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1、(10)申请公布号 CN 102585802 A (43)申请公布日 2012.07.18 CN 102585802 A *CN102585802A* (21)申请号 201210022383.3 (22)申请日 2012.01.31 C09K 11/06(2006.01) C07D 235/18(2006.01) G01N 33/52(2006.01) G01N 21/64(2006.01) C12Q 1/02(2006.01) (71)申请人 天津理工大学 地址 300384 天津市西青区宾水西道 391 号 天津理工大学主校区科技处 (72)发明人 欧阳杰 王秋生 梁文睿 (74)专利代。
2、理机构 天津佳盟知识产权代理有限 公司 12002 代理人 侯力 (54) 发明名称 一种新型水溶性巯基荧光探针及其制备方法 和应用 (57) 摘要 一种新型水溶性巯基荧光探针， 是以季铵盐 修饰的 2-(2 - 羟基苯基 ) 苯并咪唑 (HPBI) 类 化合物， 化合物的结构是2-5-(三甲基季铵盐 基)-乙酰胺基-2-羟基苯基苯并咪唑。 该荧 光探针可用于水溶液中生物巯基化合物及活体肿 瘤细胞的检测， 即选择性的与二价铜离子配位， 所 得配合物可以进入活细胞中， 与巯基化合物作用， 使荧光化合物重新变为游离态分子并恢复荧光。 本发明的优点是 ： 具有良好的水溶性和生物相容 性， 较高的巯基。
3、测定灵敏度， GSH 反应前后荧光变 化迅速且荧光稳定， 能够长期保存使用， 该荧光探 针为研究生物巯基相关的生物信号通路， 以及巯 基在一些疾病或生物体内过程中的意义及诊断提 供了较好的研究方法。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 6 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 6 页 附图 2 页 1/2 页 2 1.一种新型水溶性巯基荧光探针， 其特征在于 ： 化合物名称为2-5-(三甲基季铵盐 基 )- 乙酰胺基 -2 - 羟基苯基 苯并咪唑 (TMACA-HPBI)， 其化学分子式为 C18H21N4O2。
4、Cl， 该 化合物以2-(2-羟基苯基)苯并咪唑(HPBI)结构作为荧光发色团， 以三甲基氯化铵作为 亲水性基团提高分子的水溶性， 熔点高于 300， 溶于水后在波长为 365nm 的紫外灯照射下 发出蓝色荧光， 该荧光探针的分子结构式为 ： 2. 一种如权利要求 1 所述新型水溶性巯基荧光探针的制备方法， 其特征在于步骤如 下 ： 1) 将苯胺溶于水中得到苯胺水溶液， 加入浓盐酸使苯胺完全溶解， 冰浴冷却到 0-4， 得到苯胺盐酸盐溶液， 将亚硝酸钠溶于水中得到亚硝酸钠水溶液， 冰浴冷却到 0-4后以每 秒钟 1-2 滴的速度滴加到上述苯胺盐酸盐溶液中， 制得苯胺重氮盐溶液 ； 2) 将 N。
5、aOH 水溶液加入水杨醛中得到水杨醛溶液， 在 0温度下将苯胺重氮盐溶液以 每秒钟 3-4 滴的速度滴加到水杨醛碱水溶液中， 同时滴加质量百分比浓度为 20的 Na2CO3 溶液保持 pH 为 7-8， 待苯胺重氮盐溶液滴加完毕后， 将沉淀物用无水乙醇重结晶， 即可制得 2- 羟基 -5- 偶氮苯基水杨醛 ； 3) 将 2- 羟基 -5- 偶氮苯基水杨醛、 亚硫酸氢钠溶解于无水乙醇中， 在 20-25温度下 搅拌得到混合溶液， 将邻苯二胺溶解在 N， N- 二甲基甲酰胺中得到邻苯二胺溶液， 然后将邻 苯二胺溶液滴加到上述混合溶液中， 在 78-80温度下反应 1-3 小时， 将反应物倒入冷水，。
