技术领域
本发明涉及强优势杂交棉优异亲本检测领域，具体而言，涉及用于辅助选择棉花优异亲本遗传背景的SNP标记及其检测方法。
背景技术
杂种优势是自然界普遍存在的一种现象。自Shull首次提出“杂种优势”的概念以来，各国科学家先后对作物杂种优势进行了研究和探讨。现在，杂种优势已在许多作物上得到了广泛利用，杂种优势利用是作物遗传育种中大幅度提高产量的核心技术之一。
棉花是一种意义重大的经济作物。实践证明，持续创制并推广强优势棉花杂交种是大幅度提高棉花产量、改善纤维品质和增强棉花品种适应性的主要途径之一。强优势杂交棉新品种育成的关键是培育出配合力高、综合性状好的优异亲本。但是，近年来由于育种技术和方法创新不足等原因，优异亲本培育和改良越来越难，导致杂种优势表现强的品种越来越少。研究发现，优异亲本具有优良的遗传背景，能够通过杂交和回交等技术进行持续改良，可以衍生出一系列的新优异亲本，进而高效率的培育出一系列强优势杂交棉品种。但是在改良过程中，由于目前只能利用繁琐的田间性状观察鉴定，选择优异亲本的遗传背景的效率低、育种年限长、费时费工，而且性状受环境影响较大，容易造成判断错误，从而导致培育失败。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供用于辅助选择棉花优异亲本遗传背景的SNP标记，该标记通过高通量测序分析得到，为稳定有效地鉴别棉花优异亲本提供基础。
本发明的第二目的在于提供用于辅助选择棉花优异亲本遗传背景的SNP标记的引物对，该引物对通过高通量测序分析、设计后筛选得到，特异性强，能稳定有效地鉴别棉花优异亲本。
本发明的第三目的在于提供用于辅助选择棉花优异亲本遗传背景的SNP标记的试剂盒，该试剂盒为棉花优异亲本的鉴定提供便利。
本发明的第四目的在于提供用于辅助选择棉花优异亲本遗传背景的SNP标记的检测方法，该方法通过分子水平进行鉴定，方法简便快捷，鉴定结果稳定可靠。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
用于辅助选择棉花优异亲本遗传背景的SNP标记，所述SNP标记为以下中的任一种或多种：A06染色体上的1824659bp位置的GG、A12染色体上的81174157bp位置的AA、D03染色体上的35924124bp位置的TT、D05染色体上的30704984bp位置的TT、D11染色体上的4947923bp位置的CC。
本发明提供的用于辅助选择棉花优异亲本遗传背景的SNP标记，通过高通量测序分析得到，为稳定有效地辅助鉴别棉花优异亲本提供基础。
需要说明的是，SNP指单碱基突变，指一个位点，而本发明中的GG、AA、TT、CC均表示两条同源染色体的某一位点，表示该位点是纯合位点；即本发明中的这五个位点均为纯合位点。
本发明还提供了用于辅助选择棉花优异亲本遗传背景的SNP标记的引物对，包括以下引物对中的任一种或多种；
Gh_A06G0169_SNP引物对的上下游核酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，Gh_A12G1857_SNP引物对的上下游核酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，Gh_D03G1074_SNP引物对的上下游核酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，Gh_D05G2790_SNP引物对的上下游核酸序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，Gh_D11G0580_SNP引物对的上下游核酸序列如SEQ ID No.9和SEQ IDNo.10所示。
本发明通过分析强优势杂交棉中棉所63等优异亲本选育系谱中已经衍生的多个优异亲本材料基因组重测序数据，开发了用于辅助选择中棉所63等优异亲本遗传背景的SNP标记，可以大幅度提高遗传背景的选择效率和准确性，显著缩短优异亲本的培育年限。
本发明提供的用于辅助选择棉花优异亲本遗传背景的SNP标记的引物对，可以为上述引物对中的任意一种，也可以为任意两种、任意三种、任意四种，或者为全部，当然，鉴定的时候采用的引物越多，则鉴定结果越为确切。
进一步地，所述棉花优异亲本包括鄂抗棉9号、中309、9053、中9018、1638。
