g，KH2PO40.25g，加双蒸水 至1000mL；
底物液A：3，3’，5’，5-四甲基联苯二胺200mg，无水乙醇100mL，加双蒸水至1000mL；
底物液B：Na2HPO414.6g，柠檬酸9.3g，0.75%浓度的过氧化氢尿素6.4mL，加双蒸水 至1000mL，调节pH至5.0~5.4；
终止液：1mol/L硫酸溶液。
实施例11：HPV18检测试剂盒的线性与重复性检测
应用ELISA双抗体夹心法，克隆1B1和克隆4C2抗体做配对实验，确定以克隆4C2为包被 抗体，用HRP标记克隆1B1作为检测抗体，确定了ELISA检测方法，试剂盒检测线性范围如 表7。附图见图2，线性范围为0.1ug/ml－10ug/ml。
表7试剂盒线性范围检测
将抗原依次按照10ug/ml、3ug/ml、1ug/ml、0.3ug/ml、0.1ug/ml进行稀释，按照上述 ELASA实验操作步骤进行批间和批内重复性实验。每份样品批内和批间实验都重复检测10 次，并计算标准偏差及变异系数。平均标准偏差为0.234，平均变异系数5.558%，说明本发明 建立的双抗夹心ELASA抗原检测方法具有良好的重复性。
实施例12：HPV18检测试剂盒特异性试验
用上述建立的方法进行HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV45、HPV52和HPV58 VLP的样品检测，VLP变性蛋白处理：0.2M碳酸钠，0.01MDTT，pH10.6室温孵育30分钟后 煮沸5分钟。96孔板每孔检测30ug/mlVLP100ul。结果见表8，结果表明，该试剂盒检测未 变性HPV18VLP信号良好，不识别变性的HPV18VLP，并且与其它型别HPVVLP无交叉。
以上结果表明，试剂盒可以用于特异的检测具有生物活性的HPV18VLP，因此，可 以广泛应用于HPV18疫苗研发。
表8ELISA法检测HPV18VLP特异性评价结果（OD450）
*:所有数值均为复孔的平均值
实施例13：HPV18检测试剂盒的测定程序
1、配制样品
1)洗液配制：取出浓缩洗液，加入蒸馏水，定容至1L充分混匀备用；
2)样品稀释液配制：用1中所得洗液稀释样稀干粉至50ml，充分混匀备用；
3)酶标抗体稀释液配制：用1中所得洗液稀释酶稀干粉至50ml，充分混匀备用；
4)用配制好的样稀稀释标准品，设置稀释梯度。浓度分别为30ug/ml、10ug/ml、3ug/ml、 1ug/ml、0.3ug/ml、0.1ug/ml、0.03ug/ml，备用。
5)用配制好的酶稀稀释酶标抗体，取适量酶标抗体1300倍稀释，备用。
2、测定步骤
1）加样：将配制好的标准品及待测样品加入包被板内，100ul/well，同时设置复孔及阴 性对照孔。（阴性对照空为样品稀释液）盖上封板膜放入37℃温箱孵育45min。
2）加酶标抗体：将酶标板从37℃温箱取出，弃去孔内液体，加入洗液300ul/well， 洗板5次。最后一次弃去孔内液体后在卫生纸上拍干。加入配制好的酶标抗体溶液100ul/ well，盖上盖板膜放入37℃温箱孵育45min。
3）显色：将酶标板从37℃温箱取出，弃去孔内液体，加入洗液300ul/well，洗板10 次。最后一次弃去孔内液体后在卫生纸上拍干。取所需体积的显色底物A液与显色底物B液 按照1：1的比例混匀，100ul/well加入酶标板中，室温避光显色5分钟。
4）终止反应：取所需体积终止液加入酶标板中，50ul/well。
5）读值：将酶标板放入酶标仪中，OD450nm进行读数。
6）结果判定：Cutoff值=2.1×NC均值，高于此数值的样品检测结果判定为阳性。
实施例14：HPV18检测试剂盒的应用
取标准品HPV18VLP蛋白进行梯度稀释，采用本发明制备的双抗体夹心ELISA抗原检测 试剂盒对稀释后的样品HPV18、HPV18、HPV58的L110μg/ml五聚体抗原进行检测，借以评价 该试剂盒的初步应用效果。结果显示，本发明所建立的ELISA方法可以检测到HPV18五聚体 蛋白，并具有特异性。
表9ELISA法检测HPV18五聚体特异性评价结果（OD450）
SEQUENCELISTING
<110>北京康乐卫士生物技术股份有限公司
<120>人乳头瘤病毒18型单克隆抗体及其应用
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<170>PatentInversion3.3
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