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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310041348.0 (22)申请日 2013.02.01 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 103966161 A (43)申请公布日 2014.08.06 (73)专利权人 上海交通大学医学院附属第九人 民医院 地址 200011 上海市制造局路639号 (72)发明人 陆信武秦金保叶开创李祥祥 杨心蕊蒋米尔 (74)专利代理机构 上海元一成知识产权代理事 务所(普通合伙) 31268 代理人 吴桂琴 (51)Int.Cl. C12N 5/0775(20。
2、10.01) C12N 5/0735(2010.01) C12N 5/074(2010.01) A61L 31/04(2006.01) A61L 31/00(2006.01) A61L 31/16(2006.01) A61K 35/12(2015.01) A61K 35/545(2015.01) A61K 47/36(2006.01) A61P 9/14(2006.01) (56)对比文件 WO 2006062989 A1,2006.06.15, Qin et al,.Long-term MRI tracking of dual-labeled adipose-derived stem cel。
3、ls homing into mouse carotid artery injury. International Journal of Nanomedicine .2012,5191-5203. Bartosh， et al.Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. PNS .2010,第107卷(第31期), 13724-13729. 审查员 王莉 (54)发明名称 一种模拟体内微环境的干细胞培养体系及。
4、 用途 (57)摘要 本发明属于细胞生物学领域， 涉及一种拟体 内微环境的干细胞培养体系及用途； 本发明利用 琼脂糖构建三维支架材料， 模拟体内微环境动态 培养干细胞， 使干细胞维持自我更新、 增殖、 归巢 及向内皮细胞定向分化。 本发明还比较二维培养 及三维干细胞在正常及低氧环境下的生物学功 能差异， 利用EGFP基因示踪的方法和成像技术， 体内移植修复ApoE基因敲除小鼠内皮损伤， 从 多能转录因子表达、 生长因子分泌、 细胞外基质 成分、 细胞膜内信号分子活化等多个方面， 测定 三维干细胞维持自我更新、 增殖、 归巢及向内皮 细胞定向分化的遂平。 本发明能用于血管损伤修 复中， 以及为干。
5、细胞疗法促进损伤血管的早期再 内皮化的应用奠定理论基础及实验依据。 权利要求书1页 说明书6页 附图3页 CN 103966161 B 2016.09.07 CN 103966161 B 1.一种模拟体内微环境动态培养干细胞的方法， 其特征在于， 利用琼脂糖构建三维支 架材料， 并模拟体内微环境动态培养干细胞， 使干细胞维持自我更新、 增殖、 归巢及向内皮 细胞定向分化； 其包括步骤： (1)构建干细胞培养的三维支架材料 称取琼脂糖， 高温溶解， 低温冷却， 制备三维胶原支架材料， 检测其硬度及生物相容性， 其中琼脂糖浓度为0.01-10； 高温溶解的温度为50200； 低温冷却的温度为-20。
6、20 ， 所述三维胶原支架材料其厚度为1mm50mm， 其降解时间为1h-1年； (2)建立干细胞三维培养体系 建立模拟体内微环境的干细胞三维培养体系； 通过流式分析、 免疫荧光、 RT-PCR、 Elisa 方法鉴定并比较二维和三维培养的干细胞在不同培养条件下的表型、 生长特性及旁分泌因 子或蛋白的差异； (3)检测三维培养干细胞自我更新调控能力 利用基因芯片技术对二维及三维培养的干细胞进行比较， 分析在不同培养条件下干细 胞的基因表达差异， 利用qRT-PCR、 Westernblot、 Confocal共定位和RNA干扰技术检测 Nanog、 Sox2、 Oct4多能转录因子的功能及调控。
