本发明是于2013年2月28日申请的申请号为201310062950.2、发明名称为“大肠杆菌外膜蛋白TolC核酸适配体的序列及用途”的分案申请。
技术领域
本发明属于分子生物学和医学微生物技术领域，涉及大肠杆菌外膜蛋白TolC核酸适配体的序列及用途。
背景技术
大肠杆菌(Escherichia coli)是埃希氏菌属的代表菌，是构成人类肠道中的正常菌群之一，又是重要的条件致病菌，极易通过多种形式和途径侵入肠道外的组织和器官，造成各种严重感染。随着抗菌药物的临床广泛应用，诱导了大量该菌属耐药菌株的产生，并形成了该菌对单一抗菌药物耐药到对多种抗菌药物同时耐药，由低耐药率到高耐药率的发展，给临床治疗带来了极大的困难，导致较高的病死率。目前国内外对大肠杆菌的耐药性机理展开了深入的研究。研究表明，主动外排泵为大肠杆菌多重耐药的重要机制。大肠杆菌外排泵包括：RND、MFS、ABC、SMR、MATE五类，其中前三者必须与外膜蛋白(OMP)TolC构成转运共同体，才能完成对多种药物的外排，由此可见TolC是构成大肠杆菌外排泵的重要组成成分。TolC是位于外膜上的孔道蛋白，上端为开放结构，以便给外排底物提供泵出的宽阔通道；下端为封闭结构。外排泵三联复合物构象的改变，可使孔道定期开放或闭合。TolC结构的改变会引起它们三者相互作用的减弱甚至三联复合物的解体。在关于大肠杆菌外膜蛋白的研究报导中，很多结果提示了TolC蛋白在大肠杆菌的多重耐药机制中起到至关重要的作用。但目前没有报道通过改变该蛋白结构来抑制耐药性。
适配体(Aptamers)的研究是一个新的热点领域，它是能够与许多目标分子(蛋白，药物，无机或有机分子)发生高亲合性和特异性结合的一类单链核酸(DNA or RNA)。至今发现高亲和特异性适配体的方法是配体指数富集系统展开(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)。由于适配体与配体分子结合的高特异性以及高亲和性，在医学研究中被广泛应用于检测和药物研究等方面。Yuan等(Yuan L，et al，Anal Chem，2007，79(3)：1082)利用等离子体表面共振成像与适配子技术建立蛋白质芯片，检测该蛋白质芯片上吸附的蛋白抗体凝血酶、血管内皮生长因子(VEGF)复合物。Cao等(Cao X，et al，Nucleic Acids Res，2009，37(14)：4621-8)利用筛选出的针对金黄色葡萄球菌的适配子来检测金黄色葡萄球菌。
目前国内外大部分从事核酸适配体研究的科学家和生物技术公司主要将适配体运用于病毒感染、癌症、自身免疫病、血管性疾病的临床治疗，并成为较为理想的临床治疗的新手段。其治疗机制主要是通过折叠成一定的三维结构直接与病理学相关蛋白质特异性结合，抑制这些蛋白质的活性，以达到治疗目的。Feng H等(Feng H，et al，PLoS One，2011，6(11)：e27862)筛选出了能与乙型肝炎病毒高亲和力结合，干扰病毒P-ε复合物形成的适配体。但迄今尚无针对细菌外膜蛋白的适配体报道或公开，因此实有必要开发一种可特异性结合大肠杆菌外膜蛋白TolC的核酸适配体。
发明内容
本发明拟考虑将核酸适配体应用于改变TolC蛋白结构来有效阻塞大肠杆菌外排泵外排活性。开发可特异性结合大肠杆菌外膜蛋白TolC的核酸适配体，为抑制大肠杆菌多重耐药提供有力支持，具有重要的临床价值。
本发明的目的是提供一种可特异结合大肠杆菌外膜蛋白TolC的核酸适配体。该适配体具有如下序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20。
具体的，所述SEQ ID NO：1为：5’-TGCGTGTTTACGTGTCGATGTCCGGGTACCCTCGG-3’；
所述SEQ ID NO：2为：5’-CTCTTAGCCATTTTGGTATGCGTATTGCTCTACAG-3’；
所述SEQ ID NO：3为：5’-ATATATTGCTCTGATCGTACTCTTATTAGGTTAGT-3’；
所述SEQ ID NO：4为：5’-ATGACGCTGTGGTATTACGTCCTCCTGTATTTGCC-3’；
所述SEQ ID NO：5为：5’-TCTAAGTGGAATCTACCACCAACGTATTTTTCCTC-3’；