6、 析出黄色沉淀， 抽滤、 真空干燥后， 再用丙酮重结晶两次， 制得 2-(5 - 偶氮苯基 -2 - 羟 基苯基 ) 苯并咪唑 ； 4) 将 2-(5 - 偶氮苯基 -2 - 羟基苯基 ) 苯并咪唑、 质量百分比含量为 80的水合 肼、 质量百分比含量为 5 Pd/C 催化剂与无水乙醇混合， 在 78-80温度下反应 30-60 分 钟， 然后趁热过滤， 将滤液浓缩至有晶体析出， 抽滤后滤饼用乙醇重结晶， 制得 2-(5 - 氨 基 -2 - 羟基苯基 ) 苯并咪唑 ； 5)将2-(5-氨基-2-羟基苯基)苯并咪唑加入到丙酮中得到丙酮溶液， 在60条 件下搅拌至溶解， 冷却至室温后加入氯乙酰氯。
7、和三乙胺， 在 20-25温度下搅拌 3-5 小时， 将该溶液倒入水中， 出现淡黄色沉淀， 静置1-2小时， 抽滤后用水冲洗滤饼2-3次， 干燥后制 得 2-(5 - 氯乙酰氨基 -2 - 羟基苯基 ) 苯并咪唑 ； 6) 将 2-(5 - 氯乙酰氨基 -2 - 羟基苯基 ) 苯并咪唑和质量百分比浓度为 33的三 甲胺乙醇溶液加入到无水乙醇中， 在 70-80温度下搅拌 24-48 小时， 减压蒸出乙醇体积的 95， 冷却到 20-25后加入剩余溶液体积 50 倍的乙醚， 得到白色沉淀， 抽滤、 干燥， 得到白 色粉末即为目标产物 -2-5 -( 三甲基季铵盐基 )- 乙酰胺基 -2 - 羟基。
8、苯基 苯并咪唑 (TMACA-HPBI)。 3. 根据权利要求 2 所述新型水溶性巯基荧光探针的制备方法， 其特征在于 ： 所述苯胺 水溶液的质量百分比浓度为 12-14， 浓盐酸的质量百分比浓度为 37， 苯胺水溶液与浓 权 利 要 求 书 CN 102585802 A 2 2/2 页 3 盐酸体积比为83 ； 所述亚硝酸钠水溶液的质量百分比浓度为30， 亚硝酸钠水溶液与苯 胺盐酸盐溶液的体积比为 1 4。 4. 根据权利要求 2 所述新型水溶性巯基荧光探针的制备方法， 其特征在于 ： 所述 NaOH 水溶液的质量百分比浓度为1， 氢氧化钠水溶液与水杨醛质量比为501， 水杨醛溶液与 苯胺重。
9、氮盐溶液体积比为 6 1。 5. 根据权利要求 2 所述新型水溶性巯基荧光探针的制备方法， 其特征在于 ： 所述 2- 羟 基 -5- 偶氮苯基水杨醛、 亚硫酸氢钠与无水乙醇的质量比为 2 1 150， 邻苯二胺溶解与 N， N- 二甲基甲酰胺的质量比为 1 10， 邻苯二胺溶液与混合溶液体积比为 1 12。 6. 根据权利要求 2 所述新型水溶性巯基荧光探针的制备方法， 其特征在于 ： 所述 2-(5 - 偶氮苯基 -2 - 羟基苯基 ) 苯并咪唑、 质量百分比含量为 80的水合肼、 质量百 分比含量为 5 Pd/C 催化剂与无水乙醇的质量比为 13 30 1 320。 7. 根据权利要求 。