本发明还提供了用于辅助选择棉花优异亲本遗传背景的SNP标记的试剂盒，含有上述的引物对。即该试剂盒中，可以含有上述引物对中的任意一种，也可以为任意两种、任意三种、任意四种，或者为全部。
该试剂盒为用于辅助选择棉花优异亲本遗传背景的SNP标记的进行提供便利。
本发明还提供了用于辅助选择棉花优异亲本遗传背景的SNP标记的检测方法，采用上述的引物对，对待检测棉花的基因组进行分子水平的检测。
该处的上述的引物对为上述引物对中的任一种或几种。
进一步地，所述分子水平的检测为：先将待检测品种的基因组进行PCR扩增，然后进行HRM检测。
进一步地，所述PCR扩增所用的退火温度为59±1℃。该退火温度，扩增得到的产物特异性强，杂带少。PCR扩增程序采用常规的程序即可。
如PCR扩增程序为：94-95℃预变性3-5分钟；94℃变性30秒；60℃退火30秒；72℃延伸30秒；35-45个循环；72℃延伸5-10分钟；产物4℃保存。
进一步地，所述PCR扩增所用的PCR反应体系为10-25μL，优选为20μl。如本发明PCR扩增所用的PCR反应体系可以为10μL、15μL、20μL、25μL等等。
如PCR反应体系为20μL，具体成分如下：
10μl Master Mix，5μl 10μg/mL DNA，上下游引物各0.5μl，1.6-2.4μlMgCl2，加PCR-grade H2O，补足到20μl。
其他反应体系的体积，各成分进行相应的扩大或缩小或按照常规的体系添加即可。
进一步地，所述PCR反应体系中的模板DNA的含量不小于5ng,优选为5-30ng。如本发明PCR反应体系中的模板DNA的含量可以为5ng、10ng、20ng、25ng、30ng等等。
进一步地，所述PCR扩增的循环数为30-45，优选为35-45。如本发明PCR扩增的循环数可以为30、35、38、40、42、45等等。
通过一定的PCR扩增放大样品DNA，便于后续的高分辨率熔解试验。
进一步地，待检测棉花的基因组所用的提取材料为待检测棉花的种仁。是将该棉花材料的种子去壳得到。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的用于辅助选择棉花优异亲本遗传背景的SNP标记，通过高通量测序分析得到，为稳定有效地鉴别棉花优异亲本提供基础。
(2)本发明提供的用于辅助选择棉花优异亲本遗传背景的SNP标记的引物对，通过高通量测序分析、设计后筛选得到，特异性强，能稳定有效地鉴别棉花优异亲本。
(3)本发明提供的用于辅助选择棉花优异亲本遗传背景的SNP标记的试剂盒，为棉花优异亲本的鉴定提供便利。
(4)本发明提供的用于辅助选择棉花优异亲本遗传背景的SNP标记的检测方法，该方法通过分子水平进行鉴定，方法简便快捷，鉴定结果稳定可靠，大幅度提高遗传背景的选择效率和准确性，显著缩短优异亲本的培育年限。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例1中提供的优异亲本的选育系谱图；
图2为本发明实施例2中提供的5个优异亲本测序得到的原始数据散点图；
图3为本发明实施例2中提供的5个优异亲本测序得到的有效数据散点图；
图4为本发明实施例2中提供的5个优异亲本测序数据比对到参考基因组上的比率散点图；
图5为本发明实施例2中提供的5个优异亲本测序数据比对到参考基因组上的覆盖深度散点图；
图6为本发明实施例2中提供的5个优异亲本中检测出的SNP位点比例饼形图；
图7为本发明实施例3中提供的5个优异亲本与TM-1以Gh_A06G0169_SNP引物对进行的HRM曲线图；
图8为本发明实施例3中提供的5个优异亲本与TM-1以Gh_A12G1857_SNP引物对进行的HRM曲线图；
图9为本发明实施例3中提供的5个优异亲本与TM-1以Gh_D03G1074_SNP引物对进行的HRM曲线图；
图10为本发明实施例3中提供的5个优异亲本与TM-1以Gh_D05G2790_SNP引物对进行的HRM曲线图；
图11为本发明实施例3中提供的5个优异亲本与TM-1以Gh_D11G0580_SNP引物对进行的HRM曲线图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
中棉所63等系列强优势杂交棉品种的选育系谱