所述SEQ ID NO：6为：5’-TCCGCCTATTCGGGAGGGAATATTGCTGATTTGTA-3’；
所述SEQ ID NO：7为：5’-CTCTTCAGTTTTAGACAATGCACGTTTCAGCGGTG-3’；
所述SEQ ID NO：8为：5’-TCCAGGCTATAATTTCTTGGAACTCCCTCCGTTAG-3’；
所述SEQ ID NO：9为：5’-CTTTCGAAGGGACTTTAACGGGTATATCCGGTTTT-3’；
所述SEQ ID NO：10为：5’-ATTACATGCTCTGAGCTTTTTGTATGAGAAATGAT-3’；
所述SEQ ID NO：11为：5’-CGCTTAGCTTGTGATTTCATCTTTCACACAAGAAT-3’；
所述SEQ ID NO：12为：5’-CGGAGATCTGTTACACTTCGGTACGTCTTAGTTTG-3’；
所述SEQ ID NO：13为：5’-CTACCATGTTCAGTGGTTTTGGGATTTTCATACAT-3’；
所述SEQ ID NO：14为：5’-TGAGATCGGTGAGTTAGTATCTTTTATTCAGTTTT-3’；
所述SEQ ID NO：15为：5’-GCATTGCGTGACATGGCCTTGCTATCCCTGTTCGT-3’；
所述SEQ ID NO：16为：5’-TCCTAAAAGCTAGTTATAGTAAATTGAAAACTTAG-3’；
所述SEQ ID NO：17为：5’-TGGAGCTTAGATTTTGAAGCAGTTACATTTCCCGA-3’；
所述SEQ ID NO：18为：5’-TACTGCGAGCTTCATTTTTACTTGGTAGTGTTGTG-3’；
所述SEQ ID NO：19为：5’-CGAACGAATATAATTATGGCGTCCCCGGGGTTTCG-3’；
所述SEQ ID NO：20为：5’-CTAGTTATGACATTTGTGTCATTTATCCCACGCTG-3’
本发明之大肠杆菌外膜蛋白TolC核酸适配体序列，通过下述方法制得：
采用核酸适配体的体外SELEX筛选技术，以大肠杆菌外膜蛋白TolC为筛选靶标，从体外合成的随机寡聚DNA文库(5’-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3’)中筛选出与TolC蛋白特异结合的核酸适配体。
优选的，所述大肠杆菌外膜蛋白TolC采用如下方法纯化得到：
采用分子克隆技术，根据大肠杆菌外膜蛋白TolC的基因组序列设计特异引物，所述特异引物之上游引物Pa为5’-CGGGATCCATGAAGAAATTGCTCCCCATTCTT‐3’，其下游引物Pb为5’‐CCGCTCGAGGTTACGGAAAGGGTTATGACCGTT‐3’，以全长cDNA为模板，PCR扩增，得到目的基因经Bam H I和Xho I双酶切，同样处理PET-30a质粒，再用T4连接酶连接制得含有TolC基因的重组质粒；重组质粒转化感受态细胞BL21，从转化的平板挑单克隆到液体培养基中培养，IPTG诱导表达，经固液分离，取沉淀用Tris-HCl溶液吹散，超声粉碎，然后电泳；柱层析分离纯化蛋白质。
在一个具体实施例中，本发明之大肠杆菌外膜蛋白TolC核酸适配体序列的制备方法是：
采用分子克隆技术，根据大肠杆菌外膜蛋白TolC的基因组序列设计特异引物，在一个具体实施例中，该特异引物为上游引物Pa，下游引物Pb，以全长cDNA为模板，PCR扩增。得到目的基因经Bam H I和Xho I双酶切，同样处理PET-30a质粒，再用T4连接酶连接制得含有TolC基因的重组质粒。
重组质粒转化感受态细胞BL21，从转化的平板挑单克隆到1.5ml LB液体培养基中培养，IPTG(0.5mM)诱导表达，取1ml诱导的菌液，12000rpm，离心1min，弃上清，沉淀用50-100μl10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液吹散(加入缓冲液的量视菌体量而定)，超声粉碎(500W，30次，每次10s，间隔15s)。加入50μl2×loading buffer，100℃煮5min，电泳。
过镍柱蛋白质纯化，分别收集蛋白峰，电泳检测蛋白纯化效果(纯化结果见图2)。
