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1、(10)申请公布号 CN 102120969 A (43)申请公布日 2011.07.13 CN 102120969 A *CN102120969A* (21)申请号 201010561580.3 (22)申请日 2010.11.26 CGMCC NO.4207 2010.10.12 C12N 1/20(2006.01) A01N 63/02(2006.01) A01P 3/00(2006.01) (71)申请人 云南大学 地址 650091 云南省昆明市翠湖北路 2 号 (72)发明人 莫明和 林碧莲 黄英 周峰 (74)专利代理机构 昆明今威专利代理有限公司 53115 代理人 杨宏珍 (。
2、54) 发明名称 一种广谱性拮抗植物病原真菌的生防微生物 及其应用 (57) 摘要 本发明涉及一种广谱性拮抗植物病原真菌的 生防微生物及其应用， 属于微生物农药技术领域。 本发明的微生物为 Bacillus methylotrophicus Mo-Bm 菌株， 于 2010 年 10 月 12 日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏 号 ： CGMCC No.4207。Mo-Bm 菌株的 16S rRNA 基因 序列 ( 此序列在 GeneBank 数据库中的序列号为 HQ325853) 是鉴别该菌株的主要特征依据 ； Mo-Bm 菌株能耐受0.5-2(V/V)的甲醇， 。
3、是鉴别该菌株 的次要特征依据。本发明的微生物菌体及其代谢 产物， 能与农药常规吸附载体和助剂制成 Mo-Bm 可湿性粉剂生防菌剂。 该菌剂对烟草黑胫病， 十字 花科蔬菜根肿病和三七根腐病的防效在 70以 上。本发明的生防菌剂具有成本低、 防效高、 无残 留、 对人畜安全的特点， 是有机农业种植中防治真 菌病害的高效生物农药。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 CN 102120975 A1/1 页 2 1. 一种广谱性拮抗植物病原真菌的生防微生物， 其特征在于所用的生防微生物为 Baci。
4、llus methylotrophicus Mo-Bm 菌株， 该菌株 2010 年 10 月 12 日保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号 ： CGMCC No.4207。 2. 权利要求 1 所述的广谱性拮抗植物病原真菌的生防微生物， 其特征在于 Mo-Bm 菌株 作为制备防治烟草黑胫病， 十字花科蔬菜根肿病和三七根腐病菌剂的应用。 权 利 要 求 书 CN 102120969 A CN 102120975 A1/3 页 3 一种广谱性拮抗植物病原真菌的生防微生物及其应用 技术领域 ： 0001 本发明涉及一种广谱性拮抗植物病原真菌的生防微生物及其应用， 属微生物农。
5、药 技术领域。 背景技术 ： 0002 植物病原真菌的危害给种植农业带来的危害是无法估量的。 中国发现的烟草真菌 病害28种， 所造成的经济损失占烟草病害的37.8， 其中由Phytophthoranicotianae侵入 引起的烟草黑胫病危害最为严重 ( 祝明亮， 雷丽萍， 2008)。云南作为我国名贵中药材三七 (Panax notoginseng)的主产区， 产量占全国90以上， 2009年三七农业就创收16.9亿元。 Fusarium spp. 等病原菌引起的三七根腐病常年发病率一般在 5 20， 严重的可损失 70以上， 甚至绝收 ( 缪作清等， 2006)。由 Plasmodiop。
6、hora brassicae 危害引起的十字花 科作物根肿病发病率一般在10-30左右(王靖等， 2008)。 目前， 对以上病害的防治仍然以 化学防治为主， 由于都是土传病害， 施用的一般都是高毒、 高残留农药。 近年来， 随着人们对 生活质量的日益重视， 有机农业及其产品迎来了前所未有的发展契机。有机蔬菜已逐步摆 上中高等收入家庭的餐桌 ； 有机烟叶被认为是烟草行业未来的发展方向 ； 三七出口常年面 临的绿色贸易壁垒。这些有机农业种植都迫切需要高效的生物农药。 0003 Bacillus methylotrophicus 是韩国人 2010 年作为新种报道的一种可以代谢甲 醇、 促进植物生。