10、2 所述新型水溶性巯基荧光探针的制备方法， 其特征在于 ： 所述 2-(5 - 氨基 -2 - 羟基苯基 ) 苯并咪唑与丙酮的的质量比为 1 4， 丙酮溶液与氯乙酰 氯和三乙胺的体积比为 20 2 3。 8. 根据权利要求 2 所述新型水溶性巯基荧光探针的制备方法， 其特征在于 ： 所述 2-(5 - 氯乙酰氨基 -2 - 羟基苯基 ) 苯并咪唑、 质量百分比浓度为 33的三甲胺乙醇水 溶液与无水乙醇的质量比为 1 2 90。 9. 一种如权利要求 1 所述新型水溶性巯基荧光探针的的应用， 其特征在于用于水溶液 中生物巯基化合物及活体肿瘤细胞的检测， 方法如下 ： 1) 将所述荧光探针配制成 。
11、10M 的水溶液， 然后与 Cu2+反应形成配合物型荧光探针， 再加入含有不同巯基化合物的待测样品水溶液， 测定样品中还原型谷胱甘肽 (GSH) 浓度， 用于 GSH 浓度体外快速诊断 ； 2) 将上述配合物探针与活体细胞共同培养， 与正常细胞 L929 作用前后无变化， 与肿瘤 细胞 Hela 作用后， 可以在荧光电子显微镜下观测到细胞内和细胞膜发出蓝绿色荧光， 可用 于检测活体肿瘤细胞。 权 利 要 求 书 CN 102585802 A 3 1/6 页 4 一种新型水溶性巯基荧光探针及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明属于生物检测技术领域， 具体涉及一种新型水溶性巯基荧光探针及其。
12、制备 方法和应用。 背景技术 0002 巯基 (-SH) 是细胞中化学活性最高的基团之一。在蛋白质中， 巯基部分是与酶活 性相关的反应活性最高的官能团。 细胞中的巯基化合物， 尤其是谷胱甘肽， 做为生物体内一 种重要的抗氧化剂， 它能够清除掉人体内的自由基， 清洁和净化人体内环境污染， 从而增进 了人的身心健康。特别是还原型谷胱甘肽 (GSH) 本身易受某些物质氧化， 所以它在体内能 够保护许多蛋白质和酶等分子中的巯基不被如自由基等有害物质氧化， 从而让蛋白质和酶 等分子发挥其生理功能。随着巯基官能团在生物体内的重要生理作用逐渐被认识， 鉴别和 定量测定生物巯基化合物的方法日益受到关注。 传统。
13、的检测方法有硝普盐法、 碘量法、 电流 分析法、 分光光度法、 比色法等， 但这些方法存在灵敏度低 ( 毫摩尔级以上才能检测 )、 操作 复杂、 选择性差等缺点， 不能适应有些生物样品中巯基化合物的测定， 因此需要合成一些高 灵敏度的分析检测试剂。 0003 荧光测定法由于其成本低， 可重复性好， 测定灵敏， 选择性高， 并且能够实现可视 化观测， 是一种非常好的测定手段。因此， 新型的巯基荧光检测试剂成为研究的焦点。巯基 荧光探针由于检测灵敏度高， 并可作为生物结构研究指示系统， 因而被广泛应用到研究蛋 白质结构和微环境性质、 微量检测胆碱酶或谷胱甘肽S-转移酶、 组织化学染色、 抗原-抗体。
14、 反映的监测和定位、 疾病的诊断、 HPLC 分析巯基化合物等领域。 0004 已报道的巯基荧光探针有芳基卤化物、 丹磺酰氮丙啶类等， 它们具有较好的灵敏 度， 对巯基的检测限一般在纳摩尔 (nmol) 左右， 但这些探针自身都有较强的荧光， 用于活 细胞成像时会造成较低的信噪比 ； 还有一类如苯并呋喃磺酰卤， 虽然自身荧光较弱， 但需要 在碱性条件及高于室温下与巯基衍生， 也无法应用于活细胞成像。最常用来衍生巯基的试 剂是乙酰卤衍生物， 主要是碘乙酰胺衍生物， 它和巯基反应快， 在室温和生理 pH 下即可进 行， 但产物容易失去荧光团， 并且自身对光不稳定。 这些现存的巯基荧光探针均不能很好。