随后利用适配体的SELEX体外筛选技术，以收集纯化后的TolC为筛选靶标，从体外合成的随机寡聚DNA文库(5’-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3’)中筛选出与TolC蛋白特异结合的核酸适配体，将筛选出来的序列用引物P1(5’GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-3’)和引物P2(5’-GATCCGGGCCTCATGTCGAA-3’)进行扩增。将PCR扩增产物纯化后取1μl，与载体PGM-T在T4DNA连接酶的作用下连接，再将其转化到感受态细胞，取适当体积均匀涂布于含有IPTG、x-gal、抗生素(Amp)的LA平板，12～16小时后用接种环挑取筛选平板上的单个白色菌落于含Amp的LB液体培养基，37℃培养过夜。取菌液lml于离心管中，封膜后送上海生工生物技术有限公司(以下简称上海生工)测序。
所述序列选自天然存在或人工合成的序列，或任何其他来源的同样的序列。
本发明进一步提供所述核酸适配体序列的用途，例如该序列在制备药物或制品中的应用。在一个具体实施例中，本发明提供所述序列在制备大肠杆菌外排泵抑制剂中的应用。
本发明的另一目的在于提供所述核酸适配体序列在制备检测TolC蛋白的探针或靶点中的应用。
本发明还提供所述适配体在制备大肠杆菌外排泵抑制剂中的应用。
本发明还提供所述适配体在制备检测TolC蛋白的探针或靶点中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种抑制大肠杆菌外排泵外排活性或减少大肠杆菌外排泵外排的方法，包括给予有效量的所述的适配体。
本发明中，所述的核酸序列构成的适配体可与大肠杆菌外膜蛋白TolC特异性结合，可用于外排泵抑制剂药物的设计和制备。所述的核酸序列构成的适配体也可以作为检测TolC蛋白的探针或靶点。本发明所提供的核酸适配体序列与作为靶标的大肠杆菌外膜蛋白TolC具有非常强的亲和性，因而所述序列具有特异性强的优点；此外，所述序列可以大量快速地在体外合成，且制备方法简单，因而比较容易获得。
附图说明
图1为适配体抑制大肠杆菌外排泵作用机理；
图2为大肠杆菌外膜蛋白TolC纯化电泳图；
附图说明：
图2横坐标代表：泳道1为TolC上清；泳2为TolC沉淀；泳道M为蛋白marker；图2纵坐标代表：蛋白质的分子量，单位kD。
具体实施方式
以下配合本发明的优选实施例，进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段。
本发明拟考虑将核酸适配体应用于改变TolC蛋白结构来有效阻塞大肠杆菌外排泵外排活性，阻塞原理如图1所示。开发针对大肠杆菌外膜蛋白TolC的核酸适配体，将为抑制大肠杆菌多重耐药提供有力支持，具有重要的临床价值。
实施例1：外膜蛋白TolC基因扩增
采用分子克隆技术，根据大肠杆菌外膜蛋白TolC的基因组序列设计特异引物(上游引物Pa，其下游引物Pb)，以全长cDNA为模板，PCR扩增。PCR反应条件：94℃，预变性5min，然后以94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，进行3O个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经1wt％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段。
实施例2：重组表达质粒的构建
(1)得到目的基因经Bam H I和Xho I双酶切，酶切体系如下：25μl质粒，2μl Bam H I，2μl Xho I，8μl10×Buffer，43μl ddH2O，混合物37℃过夜反应，用快速胶回收试剂盒纯化酶切产物。
(2)PET-30a质粒经Bam H I和Xho I双酶切，酶切体系如下：5μl载体(pET-30a)质粒，2μl BamH I，2μl Xho I，8μl10×Buffer，63μl ddH2O，混合物37℃过夜反应，用快速胶回收试剂盒纯化酶切产物。
(3)用T4连接酶连接大肠杆菌外膜蛋白TolC的基因和PET-30a载体，获得重组质粒。连接体系如下：1ul载体(pET30a)，3ul PCR回收产物，4ul连接酶(Takara，DNA ligation Kit Ver2.0)，混匀，在室温下反应30min以上。