7、能力； (4)检测三维培养干细胞向内皮细胞诱导分化 将二维和三维培养的干细胞在不同培养条件下进行多向诱导内皮、 骨、 软骨、 脂肪分 化， 测定其向内皮细胞诱导分化过程中的细胞表型、 标志蛋白表达及再生内皮细胞功能的 差异； (5)检测三维培养干细胞向内皮定向分化的调控水平 利用EGFP基因示踪二维及三维培养的干细胞体内移植修复ApoE基因缺陷小鼠内皮损 伤模型， 观察干细胞的存活、 迁移、 归巢及分化， 从分子基因、 蛋白、 细胞与组织水平， 确定三 维培养脂肪干细胞自我更新及向内皮细胞定向分化的水平， 采用HE、 油红、 免疫荧光染色或 透射电镜方法观察标本的内皮细胞的连续性及完整性。 2。
8、.如权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(1)中， 三维胶原支架材料其形态为 圆形、 方形或不规则形。 3.如权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述方法中， 模拟体内微环境动态培养的干 细胞为成体干细胞或诱导的全能干细胞。 权利要求书 1/1 页 2 CN 103966161 B 2 一种模拟体内微环境的干细胞培养体系及用途 技术领域 0001 本发明属于细胞生物学领域， 涉及干细胞培养体系， 具体涉及一种模拟体内微环 境的干细胞培养体系及其及其在血管损伤修复中的用途， 尤其涉及一种模拟体内微环境的 干细胞三维培养体系， 该培养体使干细胞维持自我更新、 增殖、 归巢及向内皮细胞定。
9、向分 化， 能为干细胞疗法促进损伤血管的早期再内皮化的广泛应用奠定理论基础及实验依据。 背景技术 0002 随着人口的老龄化和饮食结构的改变， 动脉粥样硬化所导致的心脑血管疾病已成 为人类死亡的首要原因； 目前临床治疗中， 血管成形术及支架植入术等已成为治疗心脑血 管疾病的重要手段之一。 有研究发现， 不论是单纯的球囊扩张、 金属裸支架还是药物涂层支 架(DES)， 其术后再狭窄和支架内血栓的形成仍有一定的发生率， 部分患者的远期疗效尚不 理想； 研究还进一步证实， 腔内治疗术所造成的靶血管管壁内皮细胞损伤并于术后3天大部 分脱落， 以及药物支架对损伤血管内皮再生的抑制是导致术后血管再狭窄、 。
10、血栓形成的重 要原因。 还有研究亦证实， 支架术后再内皮化延迟与晚期血栓形成密切相关。 因此， 及早恢 复损伤血管内皮细胞结构及生物学功能即早期再内皮化对防治腔内治疗术后血管再狭窄 及血栓形成的发生具有重要的意义。 由于自体分化的内皮细胞来源缺乏， 且研究发现老龄 患者受损血管内皮的再生能力下降， 因此急需寻找一种新的治疗方法来促进损伤血管内皮 细胞的再生。 0003 传统观点认为， 血管损伤后修复主要依赖于邻近成熟内皮细胞的增殖和迁移， 但 越来越多的研究证实， 骨髓和外周血中内皮祖细胞(EPC)归巢于损伤血管内皮局部， 并分化 为成熟内皮细胞， 参与损伤血管的再内皮化， 在血管内皮损伤修复。
11、中起重要作用。 当前临床 上采集外周血或骨髓干细胞风险较大， 且患者多为老年人， 其骨髓干细胞及外周血中EPC不 仅数量减少， 且增殖分化能力均显著降低， 较难满足临床的广泛应用。 所述的胚胎干细胞 (ESC)虽然具有较强的增殖分化能力， 可在体内外向内皮细胞分化， 然而ESC尚存在定向分 化及纯化的技术障碍， 且面临伦理及免疫排斥反应， 移植后有形成畸胎瘤的可能， 临床应用 受到一定的限制； 因此， 目前急需寻找一种 “供区更丰富、 损伤更微小、 获取更方便” 的新的 种子细胞， 来促进损伤血管内皮细胞的再生。 现有研究发现， 与自体骨髓和外周血干细胞相 比， 脂肪组织供区丰富， 间充质干细。
12、胞更原始， 体外扩增能力更强， 向血管内皮、 肌肉、 骨、 神 经细胞的分化能力更强， 具有更加有效的干细胞特性， 且细胞采集方便、 免疫源性相对较 低， 因此， 脂肪干细胞(ADSC)有望成为治疗内皮损伤性疾病新的种子细胞来源。 0004 传统的ADSC培养方法使干细胞单层生长于二维环境， ADSC虽数量迅速扩增， 但在 培养传代的过程中出现干细胞的去分化或老化现象而失去其原有的细胞表型， 干细胞的生 长特性及多向分化能力受到极大影响， 限制了ADSC临床治疗的广泛应用； 如何在体外建立 适合ADSC生长和多向分化的微环境对ADSC自我更新及定向分化的研究至关重要。 研究发 现， 三维培养技。
13、术通过模拟体内细胞生长的微环境， 建立细胞之间及胞外基质间的广泛联 系， 通过形成一定的三维立体结构， 促进细胞近似于在机体内的基因表达、 胞外基质分泌及 说明书 1/6 页 3 CN 103966161 B 3 细胞生物学功能活性， 故其在干细胞再生医学及临床转化医学应用方面有着非常大的发展 前景。 0005 Bartosh等通过三维培养， 模拟机体条件的独特干细胞及其他组织生长技术， 使干 细胞在一种更接近体内细胞生长环境的三维培养环境中生长， 结果显示， 细胞结构与生物 学功能和在人体中发现的细胞较为相似。 本申请发明人的前期研究发现通过模拟体内微环 境的三维培养方法， 成功分离出高表达。