15、的 满足生物荧光检测和荧光成像的要求。 0005 我们通过研究发现含 2-(2 - 羟基苯基 ) 苯并咪唑 (HPBI) 结构的小分子荧光化 合物是一类具有激发态质子转移(ESIPT)特性的荧光化合物， 具有斯托克斯(Stokes)位移 大， 荧光量子收率高， 能与过渡金属形成比较稳定的配合物等优点， 可作为新型功能荧光分 子探针的特色荧光团。我们以 2-(2 - 羟基苯基 ) 苯并咪唑 (HPBI) 类化合物作为配体， 设 计合成了新的二价铜离子配合物， 开展了过渡金属配合物类巯基荧光探针的初步研究。实 验结果表明， HPBI 类荧光化合物与顺磁性的二价铜配合之后， 发生了消光作用。这是由于。
16、 激发态质子转移(ESIPT)机理， 基于HPBI结构的功能荧光探针分子可以在光激发条件下形 成烯醇式和酮式互变异构体产生较强的荧光。随着铜离子的加入， 形成了新的复合物使得 ESIPT过程受阻， 探针分子荧光消失。 还原型谷胱甘肽(GSH)加入后与二价铜离子形成了新 说 明 书 CN 102585802 A 4 2/6 页 5 的复合物， 使探针化合物游离出来， ESIPT 过程得以恢复， 并产生荧光。基于此原理我们可 以发展一种快速、 简便的用于检测 GSH 的方法。 发明内容 0006 本发明的目的是针对上述存在问题， 提供一种新型水溶性巯基荧光探针及其制备 方法， 该荧光探针生物相容性。
17、好， 可用于活细胞中 GSH 成像测定， 植入生物体内测定真实的 巯基化合物浓度变化， 有利于相关疾病的诊断， 并提供一种快速、 简便的用于检测还原型谷 胱甘肽 (GSH) 的方法。 0007 本发明的技术方案 ： 0008 一种新型水溶性巯基荧光探针， 化合物名称为 2-5 -( 三甲基季铵盐基 )- 乙酰 胺基 -2 - 羟基苯基 苯并咪唑 (TMACA-HPBI)， 其化学分子式为 C18H21N4O2Cl， 该化合物以 2-(2 - 羟基苯基 ) 苯并咪唑 (HPBI) 结构作为荧光发色团， 以三甲基氯化铵作为亲水性基 团提高分子的水溶性， 熔点高于 300， 溶于水后在波长为 365。
18、nm 的紫外灯照射下发出蓝色 荧光， 该荧光探针的分子结构式为 ： 0009 0010 一种所述新型水溶性巯基荧光探针的制备方法， 步骤如下 ： 0011 1) 将苯胺溶于水中得到苯胺水溶液， 加入浓盐酸使苯胺完全溶解， 冰浴冷却到 0-4， 得到苯胺盐酸盐溶液， 将亚硝酸钠溶于水中得到亚硝酸钠水溶液， 冰浴冷却到 0-4 后以每秒钟 1-2 滴的速度滴加到上述苯胺盐酸盐溶液中， 制得苯胺重氮盐溶液 ； 0012 2) 将 NaOH 水溶液加入水杨醛中得到水杨醛溶液， 在 0下将苯胺重氮盐溶液以 每秒钟 3-4 滴的速度滴加到水杨醛碱水溶液中， 同时滴加质量百分比浓度为 20的 Na2CO3 。
19、溶液保持 pH 为 7-8， 待苯胺重氮盐溶液滴加完毕后， 将沉淀物用无水乙醇重结晶， 即可制得 2- 羟基 -5- 偶氮苯基水杨醛 ； 0013 3) 将 2- 羟基 -5- 偶氮苯基水杨醛、 亚硫酸氢钠溶解于无水乙醇中， 在 20-25下 搅拌得到混合溶液， 将邻苯二胺溶解在 N， N- 二甲基甲酰胺中得到邻苯二胺溶液， 然后将邻 苯二胺溶液滴加到上述混合溶液中， 在 78-80下反应 1-3 小时， 将反应物倒入冷水， 析出 黄色沉淀， 减压过滤、 真空干燥后， 再用丙酮重结晶两次， 制得 2-(5 - 偶氮苯基 -2 - 羟 基苯基 ) 苯并咪唑 ； 0014 4) 将 2-(5 - 。
