技术领域
本发明涉及一种基因工程菌及其表达方法和用途，具体地说是一种表达耐热型右旋糖苷蔗糖酶的基因工程菌及其构建方法和用途。
背景技术
右旋糖苷(Dextran)，又名葡聚糖，是蔗糖经肠膜状明串珠菌发酵后生成的高分子葡萄糖聚合物，主要由葡萄糖基α(1-6)苷键连接而成。因其具有安全、无毒、生物相容性好等多种优点，已被广泛应用于医药、食品、色谱分析等多个领域。右旋糖酐及其衍生物被广泛应用于医药、食品、化工等众多行业，市场需求巨大(全球每年的需求近几百亿美金)。由明串珠菌发酵的右旋糖酐70是目前公认的优良血浆替代品，由面包酵母发酵的右旋糖酐可作为食品添加剂改善食品的口感。1941年，Hehre E.J.首次报道出以蔗糖为底物无细胞合成右旋糖酐，在那之后不久，合成这一反应的酶被命名为右旋糖酐蔗糖酶。
右旋糖酐蔗糖酶(Dextransucase,EC2.4.5.1)是一种分泌型葡萄糖基转移酶，属于糖苷水解酶70家族(GH70)，是葡聚糖蔗糖酶领域中研究较早较热门的一类酶。可以将蔗糖分子中的D-葡萄糖基转移到受体分子上，催化程度的差异性可以合成右旋糖酐和低聚糖，同时伴有果糖的生成。通过右旋糖苷蔗糖酶的催化来生产右旋糖酐。右旋糖酐蔗糖酶的产生菌多为肠膜状明串珠菌和链球菌，根据碳水活性酶数据库Carbohydrate-ActiveEnzymes Database(CAZy；http://www.cazy.org)分类统计，到2017年为止GH70家族已发现了343种菌，其中94株右旋糖酐蔗糖酶表达菌株为肠膜状明串珠菌，193株为链球菌属，33株为乳杆菌，22株为魏斯氏菌，一株为酒球菌。目前右旋糖酐蔗糖酶合成的葡聚糖及其衍生物在食品、健康医疗、材料等领域都有了广泛的应用。
现有的右旋糖酐蔗糖酶热稳定性较差。其较低的温度适应性及在逆境下活性降低的性质低限制了它在食品、医药行业、工业生产中的应用。通常高稳定性被认为是一个经济优势可以降低酶的消耗和补偿速率。此外，更稳定的酶可能对反应速率、工艺温度有积极的影响。获取活性高、热稳定性高的右旋糖酐蔗糖酶，对于提高产品品质、获得很好的工业应用潜力、实现该酶的诸多应用具有重要的意义。因此，利用分子生物学技术获得新型的耐热、高稳定性且酶活高的的右旋糖酐蔗糖酶酶源是目前研究热点之一。目前，对于不同来源菌的葡聚糖蔗糖酶在国内外均有研究，在定点突变改造及引入二硫键提高其某些性质获得新型的葡聚糖蔗糖酶均有部分文献报道，关于该酶的分子改造及耐热机制的研究也越来越受到关注。
蛋白质工程已经成为一个重要的工具来改善右旋糖酐蔗糖酶的热稳定性使其更适用于工业生产。本发明的目标就是通过对本实验室现有的原始右旋糖酐蔗糖酶进行定点突变的蛋白质分子改造，筛选得到一种产酶活力较高、耐热性及稳定性较好的重组右旋糖酐蔗糖酶菌株，为其在食品工业及医药工业的潜在应用做准备。
通过使用基因工程改造手段提高右旋糖酐蔗糖酶的热稳定性将成为以后国内外研究热点和解决问题的关键。
发明内容
本发明旨在提供一种表达耐热型右旋糖苷蔗糖酶的基因工程菌及其构建方法和用途，为右旋糖酐的工业生产提供更节约的生产条件。本发明所要解决的技术问题是通过基因工程的手段构建能耐热、酶活高的表达右旋糖苷蔗糖酶(Dextransμcrase)的基因工程菌株，并通过诱导制备该酶用于较高温右旋糖酐的生产。
本发明表达耐热型右旋糖苷蔗糖酶的基因工程菌，具有耐高温表达右旋糖苷蔗糖酶且酶活较高的特性。
本发明基因工程菌由含pET28a(+)/dex-YG基因的重组表达质粒经定点突变得到双突变体P473S/P856S后在宿主菌中转化而得，并经过卡那霉素抗性筛选和测序验证。所述宿主菌为E.ColiBL21(DE3)，购自全式金生物技术有限公司。所述重组表达质粒是用dex-YG基因插入到载体pET28a(+)中构建而成，载体pET28a(+)购自Novagen公司。所述dex-YG基因是以肠膜状明串珠菌基因组为模板，运用PCR扩增技术克隆得到的。发明人已成功完成了dex-YG基因的克隆、重组表达质粒的构建、双位点的定点突变和测序工作。