14、多能转录因子Nanog、 Sox2及Oct4的脂肪干细胞 (3DADSC)。 研究还发现， Nanog、 Sox2及Oct-4是维持干细胞多能性和自我更新的转录因子， 其通过结合靶基因调控区， 选择性地抑制分化基因表达或促进多能性基因表达。 Eiraku等 采用微胶囊三维细胞培养技术培养未分化小鼠胚胎干细胞， 细胞活力检测和组织学观察、 以及细胞内Oct4基因的表达， 均表明微胶囊中的小鼠胚胎干细胞呈未分化状态， 且维持了 正常的生长形态， 显示该方法便于胚胎干细胞的大量培养和优化。 2006年以来， 日美科学家 利用病毒载体转染不同转录因子(Oct4， Sox2， Klf4， c-Myc等)。
15、， 成功将体细胞重编程为诱导 多能干细胞(iPS)。 筛选表达Nanog的iPS， 其DNA甲基化水平(包括动态的去甲基化/重新甲 基化状态)、 组蛋白修饰以及基因表达和功能均与ES细胞类似。 有学者发现Nanog、 Sox2及 Oct4通常只在多能干细胞中表达， 在分化细胞中不表达。 虽然多能转录因子Nanog、 Sox2及 Oct4是三个很关键的核心调控因子， 但目前对于其调节三维培养干细胞自我更新、 高度增 殖和多向分化的机制仍不清楚， 关键转录因子所介导的信号转导途径尚未完全阐明。 0006 研究发现血管成形术及支架植入术不可避免的导致血管内皮细胞的损伤， 受损的 内皮细胞NOS和PG。
16、I2的分泌减少， 炎症细胞浸润， 抗血小板聚集和抗血栓形成的作用减弱， 血管平滑肌细胞在内皮缺失的部位移行和过度增殖， 导致血管内膜重构从而导致血管再狭 窄及血栓形成的发生； 因此， 早期快速再内皮化对防治腔内治疗术后血管再狭窄及血栓形 成的发生具有重要意义。 如何定向调控干细胞向内皮细胞的分化， 一直以来都是再生医学 中的难点。 最近， 有学者建立了三维球形细胞培养系统， 该系统能调控骨髓间充质干细胞分 化的相关基因表达， 促进骨髓间充质干细胞定向分化， 使骨髓间充质干细胞的分化效率大 大提高， 为工程化三维细胞培养分化效率机制的研究， 以及再生医学和药物选择研究提供 有意义的参考依据。 本。
17、申请发明人拟在前期的研究基础上提供一种模拟体内微环境的干细 胞三维培养体系， 使干细胞维持自我更新、 增殖、 归巢及向内皮细胞定向分化， 以为干细胞 疗法促进损伤血管的早期再内皮化的广泛应用提供有参考一级的实验依据。 发明内容 0007 本发明的目的是提供一种干细胞培养体系， 具体涉及一种模拟体内微环境的干细 胞培养体系及其及其在血管损伤修复中的用途， 尤其涉及一种模拟体内微环境的干细胞三 维培养体系， 该培养体使干细胞维持自我更新、 增殖、 归巢及向内皮细胞定向分化， 能用于 血管损伤修复中， 以及为干细胞疗法促进损伤血管的早期再内皮化的广泛应用奠定理论基 础及实验依据。 0008 本发明在。
18、二维培养的ADS的基础上进一步完善并建立模拟体内微环境的脂肪干细 胞三维培养体系， 比较二维培养及3DADSC在正常及低氧环境下的生物学功能差异， 利用 EGFP基因示踪的方法和成像技术， 体内移植修复ApoE基因敲除小鼠内皮损伤， 从多能转录 因子表达、 生长因子分泌、 细胞外基质成分、 细胞膜内信号分子活化等多个方面， 探讨 说明书 2/6 页 4 CN 103966161 B 4 3DADSC维持自我更新、 增殖、 归巢及向内皮细胞定向分化的分子机制， 为脂肪干细胞疗法促 进损伤血管的早期再内皮化的广泛应用奠定理论基础及实验依据。 0009 本发明的模拟体内微环境的干细胞培养体系， 其特。
19、征在于， 利用琼脂糖构建三维 支架材料， 并模拟体内微环境动态培养干细胞， 使干细胞维持自我更新、 增殖、 归巢及向内 皮细胞定向分化， 其包括步骤： 0010 (1)构建干细胞培养的三维支架材料 0011 称取琼脂糖， 高温溶解， 低温冷却， 制备三维胶原支架材料， 检测其硬度及生物相 容性； 0012 (2)建立干细胞三维培养体系 0013 建立一套稳定的模拟体内微环境的干细胞三维培养体系； 通过流式分析、 免疫荧 光、 RT-PCR、 Elisa等方法鉴定并比较二维和三维培养的干细胞在不同培养条件下的表型、 生长特性及旁分泌因子或蛋白的差异； 0014 (3)检测三维培养干细胞自我更新调。