20、偶氮苯基 -2 - 羟基苯基 ) 苯并咪唑、 质量百分比含量为 80的 水合肼、 质量百分比含量为 5 Pd/C 催化剂与无水乙醇混合， 在 78-80下反应 30-60 分 钟， 然后趁热过滤， 将滤液浓缩至有晶体析出， 抽滤后滤饼用乙醇重结晶， 制得 2-(5 - 氨 基 -2 - 羟基苯基 ) 苯并咪唑 ； 0015 5) 将 2-(5 - 氨基 -2 - 羟基苯基 ) 苯并咪唑加入到丙酮中得到丙酮溶液， 在 60条件下搅拌至溶解， 冷却至室温后加入氯乙酰氯和三乙胺， 在 20-25下搅拌 3-5 小 说 明 书 CN 102585802 A 5 3/6 页 6 时， 将该溶液倒入水中，。
21、 出现淡黄色沉淀， 静置 1-2 小时， 抽滤后用水冲洗滤饼 2-3 次， 干燥 后制得 2-(5 - 氯乙酰氨基 -2 - 羟基苯基 ) 苯并咪唑 ； 0016 6) 将 2-(5 - 氯乙酰氨基 -2 - 羟基苯基 ) 苯并咪唑和质量百分比浓度为 33 的三甲胺乙醇溶液加入到无水乙醇中， 在 70-80温度下搅拌 24-48 小时， 减压蒸出乙醇体 积的95， 冷却到20-25后加入剩余溶液体积50倍的乙醚， 得到白色沉淀， 抽滤、 干燥， 得 到白色粉末即为目标产物 -2-5 -( 三甲基季铵盐基 )- 乙酰胺基 -2 - 羟基苯基 苯并 咪唑 (TMACA-HPBI)。 0017 所述。
22、苯胺水溶液的质量百分比浓度为 12-14， 浓盐酸的质量百分比浓度为 37， 苯胺水溶液与浓盐酸体积比为 8 3 ； 所述亚硝酸钠水溶液的质量百分比浓度为 30， 亚硝酸钠水溶液与苯胺盐酸盐溶液的体积比为 1 4。 0018 所述 NaOH 水溶液的质量百分比浓度为 1， 氢氧化钠水溶液与水杨醛质量比为 50 1， 水杨醛溶液与苯胺重氮盐溶液体积比为 6 1。 0019 所述 2- 羟基 -5- 偶氮苯基水杨醛、 亚硫酸氢钠与无水乙醇的质量比为 2 1 150， 邻苯二胺溶解与 N， N- 二甲基甲酰胺的质量比为 1 10， 邻苯二胺溶液与混 合溶液体积比为 1 12。 0020 所述2-(5。
23、-偶氮苯基-2-羟基苯基)苯并咪唑、 质量百分比含量为80的水 合肼、 质量百分比含量为 5 Pd/C 催化剂与无水乙醇的质量比为 13 30 1 320。 0021 所述 2-(5 - 氨基 -2 - 羟基苯基 ) 苯并咪唑与丙酮的的质量比为 1 4， 丙酮 溶液与氯乙酰氯和三乙胺的体积比为 20 2 3。 0022 所述2-(5-氯乙酰氨基-2-羟基苯基)苯并咪唑、 质量百分比浓度为33的 三甲胺乙醇水溶液与无水乙醇的质量比为 1 2 90。 0023 一种所述新型水溶性巯基荧光探针的的应用， 用于水溶液中生物巯基化合物及活 体肿瘤细胞的检测， 方法如下 ： 0024 1) 将所述荧光探针。
24、配制成 10M 的水溶液， 然后与 Cu2+反应形成配合物型荧光探 针， 再加入含有不同巯基化合物的待测样品水溶液， 测定样品中还原型谷胱甘肽 (GSH) 浓 度， 用于 GSH 浓度体外快速诊断 ； 0025 2) 将上述配合物探针与活体细胞共同培养， 与正常细胞 L929 作用前后无变化， 与 肿瘤细胞 Hela 作用后， 可以在荧光电子显微镜下观测到细胞内和细胞膜发出蓝绿色荧光， 可用于检测活体肿瘤细胞。 0026 所述新型水溶性巯基荧光探针制备方法的工艺路线表示如下 ： 0027 说 明 书 CN 102585802 A 6 4/6 页 7 0028 本发明的荧光探针与现有技术相比， 。