本发明表达耐热型右旋糖苷蔗糖酶的基因工程菌，是将由克隆得到的dex-YG基因插入到表达载体pET28a(+)中得到的重组表达质粒pET28a(+)/dex-YG作为模板，并经过473位和856位双位点的定点突变，筛选后得到耐热、酶活高的双突变体P473S/P856S，于宿主菌E.ColiBL21(DE3)中转化得到的重组工程菌dex-YG-thMU01。
本发明涉及保藏菌株为表达耐热型右旋糖苷蔗糖酶的基因工程菌dex-YG-thMU01，保藏信息如下：
分类命名：耐热型重组右旋糖苷蔗糖酶大肠杆菌BL21(DE3)
保藏日期：2016年5月12日
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏编号：CGMCC No.12438。
保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明表达耐热型右旋糖苷蔗糖酶的基因工程菌的构建方法，包括引物设计、构建重组表达质粒、基因工程定点突变和宿主菌转化。
所述引物设计是根据克隆得到的dex-YG基因序列及载体pET28a(+)的序列特征，借助PrimerPremier5.0软件设计引物如下:
正向引物：5’CGCGGATCCATGCCATTTACAGAAAAAGT 3’，(包含一个BamHⅠ位点)；
反向引物：5’CCCAAGCTTTTATGCTGACACAGCATTT 3’，(包含一个HindⅢ位点)。
所述构建重组表达质粒是以克隆得到的dex-YG基因为模板，利用PCR扩增技术，得到含BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的克隆产品，将所述克隆产品用BamHⅠ和HindⅢ双酶切，酶切产品连接到载体pET28a(+)的双酶切位点上，得到重组表达质粒pET28a(+)/dex-YG。
所述基因工程定点突变是以重组表达质粒pET28a(+)/dex-YG为模板，先将473位的脯氨酸突变为丝氨酸，得到单突变体P473S，并提取其质粒作为模板，再将856位的脯氨酸突变为丝氨酸，得到双突变体P473S/P856S质粒，双突变体的引物设计如下：
P473S正向引物：5’AACAGTCCACTGACATCTGATGCTA 3’
P473S反向引物：5’ATGTCAGTGGACTGTTGACATAAGT 3’；
P856S正向引物：5’ACTGATGAAAATGCATCTGTGGCGTAC 3’
P856S反向引物：5’ATGCATTTTCATCAGTATCATAATA 3’。
所述宿主菌转化是将双突变体P473S/P856S质粒转化到E.ColiBL21(DE3)感受态细胞中，经过卡那霉素抗性筛选和酶切验证后，获得表达耐热型右旋糖苷蔗糖酶的基因工程菌dex-YG-thMU01。
本发明表达耐热型右旋糖苷蔗糖酶的基因工程菌的用途，是由所述基因工程菌发酵制备得到的耐热型右旋糖苷蔗糖酶在以蔗糖为底物制备右旋糖酐中的应用。
由本发明表达耐热型右旋糖苷蔗糖酶的基因工程菌制备耐热型右旋糖苷蔗糖酶的方法，包括接种、培养、诱导、破碎和分离各单元过程，包括如下步骤：
将基因工程菌dex-YG-thMU01接种到含卡那霉素50μg/mL的50mL LB培养基中，在转速250r/min、37℃下培养16-19h，吸取2mL培养菌液加入至200mL A培养基中，转速250r/min、37℃下培养至菌浓度OD600达到0.20-0.25时加入浓度为1mmol/mL的IPTG诱导剂，25-30℃下发酵诱导4-5h，离心分离得到菌体，向菌体中加入pH值为5.2-5.6的乙酸-乙酸钠缓冲液，超声破碎，离心分离，上清液即为粗酶液，酶活达300-420U/mL。所述A培养基中含有5g/L甘油、5g/L葡萄糖、0.1mmol/L MgSO4·H2O、10g/L蛋白胨、10g/L硝酸钾、17.105g/L Na2HPO4·12H2O、3g/L KH2PO4以及1g/L NH4Cl。