(4)重组质粒转化感受态细胞BL21。取出－80℃温度保存的感受态细胞(BL21)，放在冰上缓慢解冻。调2台水浴锅至水温分别为42℃和37℃。将感受态细胞BL21加入连接产物，冰上放置30分钟。42℃热激90秒。放回冰上，2分钟后加入800ul无抗性的LB培养基(卡那霉素)(购自上海生工)。放入37℃摇床中45分钟，8000rpm离心3分钟，弃大部分上清，留约100-150ul重悬，选择有相应抗性的LB平板，涂板。晾干，于37℃培养箱中倒置培养过夜。
实施例3：TolC蛋白在大肠杆菌中的表达
从转化的平板挑单克隆到1.5ml LB液体培养基中，37℃，200rpm培养。将培养的菌液转接到500mL LB液体培养基混合，37℃，200rpm，培养至OD＝0.6-0.8，IPTG(0.5mM)诱导4h。用400m大离心筒，6000rpm，离心5min，取上清。沉淀用20-30ml10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液吹散，超声粉碎(500W，30次，每次10s，间隔15s)。取100μl超声后的菌悬液，12000rpm，离心10min，分别得TolC上清和TolC沉淀，取50μlTolC上清至另一EP管，TolC沉淀用50μl10mM Tris-HCl pH8.0)溶液吹散，加入50μl2×loading buffer，100℃煮5min，电泳。电泳图如图2所示。结果显示在52kD处泳道1和2即TolC上清和TolC沉淀均有一明显增粗的蛋白质条带(如图2所示)M为电泳技术常规的标准分子量marker，目的条带和Marker的那条带位置相同就可以确定目的条带的分子量，结果表明目的蛋白在上清和沉淀中均有表达。
实施例4：蛋白质纯化
用纯水洗镍柱至pH7.0，后挂镍至pH2-3。纯水洗柱至pH7.0，用100mlTris-HCl(10mM，pH8.0)溶液平衡镍柱，再用50ml含0.5M氯化钠的10mMTris-HCl(pH8.0)溶液平衡镍柱。将样品外膜蛋白TolC稀释上样，上样结束后用0.5M氯化钠的10mM Tris-HCl pH8.0)溶液洗柱，分别用含15mM咪唑、60mM咪唑、300mM咪唑的10mM Tris-HCl(pH8.0)(含0.5M氯化钠)溶液洗脱，收集300mM咪唑洗脱的蛋白峰。
实施例5：核酸适配体筛选(一轮)
上海生工合成78个nt长度的随机ssDNA文库，上游为23个nt的引物结合位点，下游为20个nt的引物结合位点，中间为35个nt的随机序列，库容量为435。ssDNA的序列为：
5’-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3’筛选过程中用于PCR扩增的DNA引物分别为：引物P1，引物P2。
(1)TolC蛋白溶于200μlPBS后加入96孔ELISA板中，4℃过夜。
(2)蛋白包被孔用PBS洗涤6次后，加入200μl3％BSA(购自上海生工)，孵育2小时。同时，空白96孔ELISA板中加入200μl3％BSA37℃孵育2小时。
(3)将随机ssDNA文库(首轮用量为800pmol)溶于200μl1×SHCMK，95℃变性5min。立即置于冰上10min，使其迅速降至室温，避免ssDNA复性成双链。
(4)将ssDNA加入PBS洗涤6次的空白ELISA孔中，37℃孵育2小时。
(5)上清转入PBS洗涤6次的蛋白包被孔中，37℃孵育2小时后PBS洗涤6次。
(6)结合了ssDNA的酶标孔用200μl洗脱缓冲液重悬，95℃加热5min，取上清，经过乙醇沉淀DNA，溶于Millipore水中，作为下一轮筛选的模板。
(8)取5μlPCR产物上样于5wt％琼脂糖(购自上海生工)，观察条带位置是否正确。从首轮之后，投入的ssDNA次级库的量逐渐减少，如此反复进行12个循环。
实施例6：核酸适配体克隆