25、其积极效果是 ： 1) 具有良好的水溶性和生物 相容性 ； 2) 具有较高的巯基测定灵敏度 ； 3) 和 GSH 反应前后荧光变化迅速， 荧光稳定， 适合 于体系内 GSH 的即时荧光测定 ； 4) 稳定性好， 能够长期保存使用 ； 5) 可以进入活细胞中， 选 择性与 GSH 作用， 导致探针分子荧光显著增强。该荧光探针为研究生物巯基相关的生物信 号通路， 以及巯基在一些疾病或生物体内过程中的意义及诊断提供了较好的研究方法。 附图说明 0029 图 1 为水溶性荧光探针分子 1-Cu(1 表示化合物 ) 配合后的荧光光谱变化图。 0030 图 2 为水溶性荧光探针同其它金属离子离子作用后荧光。
26、强度变化对比图。 0031 图 3 为水溶性巯基荧光探针检测巯基化合物 GSH 的荧光强度变化曲线。 0032 图 4 为金属离子配合物型荧光探针对生物巯基化合物检测的选择性。 具体实施方式 0033 下面通过实施例具体的说明本发明， 但本发明不受下述实施例的限定。 0034 实施例 ： 0035 一种所述新型水溶性巯基荧光探针的制备方法， 步骤如下 ： 0036 1) 将 4.66g 苯胺溶于 40mL 水中得到苯胺水溶液， 加入 15mL 质量百分比浓度为 37的浓盐酸使苯胺完全溶解， 冰浴冷却到 0， 得到苯胺盐酸盐溶液， 将 3.6g 亚硝酸钠溶 于 12mL 水中得到亚硝酸钠水溶液，。
27、 冰浴冷却到 0后以每秒钟 2 滴的速度滴加到上述苯胺 说 明 书 CN 102585802 A 7 5/6 页 8 盐酸盐溶液中， 制得苯胺重氮盐溶液 ； 0037 2) 将质量百分比浓度为 1的 NaOH 水溶液 300mL 加入 6.1g 水杨醛中得到水杨醛 溶液， 在 0下将苯胺重氮盐溶液以每秒钟 3 滴的速度滴加到水杨醛碱水溶液中， 同时滴加 质量百分比浓度为 20的 Na2CO3溶液保持 pH 为 8， 待苯胺重氮盐溶液滴加完毕后， 将沉淀 物用无水乙醇重结晶， 即可制得 2- 羟基 -5- 偶氮苯基水杨醛 ； 产物熔点为 127 ； 0038 3) 将 2.1g 2- 羟基 -5。
28、- 偶氮苯基水杨醛、 0.96g 亚硫酸氢钠溶解于 50mL 无水乙醇 中， 在 25下搅拌得到混合溶液， 将 1g 邻苯二胺溶解在 25mLN， N- 二甲基甲酰胺中得到邻 苯二胺溶液， 然后将邻苯二胺溶液滴加到上述混合溶液中， 在 80下反应 3 小时， 将反应物 倒入冷水， 析出黄色沉淀， 减压过滤、 真空干燥后， 再用丙酮重结晶两次， 制得 2-(5 - 偶氮 苯基 -2 - 羟基苯基 ) 苯并咪唑 ； 0039 4) 将 1.5g 2-(5 - 偶氮苯基 -2 - 羟基苯基 ) 苯并咪唑、 5.2ml 质量百分比含 量为 80的水合肼、 0.038g 质量百分比含量为 5 Pd/C 。
29、催化剂与 100mL 无水乙醇混合， 在 80下反应 50 分钟， 然后趁热过滤， 将滤液浓缩至有晶体析出， 抽滤后滤饼用乙醇重结晶， 制得 2-(5 - 氨基 -2 - 羟基苯基 ) 苯并咪唑 ； 0040 5) 将 1g 2-(5 - 氨基 -2 - 羟基苯基 ) 苯并咪唑加入到 50ml 丙酮中得到丙酮 溶液， 在60条件下搅拌至溶解， 冷却至室温后加入氯乙酰氯和三乙胺， 在25下搅拌3小 时， 将该溶液倒入水中， 出现淡黄色沉淀， 静置 1 小时， 抽滤后用水冲洗滤饼 3 次， 干燥后制 得 2-(5 - 氯乙酰氨基 -2 - 羟基苯基 ) 苯并咪唑 ； 0041 6) 将 0.453。