鄂抗棉9号(原代号：荆55173)，来源于【鄂荆1号×(中7263+MO-3)】，于1999和2001年先后通过湖北和湖南两省审定，2001年通过国家审定(长江流域棉区)，在长江流域棉区表现高产稳产(结铃性强且均匀、衣分高)、优质、多抗(抗枯萎病、耐黄萎病、抗棉蚜等)。以鄂抗棉9号为基础育种材料，利用系统选育或杂交育种等方法，建立了优异亲本选育系谱，持续创制了中309、9053、中9018和1638等一系列优异亲本，对铃重、铃数、衣分和子指等产量相关性状分别进行了不同程度的改良，并且继承了鄂抗棉9号的遗传背景。进一步通过配置杂交组合，这些优异亲本分别作为母本，培育出中棉所62、中棉所63、中棉所65、中棉所66和中棉所71等系列强优势杂交棉品种，已经分别通过国家或省级审定。具体的选育系谱如图1所示。
实施例2
中棉所63等系列强优势杂交棉品种遗传背景评价
1、优异亲本的基因组重测序
筛选出鄂抗棉9号、中309、9053、中9018和1638等同一系谱来源的5个优异亲本，在光照培养箱中种植棉花材料，取棉苗幼嫩叶片，提取基因组DNA，利用Covaris超声波DNA破碎仪随机打断成350bp片段，采用TruSeq Library Construction Kit试剂盒构建测序DNA文库，通过IlluminaHiSeq 4000测序平台进行双末端各150bp的测序。9053(中棉所63母本)计划产出150G数据(测序覆盖基因组深度为60×)，其它材料各自计划产出75G数据(测序覆盖基因组深度为30×)。最终，9053(中棉所63母本)获得180.25G原始数据(Raw data)，如图2所示；去除带接头和低质量的数据后，得到179.58G的有效数据(Clean data)；其它材料获得75.11～94.25G原始数据，如图2所示；去除带接头和低质量的数据后，得到74.93～93.92G的有效数据，具体结果如图3所示。
以已经发布的陆地棉遗传标准系(TM-1)的基因组序列为参考基因组，利用BWA软件将测序获得数据(Clean data)比对到参考基因组上，结果表明5个材料测序获得数据比对到基因组上的比率均超过99％(图4)，9053(中棉所63母本)基因组覆盖深度达到59.9倍，其它材料最低也达到30倍以上(图5)，说明基因组重测序数据已经基本上覆盖材料的全基因组，而且覆盖倍数比较高，能够进行全基因组遗传背景的评价。
2、优异亲本的遗传背景评价
以TM-1为参考基因组，利用SAMtools软件在5个优异亲本中共检测出1,395,011个单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphic,SNP)位点。其中，816,096个在5个优异亲本中具有多态性，578,915个在5个优异亲本之间不具有多态性，占总检测SNP位点数的大约41％(图6)，说明5个优异亲本具有相似的遗传背景。
实施例3
基于HRM技术开发应用于优异亲本遗传背景选择的SNP标记
高分辨率熔解曲线(High Resolution Melting,HRM)技术是近几年兴起的检测单核苷酸多态性的工具。它通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)产物结合的情况，来判断是否存在SNP。荧光染料不与单链DNA起反应，但是可与双链DNA结合发生荧光。在PCR过程中，随着双链DNA浓度的升高，荧光不断增强，而在高分辨率熔解过程中随着温度升高，DNA从双链解旋为单链，荧光染料不断被释放从而荧光强度减弱。由于熔解过程中不同碱基稳定性不同，故解链的速度不同，所以根据荧光强度的变化可有效的区分不同的SNP位点。
1、DNA提取
取鄂抗棉9号、中309、9053、中9018和1638等5个优异亲本以及TM-1的种子，采用SDS法(匡猛等,2010)提取基因组DNA，具体提取步骤如下所述：
(1)剥去棉种种皮外壳，并尽量保证种仁的完整性。
(2)置于放入钢珠的2mL离心管中，在组织研磨仪上粉碎。
(3)加入800μL SDS提取液(组成成分:1％SDS,0.01mol/L EDTA,0.705mol/L NaCl,0.05mol/L Tris,0.5％山梨醇,1％PVP,1％β-巯基乙醇)，漩涡充分后，65℃水浴30min，间隔10min左右轻摇一次。
(4)加入等体积800μL酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，混匀至不分层，12000r/min离心10min。
(5)取上清，加入1μL RNase A(10mg/mL)，37℃水浴30min。
(6)重复抽提一次后离心取上清，加入0.7倍体积异丙醇，缓慢混匀至DNA成团析出，室温静置30min。