酶活测定方法采用DNS还原糖法。具体方法为：取200μL适当稀释的酶液，加入0.02mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.4)2.8mL，再加入蔗糖0.3g，振荡，于25℃水浴1h，吸取500μL反应液加入对应试管中，于沸水中煮沸5min，立即冷却后加入5mL水，同时以失活的酶液为对照，在520nm波长下测定吸光度(OD)，在25℃下，1mL底物反应液中每小时催化底物蔗糖产生0.1mg果糖所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。
应用上述制备的右旋糖苷蔗糖酶粗酶液水解合成右旋糖酐，包括如下步骤：
酶反应体系配制：蔗糖20g，缓冲液160ml(pH5.4，5mmol/L的乙酸-乙酸钙)。
按1.5U/ml的比例加入右旋糖酐蔗糖酶粗酶液，将上述混合液在30℃下搅拌反应24-28小时，将催化后的反应液进行过滤、微滤、醇沉洗涤、真空干燥即可得到右旋糖酐。
本发明构建的表达耐热型右旋糖苷蔗糖酶的基因工程菌dex-YG-thMU01，具有耐热且酶活高的特性，为其更好的应用于右旋糖酐的工业生产提供了一定的基础，耐热且酶活高的特性使其可以更好的节约生产资本。
附图说明
图1为本发明制备的右旋糖苷蔗糖酶合成右旋糖酐催化原理示意图。
图2为本发明制备的右旋糖苷蔗糖酶与的最适反应温度。从图2中可以看出，当反应温度为50℃时，野生酶已经失活，而本发明制备的右旋糖苷蔗糖酶依然有30％的酶活力，说明该酶较野生酶在较高温度下的热稳定性增强。
具体实施方式
下面将结合具体的实施例对本发明作进一步详细的说明：
实施例1：重组表达质粒pET28a(+)/dex-YG的构建
根据克隆得到的右旋糖苷蔗糖酶基因(dexYG)序列，按照表达载体pET28a(+)的序列特征,借助Primer Premier 5.0软件设计引物如下：
正向引物：5’CGCGGATCCATGCCATTTACAGAAAAAGT 3’，(包含一个BamHⅠ位点)；
反向引物：5’CCCAAGCTTTTATGCTGACACAGCATTT3’，(包含一个HindⅢ位点)。
以已经克隆得到的右旋糖苷蔗糖酶基因(dexYG)为模板，利用PCR扩增技术，得到含BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的基因克隆产品，PCR产品回收程序如下：
1、切取琼脂糖凝胶中的目的DNA条带，放入干净的离心管中称重，如凝胶重100mg，可视为100μL(100mg≈100μL)。
2、加入三倍体积溶液GSB，于55℃水浴融胶10min，间隔(2-3min)混合，确保胶块完全融化，当胶完全融化后，观察溶液的颜色，此时溶液应呈现为黄色。
3、待融化的融胶溶液降至室温(高温时离心柱结合DNA的能力弱)，加入离心柱中静置1min，10000g离心1min，弃流出液。
4、加入650μL溶液WB，10000g离心1min，弃流出液。
5、10000g离心1-2min，去除残留的WB。
6、将离心柱置于于一干净的离心管中，开盖静置1min，使残留的乙醇挥发干净，12000×g离心lmin，在柱的中央加入30～50μL事先预热至60～70℃的EB，室温静置1min。
7、10000g离心1min，洗脱DNA。此时，洗脱液含有BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点的基因克隆产品，可直接用于酶切反应。
构建重组表达质粒pET28a(+)/dex-YG：将上述洗脱液(克隆产品)用BamHⅠ和HindⅢ酶切，酶切产品连接到pET28a(+)的双酶切位点上，得到重组表达质粒pET28a(+)/dex-YG。表达载体与酶切产物连接体系：表达载体pET28a(+)3μL、目的基因2μL、10×T4DNA连接酶1μL、Bμffer 2.5μL，补ddH2O至25μL，16℃连接过夜。
实施例2：表达耐热型右旋糖苷蔗糖酶的基因工程菌dex-YG-thMU01的构建