30、g 2-(5 - 氯乙酰氨基 -2 - 羟基苯基 ) 苯并咪唑和 1.05mL 质量百 分比浓度为 33的三甲胺乙醇溶液加入到 50mL 无水乙醇中， 在 80温度下搅拌 48 小时， 减压蒸出乙醇体积的95， 冷却到25后加入剩余溶液体积250mL的乙醚， 得到白色沉淀， 抽滤、 干燥， 得到白色粉末即为目标产物 -2-5 -( 三甲基季铵盐基 )- 乙酰胺基 -2 - 羟 基苯基 苯并咪唑 (TMACA-HPBI)。 0042 该新型水溶性荧光探针的基本数据 ： 0043 淡红色粉末， Mp ： 300 ； 0044 1H NMR(400MHz， DMSO-d 6) ： 4.48(s， 2。
31、H， Ar-CH2-)， 7.06(d， 1H， Ar-H)， 7.28(dd， 2H， Ar-H)， 7.44(dd， 1H， Ar-H)， 7.66(dd， 2H， Ar-H)， 8.44(s， 1H， Ar-H)， 11.13(s， 1H， -NH-)， 13.19(br s， 2H， Ph-OH， -NH).Anal.Calcd for C18H21ClN4O2： C， 59.91 ； H， 5.87 ； N， 15.53. Found ： C， 60.08 ； H， 5.75 ； N， 15.65。 0045 该荧光探针的检测与应用 ： 0046 1) 水溶性荧光探针和二价铜离子配合。
32、后的荧光光谱变化 ： 0047 将探针分子溶于水中， 至终浓度为 10M。取 3mL， 再滴加浓度为 500M 的 Cu2+溶 液， 直至混合溶液中 Cu2+溶液浓度为 13M。期间测定荧光强度变化， 做出荧光强度对 Cu2+ 浓度的变化曲线， 激发波长均为 320nm。图 1 为水溶性荧光探针分子 1-Cu 配合后的荧光光 谱变化图。 随着铜离子浓度的不断增加， 探针分子在水溶液中的荧光强度逐渐降低。 当Cu2+ 浓度增加到 1.310-3时， 探针分子荧光与未加入 Cu2+相比几乎消失。从图 1 中可以看出该 探针和二价铜离子反应后， 荧光强度有了明显的下降， 这说明随着铜离子的加入， 形。
33、成了新 的配合物使得 ESIPT 过程受阻， 探针分子荧光淬灭。 0048 2) 水溶性荧光探针同其他过渡金属离子离子反应对比 ： 说 明 书 CN 102585802 A 8 6/6 页 9 0049 将探针分子溶于水中， 至终浓度为 10M。取 3mL， 再滴加浓度为均 500M 的各种 金属离子水溶液， 使混合溶液中金属离子溶液浓度为13M。 期间测定荧光强度相对于原探 针的变化倍数， 激发波长均为320nm做出荧光增强倍数对应各过渡金属离子的柱状图。 图2 为水溶性荧光探针同其它金属离子离子作用后荧光强度变化对比图。 在相浓度TMACA-HPBI 水溶液中加入相同浓度的不同金属离子， 。
34、只有 Cu2+对体系荧光强度的改变最为显著。从图 2 中可以看出， 该荧光探针同其他过渡金属离子相比， 对 Cu2+具有很高的选择性， 能够专一 反应。在反应前后荧光强度有明显的变化， 而生物系统中存在的常见的其他金属离子却不 能对它的荧光造成明显的改变， 可以很好的排除不同金属离子的干扰。 0050 3) 水溶性荧光探针对谷胱甘肽的荧光强度 - 浓度曲线 ： 0051 取水溶性荧光探针探针分子， 将该化合物溶于水中， 至终浓度为 10M。取 3mL， 加 入 Cu2+溶液， 使混合溶液中 Cu2+溶液浓度为 13M. 之后滴加浓度为 500M 的 GSH 溶液， 直 至混合溶液中 GSH 溶。