第12轮筛选产物的扩增和纯化：将第12轮筛选得到的ssDNA序列，用引物P1，引物P2进行扩增。100μlPCR扩增后体系加入500pl结合液BB(20mmol/L Hepes(pH7.35)，120mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，1mmol/L CaCl2，1mmol/LMgCl2，1％BSA)，充分混匀。将上一步所得溶液加入吸附柱EC中(吸附柱放入收集管中)，室温放置lmin，12000rpm离心30～60s，倒掉收集管中的废液。加入700pmol漂洗WB(结合液BB+0.05％Tween20)，12000rpm离心30s，弃掉废液。加入500pmol漂洗液WB，12000rpm离心30s，弃掉废液。将吸附柱EC放回空收集管中，12000rpm离心2min。取出吸附柱EC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加20pmol65℃水浴预热的洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm离心lmin。将得到的溶液重新加入吸附柱中，再次离心lmin。
PCR纯化产物的克隆：取1μl扩增产物，与载体PGM-T在T4DNA连接酶的作用下连接，再将其转化到感受态细胞，取适当体积均匀涂布于含有IPTG、x-gal、抗生素(Amp)(它们分别购自于上海生工)的LA平板，倒置培养皿，于37℃培养12-16小时进行“蓝-白斑筛选”。
测序：用接种环挑取筛选平板上的单个白色菌落于含Amp的LB液体培养基，37℃培养过夜。取菌液lml于离心管中，封膜后送上海生工测序。测序结果发现其中有20个核酸适配体序列与大肠杆菌外膜蛋白TolC具有非常强的亲和性，该20个序列分别是：
5’-TGCGTGTTTACGTGTCGATGTCCGGGTACCCTCGG-3’(SEQ ID NO：1)；
5’-CTCTTAGCCATTTTGGTATGCGTATTGCTCTACAG-3’(SEQ ID NO：2)；
5’-ATATATTGCTCTGATCGTACTCTTATTAGGTTAGT-3’(SEQ ID NO：3)；
5’-ATGACGCTGTGGTATTACGTCCTCCTGTATTTGCC-3’(SEQ ID NO：4)；
5’-TCTAAGTGGAATCTACCACCAACGTATTTTTCCTC-3’(SEQ ID NO：5)；
5’-TCCGCCTATTCGGGAGGGAATATTGCTGATTTGTA-3’(SEQ ID NO：6)；
5’-CTCTTCAGTTTTAGACAATGCACGTTTCAGCGGTG-3’(SEQ ID NO：7)；
5’-TCCAGGCTATAATTTCTTGGAACTCCCTCCGTTAG-3’(SEQ ID NO：8)；
5’-CTTTCGAAGGGACTTTAACGGGTATATCCGGTTTT-3’(SEQ ID NO：9)；
5’-ATTACATGCTCTGAGCTTTTTGTATGAGAAATGAT-3’(SEQ ID NO：10)；
5’-CGCTTAGCTTGTGATTTCATCTTTCACACAAGAAT-3’(SEQ ID NO：11)；
5’-CGGAGATCTGTTACACTTCGGTACGTCTTAGTTTG-3’(SEQ ID NO：12)；
5’-CTACCATGTTCAGTGGTTTTGGGATTTTCATACAT-3’(SEQ ID NO：13)；
5’-TGAGATCGGTGAGTTAGTATCTTTTATTCAGTTTT-3’(SEQ ID NO：14)；
5’-GCATTGCGTGACATGGCCTTGCTATCCCTGTTCGT-3’(SEQ ID NO：15)；
5’-TCCTAAAAGCTAGTTATAGTAAATTGAAAACTTAG-3’(SEQ ID NO：16)；
5’-TGGAGCTTAGATTTTGAAGCAGTTACATTTCCCGA-3’(SEQ ID NO：17)；
5’-TACTGCGAGCTTCATTTTTACTTGGTAGTGTTGTG-3’(SEQ ID NO：18)；
5’-CGAACGAATATAATTATGGCGTCCCCGGGGTTTCG-3’(SEQ ID NO：19)；
5’-CTAGTTATGACATTTGTGTCATTTATCCCACGCTG-3’(SEQ ID NO：20)；
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。