将重组表达质粒pET28a(+)/dex-YG转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，经卡那霉素抗性筛选和酶切验证后，获得右旋糖苷蔗糖酶工程菌E.Coli BL21(DE3)/pET28a(+)/dex-YG。提取其质粒作为模板，并对重组质粒进行定点突变，先将473位的脯氨酸突变为丝氨酸，得到单突变体P473S，并提取其质粒作为模板，再将856位的脯氨酸突变为丝氨酸，得到双突变体P473S/P856S，将其转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，经卡那霉素抗性筛选后，得到表达耐热型右旋糖苷蔗糖酶的基因工程菌dex-YG-thMU01，双突变体的引物设计如下：
P473S正向引物：5’AACAGTCCACTGACATCTGATGCTA 3’；
P473S反向引物：5’ATGTCAGTGGACTGTTGACATAAGT 3’；
P856S正向引物：5’ACTGATGAAAATGCATCTGTGGCGTAC 3’；
P856S反向引物：5’ATGCATTTTCATCAGTATCATAATA 3’；
大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞购自于北京全式金生物有限公司。
大肠杆菌质粒转化流程如下:
1、把感受态置于冰中融化。
2、把100μL感受态细胞移至灭菌处理的1.5mL离心管中。
3、加入20μL胶回收的PCR产物(即实施例1步骤7得到的胶回收产物，胶回收产物含有酶切位点)，用枪头轻轻混匀。
4、冰浴30min。
5、42℃水浴热处理90sec。(准确计时，此时不能摇动转化管)
6、立即置于冰上2～3min。
7、加入37℃预温的LB液体培养基500μL混匀。
8、37℃、200r/min震荡培养lh。
9、将转化的细胞涂布于含有50μg/mL卡那霉素的琼脂平板表面，37℃恒温箱培养过夜(16-19小时)。挑阳性菌落，酶切验证后获得基因工程菌E.ColiBL21(DE3)/pET28a(+)/dex-YG或dex-YG-thMU01。
实施例3：耐热型重组工程菌dex-YG-thMU01右旋糖苷蔗糖酶的表达
将重组工程菌株dex-YG-thMU01接种到接种到含50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中37℃培养16-18小时，转接至液体A培养基中37℃培养，当稀释10倍后的OD600达到0.25时加入1mmol/mL IPTG进行诱导，每1h取样1次，共取样5次，对所取样品做SDS-PAGE电泳分析。其中第4-5h酶量较多，所表达出的右旋糖配蔗糖酶蛋白分子量与预测值一致(约170kDa)。
实施例4：耐热型重组工程菌dex-YG-thMU01产酶发酵
将基因工程菌dex-YG-thMU01接种到含有40～60μg/mL卡那霉素的LB培养基中，转速250r/min，35-40℃培养，培养16-19小时，从上述种子培养液中吸取2mL菌液加入至A培养基(优化后培养基，包括甘油、葡萄糖、蛋白胨、硝酸钾等)中，放置于37℃下，240-260r/min(回转式)摇床培养。当富集培养的菌液用蒸馏水稀释10倍后的OD600在0.25时(约3.5h之后)即可加入500μL IPTG开始诱导产酶，在25℃，250-260r/min(回转式)摇床诱导。将诱导发酵后的菌悬液在0℃下，6000r/min离心12-15min，一支离心管对应一瓶菌悬液，然后加入适量的蒸馏水振荡清洗，再次离心。向每支离心管中加入20mL的乙酸-乙酸钙缓冲液震荡摇匀，外加冰水浴，超声破碎15min，离心分离，上清液即为粗酶液，酶活300-420U/mL。
实施例5：右旋糖酐产品转化实验
利用上述右旋糖酐蔗糖酶粗酶液水解合成右旋糖酐，具体步骤为：
1、酶反应体系配制：蔗糖20g，缓冲液160mL(pH5.4，5mmol/L的乙酸-乙酸钙缓冲液)。
2、按1.5U/ml的比例加入右旋糖酐蔗糖酶粗酶液。
3、将上述混合液在30℃下搅拌反应24-28小时，催化后的反应液进行过滤、微滤、醇沉洗涤、真空干燥即可得到右旋糖酐。