35、液浓度为 39M。期间测定荧光强度变化， 激发波长均为 320nm， 做出 荧光强度对 GSH 浓度变化曲线。图 3 为水溶性巯基荧光探针检测巯基化合物 GSH 的荧光强 度变化曲线。向 1-Cu 水溶液中逐渐加入 GSH 溶液， 随着 GSH 浓度升高， 体系荧光强度逐渐 增强。从图 3 中可以得出， 加入 GSH 溶液后荧光强度有了大幅度的恢复， 这说明 GSH 溶液与 二价铜离子形成了新的配合物， 使探针化合物游离出来， ESIPT 过程得以恢复， 并产生荧光。 0052 4) 探针对巯基化合物检测的选择性 ： 0053 取水溶性荧光探针探针分子， 将其溶于水中， 至终浓度为 10M。取。
36、 3mL， 加入 Cu2+ 溶液， 使混合溶液中 Cu2+溶液浓度为 13M。再分别加入浓度均为 500M 谷胱甘肽 (GSH)， 半胱氨酸盐酸盐(L-Cys)， 巯基乙胺盐酸盐(MEA)， 巯基乙酸(TGA)溶液， 使混合溶液中巯基 化合物溶液浓度为 39M。测定加入巯基化合物后荧光强度相对于原探针的变化倍数， 激 发波长均为 320nm。做出荧光增强倍数对巯基化合物浓度的变化曲线。图 4 为金属离子配 合物型荧光探针对生物巯基化合物检测的选择性。GSH 检测灵敏性优于其它三种巯基化合 物。从图 4 中可以看出， 同其它巯基化合物相比， 该荧光探针对还原型谷胱甘肽 (GSH) 具有 很高的选。
37、择性， 能够专一反应。 在反应前后荧光强度有明显的变化， 而生物系统中存在的常 见的其他巯基化合物却不能对它的荧光造成明显的改变。因此， 它能够被应用于水溶液中 选择性检测生物巯基化合物。 0054 5) 探针对正常细胞和肿瘤细胞荧光成像区别 ： 0055 取1-Cu配合物溶于去离子水中， 浓度为0.1M， 分别加入到L929和Hela细胞中， 探 针的终浓度为5M。 L929细胞以Roswell Park Memorial Institute(RPMI1640)培养基加 入 10胎牛血清培养液进行培养， Hela 细胞以 Dublecco Modified Eagle Media(DMEM)。
38、 培养基加入 5胎牛血清培养液进行培养。在 12 小时后照荧光照片。 0056 探针1-Cu对肿瘤细胞的检测效果非常明显。 在正常细胞L929中， 加入探针后只有 微弱的荧光增强， 这可能是 L929 细胞本底产生的 GSH 有关。而在肿瘤细胞 Hela 中加入探 针后细胞荧光显著增强， 这是由于肿瘤细胞代谢产生大量的 GSH 使细胞内和细胞周围 GSH 局部浓度变大。GSH 与 Cu2+形成新的复合物后使 1 游离出来发生 ESIPT 过程， 探针分子荧 光恢复， 达到对肿瘤细胞检测的目的。 说 明 书 CN 102585802 A 9 1/2 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102585802 A 10 2/2 页 11 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102585802 A 11 。