7、长的细菌(Madhaiyan et al.， 2010)。 该微生物对植物病原真菌的拮抗特性 至今未见公开报道。 0004 参考文献 ： 0005 祝明亮， 雷丽萍 .2008. 烟草微生物学 . 科学技术出版社， 北京， P1-384. 0006 缪作清等， 2006. 三七根腐病病原研究 . 中国农业科学， 39(7) ： 1371-1378. 0007 王靖等， 2008. 油菜根肿病症状、 病原形态及产量损失研究 . 中国油料作物学报， 30(1) ： 112-115. 0008 Madhaiyan M， Poonguzhali S， Kwon SW， Sa TM.2010.Bacil。
8、lus methylotrophicus sp.nov.a novel species of methanol utilizing，plant-growth promoting bacteriumisolated from rice.International Journal of Systematic and EvolutionaryMicrobiology 60 ： 2490-2495. 发明内容 0009 本发明的目的在于提供一种广谱性拮抗植物病原真菌的生防微生物及其应用。 0010 本发明从烟草内生菌中筛选具有工业化生产前景的菌株， 为农业生产提供一种具 较好的土传真菌病害生防微生物。。
9、 0011 本发明具体是这样实现的 ： 0012 本发明人从云南烤烟品种 NC297 叶片内生菌中利用选择性培养基筛选、 改良后获 得Bacillus methylotrophicus Mo-Bm菌株。 Mo-Bm已于2010年10月12日保存于中国微生 说 明 书 CN 102120969 A CN 102120975 A2/3 页 4 物菌种保藏委员会普通微生物中心， 保藏号 ： CGMCC No.4207。 Bacillus methylotrophicus Mo-Bm 在 AMS 培养基 (MgSO4.7H2O ： 1g， CaCl20.2g， EDTA 0.004g， NH4Cl 0。
10、.5g， FeSO4.7H2O 0.02g， MnCl2.H2O 0.01g， ZnSO4.7H2O0.01g， 琼脂18g， 补水至1000ml， pH6.8)上菌落乳白色， 凸起， 边缘规格， 生长缓慢， 28下培养96小时菌落直径0.2-1mm， 最适生长温度为28， 最 适生长 pH 值为 7。利用引物 5 -GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3 ， 5 -AGA GTT TGATCM TGG CTC AG-3 经 PCR 扩展该菌株的 16S rRNA 基因， 获得的序列提交到 GeneBank 公共数据库， 其序列号为 HQ325853， 此序列是鉴定该菌株的主要。
11、特征依据。Mo-Bm 菌株能耐受 0.5-2 (V/V) 的甲醇， 是鉴别该菌株的次要特征依据。 0013 利用 Mo-Bm 菌株制备的生防菌剂对防治烟草黑胫病， 十字花科蔬菜根肿病和三七 根腐病的防效在 70以上。能用于种子处理， 移栽期和成株期。施用时将 Mo-Bm 菌株制备 的生防菌剂施入作物根际周围或兑水灌根。 对病害发生严重地区， 种子处理， 移栽期和成株 期分别施用一次效果最好。 0014 利用 Bacillus methylotrophicus Mo-Bm 菌株制备的生防菌剂具有成本低、 防效 高、 无残留、 对人畜安全的特点， 是有机农业种植中防治真菌病害的高效生物农药。 具体。
12、实施方式 ： 0015 1. 本发明中 Mo-Bm 的培养及菌剂制备 0016 Mo-Bm 菌株试管斜面种子培养 ： 将该菌株的菌体到牛肉膏蛋白胨固体培养基 ( 牛 肉膏 5g， 蛋白胨 10g， NaCl 5g， 琼脂 20g， 水 1000mL， 琼脂 20g， pH 7.2-7.4) 斜面上， 15-40 下培养 1-5 天后获得斜面种子， 适宜的培养条件是 28下培养 2 天。 0017 Mo-Bm 菌株液体种子的液体培养 ： 将斜面种子接种到三角瓶中的牛肉膏蛋白胨液 体培养基(牛肉膏蛋白胨固体培养基不添加琼脂)中， 15-40， 50-350rpm条件下摇床培养 2-7 天。最适培养。
13、条件为 28， 200rpm 条件下培养 3。 0018 Mo-Bm 菌株发酵罐大量培养 ： 将液体种子按 1-5 (V/V) 的比例接入发酵罐中的 PDB( 去皮马铃薯 200g 切碎， 用水煮沸 30 分钟后过滤取滤液， 蔗糖 20g， 补水至 1000ml， pH 自然 ) 培养基中， 在 20-1000 升发酵罐中的培养条件控制在 ： 温度 26-32， 搅拌速度 150-250rpm， 发酵时间 48-96 小时。 0019 Mo-Bm 可湿性菌剂的制备 ： 经发酵罐培养获得的微生物菌体及其代谢无作为原药 与适量的硅藻土、 木钠、 K12、 蔗糖、 海藻酸钠混合后在 65以下烘干或晾。