(7)70％乙醇洗涤DNA沉淀2次，无水乙醇洗涤1次。
(8)倒置晾干，加入200μL ddH2O充分溶解DNA，备用。
2、HRM引物的设计
根据测序分析的结果，随机挑选出20个测序深度较高，而且在基因上的SNP位点(表1)，利用primer3.0软件设计引物(表2)。
表1挑选的20个SNP位点的信息
表2设计的引物
3、多态性验证
HRM试验采用Light 480High Resolution Melting Master试剂盒，首先在存在Light 480高分辨率熔解染料的情况下通过实时PCR放大样品DNA。DNA扩增后，立即进行高分辨率熔解试验，最后用Light 480基因扫描软件进行分析以确定序列变异。所有的试验均在Light 480分析仪上进行，采用20μl PCR反应体系：10μl Master Mix，5μl 10μg/mL DNA，上下游引物各0.5μl，1.6-2.4μlMgCl2，加PCR-grade H2O补足到20μl。PCR过程中退火温度设置在60℃，其它参数设置采用HRM默认参数。
具体结果如图7-图11所示。
本发明根据经验随机选取了20个测序深度较高，且在这些基因上的SNP位点设计了引物，进一步以鄂抗棉9号、中309、9053、中9018和1638等5个优异亲本以及TM-1作为材料，通过HRM技术检测这20个SNP位点鉴定棉花优异亲本遗传背景的效率，结果表明5个引物能够准确区分优异亲本和TM-1，而且优异亲本聚为一类，所以这5个引物可以用于辅助选择优异亲本的遗传背景。
实施例4
分别对待检测鄂抗棉9号、中309、9053、中9018和1638的杂交后代各50个棉株的棉花籽，采用实施例3中的DNA提取方法提取待测样本的基因组。
分别采用Gh_A06G0169_SNP引物对、Gh_A12G1857_SNP引物对、Gh_D03G1074_SNP引物对、Gh_D05G2790_SNP引物对、Gh_D11G0580_SNP引物对与实施例3相同的方式进行HRM检测，得到的结果如下：
鄂抗棉9号的杂交后代：20个与TM-1无明显差别，30个为优异亲本；
中309的杂交后代：20个与TM-1无明显差别，30个为优异亲本；
9053的杂交后代：19个与TM-1无明显差别，31个为优异亲本；
中9018的杂交后代：25个与TM-1无明显差别，25个为优异亲本；
1638的杂交后代：28个与TM-1无明显差别，22个为优异亲本。
每个材料的杂交后代各随机选择5个非优异亲本和5个优异亲本进行田间性状观察鉴定，结果与上述检测的结果相符。
本发明提供的鉴定棉花优异亲本的引物对，通过HRM检测，如果结果与优异亲本聚为一类，则待测样品具有强优势杂交棉优异亲本的遗传背景，可以继续培育，这种方法大幅度提高遗传背景的选择效率和准确性，显著缩短优异亲本的培育年限。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
<110> 中国农业科学院棉花研究所
<120> 用于辅助选择棉花优异亲本遗传背景的SNP标记及其检测方法
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
catgaatata tctgcctcct caggac 26
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
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<400> 2
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<210> 7
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<210> 8
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<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
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<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
tcgtcctctt ttcttatttt gtgtcg 26