14、干至水分含量小于 5， 粉碎后制成可湿性粉剂。菌剂需保证 Mo-Bm 的活菌数含量在 1109个 /g 以上。 0020 2. 本发明菌剂对烟草黑胫病的防效试验 0021 烟草黑胫病病原菌 (Phytophthora nicotianae) 的培养 ： 在 PDA 培养基 ( 在 PDB 培养基的基础上添加 20g 琼脂 ) 固体平板上接种分离自田间的烟草黑胫病病原菌， 28下 培养5天后挑起新鲜菌丝体接种于PDB液体培养基中， 28下， 200rpm下摇床培养5天后备 用。 0022 供试药剂 ： a. 活菌数含量为 5109个 /g 的 Mo-Bm 可湿性菌剂 ； b.58甲霜灵锰 锌。 。
15、0023 防效试验方法 ： 烤烟常规漂浮育苗时， 50g Mo-Bm 可湿性菌剂用 300ml 水稀释后与 1kg 育基质混匀 ； 阳性对照处理为 58甲霜灵锰锌可湿性粉剂 ( 西安鼎盛生物化工有限公 说 明 书 CN 102120969 A CN 102120975 A3/3 页 5 司 )1g 用 300ml 水稀释后与 1kg 育基质混匀 ； 空白对照为 300ml 水与 1kg 育基质混匀。待 烟苗长至 5-6 片叶子时， 在直径为 15cm 的、 装有 500g 土壤 ( 沙土腐殖土 1 1) 的每 一花钵移栽一株烟苗， 在烟根接种烟草黑胫病病原菌5ml， 每处理三个重复， 每重复5。
16、盆。 肥 水管理按常规方法进行， 在室温温室内生长 90 天后统计各处理的烟草黑胫病病的发病率， 按以下公式计算发病率和防效 ： 0024 发病率发病株数 / 调查株数 100 0025 防效 ( ) 空白对照的发病率 - 药剂处理的发病率 0026 试验结果表明 ： 空白对照的发病率为 87.5 ； 甲霜灵锰锌可湿性菌剂处理的发病 率为 10.8， 防效为 76.7； Mo-Bm 可湿性菌剂处理的发病率为 11.3， 防效为 76.2， 与 化学农药 58甲霜灵锰锌可湿性菌剂的防治效果相当。 0027 3.Mo-Bm 菌剂防治白菜根肿病的田间试验 0028 由于白菜根肿病病原菌不能人工培养，。
17、 本试验在重病田块进行。在白菜种子漂浮 育苗时， 将菌体含量为 5109个 /g 的 Mo-Bm 可湿性菌剂按 1 300(W/W) 的比例与育苗基 质混合， 其余管理按漂浮育苗的常规操作进行。移栽时在每株苗的根部周围撒施 3 克菌剂， 移栽后 1 个月， 在每株作物地上部再撒施 3 克菌剂， 结合浇水将菌剂冲入土壤中。对照药剂 为 75白菌清可湿性粉剂 ( 淄博金苹果生化科技有限公司 )， 用量与和施用方法同 Mo-Bm 可湿性菌剂。空白对照不施用任何药剂， 每处理三个重复， 每重复 50 株苗。白菜移栽后的 肥水管理按常规进行， 移栽 3 个月后统计各处理的发病率， 按以下公式计算发病率和。
18、防效 ： 0029 发病率发病株数 / 调查株数 100 0030 防效 ( ) 空白对照的发病率 - 药剂处理的发病率 0031 试验结果表明 ： 空白对照的发病率为 97.3 ； 白菌清处理的发病率为 5.6， 防效 为 91.7； Mo-Bm 可湿性菌剂处理的发病率为 9.5， 防效为 87.8， 略低于化学农药 75 白菌清可湿性粉剂。 0032 4.Mo-Bm 菌剂防治防治三七根腐病的田间试验 0033 本试验在云南省文山州三七研究院的大棚试验地进行， 在试验地连作三七 25 年， 三七根腐病的发病率在90以上。 在三七育苗时， 将100g菌体含量为5109个/g的Mo-Bm 可湿性。
19、粉剂用1L水溶化， 加入1kg三七种子混匀， 使菌剂粘附在种子上， 然后按常规育种方 法管理。移栽时每亩三七苗的用 10kg 菌剂兑水 200kg 均匀灌根， 移栽一年后用相同剂量的 菌剂和方式再施用一次。对照药剂为 50的农利灵可湿性粉剂 ( 德国巴斯夫公司 )， 用量 为每亩 2kg， 施用方法同 Mo-Bm 粉剂。空白对照不施用任何药剂， 每处理三个重复， 每重复 100 株苗。三七移栽后的肥水管理按常规进行， 移栽两年后统计各处理的发病率， 按以下公 式计算发病率和防效 ： 0034 发病率发病株数 / 调查株数 100 0035 防效 ( ) 空白对照的发病率 - 药剂处理的发病率 0036 试验结果表明 ： 空白对照的发病率为 100 ； 农利灵处理的发病率为 25.6， 防效 为 74.4； Mo-Bm7 可湿性粉剂处理的发病率为 21.5， 防效为 78.5， 与 50的农利灵可 湿性粉剂防效相当。 说 明 书 CN 102120969 A 。