20、控能力 0015 利用基因芯片技术对二维及三维培养的干细胞进行比较， 分析在不同培养条件下 干细胞的基因表达差异， 利用qRT-PCR、 ： Westernblot、 Confocal共定位、 RNA干扰等技术检 测Nanog、 Sox2、 Oct4等多能转录因子的功能及调控； 0016 (4)测定三维培养脂肪干细胞向内皮细胞诱导分化 0017 将二维和三维培养的干细胞在不同培养条件下进行多向诱导(内皮、 骨、 软骨、 脂 肪等)分化， 检测其向内皮细胞诱导分化过程中的细胞表型、 标志蛋白表达及再生内皮细胞 功能等的差异； 0018 (5)检测三维培养干细胞向内皮定向分化的调控能力 0019 。
21、利用EGFP基因示踪二维及三维培养的干细胞体内移植修复ApoE基因缺陷小鼠内 皮损伤模型， 观察干细胞的存活、 迁移、 归巢及分化， 从分子基因、 蛋白、 细胞与组织水平， 检 测三维培养脂肪干细胞自我更新及向内皮细胞定向分化的分子的能力。 0020 本发明方法中， 步骤(1)中的三维胶原支架材料主要采用琼脂糖构建， 所述琼脂糖 浓度为0.01-10； 本发明的一个实施例中， 所述琼脂糖浓度为0.1； 0021 本发明方法的步骤(1)中， 三维胶原支架材料高温溶解的温度为50200； 0022 所述三维胶原支架材料低温冷却的温度为-2020； 0023 所述三维胶原支架材料其形态为圆形、 方形。
22、或不规则形； 0024 所述三维胶原支架材料的厚度为1mm50mm； 0025 本发明方法步骤(1)中， 三维胶原支架材料的降解时间为1h-1年； 0026 本发明方法步骤(1)中， 三维胶原支架材料培养体系培养的干细胞为各种干细胞， 包括成体干细胞、 胚胎干细胞和诱导的全能干细胞； 0027 本发明方法步骤(5)中， 部分标本进行组织学观察观察内皮细胞的连续性及完整 性， 其方法为HE、 油红、 免疫荧光染色或透射电镜； 0028 本发明方法步骤(5)中， 通过Western-blot和Realtime-PCR检测脂肪源细胞快速 内皮化。 0029 本发明中， 比较二维培养及三维干细胞在正常。
23、及低氧环境下的生物学功能差异， 利用EGFP基因示踪的方法和成像技术， 体内移植修复ApoE基因敲除小鼠内皮损伤， 从多能 说明书 3/6 页 5 CN 103966161 B 5 转录因子表达、 生长因子分泌、 细胞外基质成分、 细胞膜内信号分子活化等多个方面， 结果 显示： 将EGFP转基因小鼠腹股沟脂肪组织中分离获得脂肪干细胞经二维及三维培养后， P3 代三维培养ADSC成球形立体生长； WB检测二维及三维培养ADSC表达多能转录因子Nanog、 Sox2及Oct4的差异， 结果显示， 三维培养的ADSC高表达多能转录因子； 三维培养ADSC向内皮 细胞诱导分化CD31免疫荧光染色， 及。
24、WB检测二维及三维培养的ADSC诱导后表达CD31的差 异， 结果显示， 三维培养ADSC具有更高的诱导效率； ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化血管 内皮损伤后透射电镜及扫描电镜检测， 结果显示， 内皮细胞脱落、 功能受损， 血管平滑肌细 胞分泌细胞外基质蛋白导致血管内膜重构； EGFP示踪三维培养的ADSC修复ApoE小鼠下肢 缺血， 4w后免疫荧光染色见EGFP脂肪干细胞向损伤区聚集且再内皮化CD31+； 检测结果表明 了三维干细胞维持自我更新、 增殖、 归巢及向内皮细胞定向分化水水平。 0030 本发明能用于血管损伤修复中， 以及为干细胞疗法促进损伤血管的早期再内皮化 的应用奠定理论基础。
25、及实验依据。 0031 为了便于理解， 以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。 需要 特别指出的是， 具体实例和附图仅是为了说明， 显然本领域的普通技术人员可以根据本文 说明， 在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变， 这些修正和改变也纳入本 发明的范围内。 附图说明 0032 图1： 将EGFP转基因小鼠腹股沟脂肪组织中分离获得脂肪干细胞经二维及三维培 养后； 其中， 0033 A为P3代EGFP脂肪干细胞， 细胞成单层生长， 部分老化； 0034 B为荧光显微镜下呈绿色荧光； C、 D为P3代三维培养ADSC成球形立体生长； 0035 图2： 二维及三维培养的ADS。
26、C多能转录因子Sox2及细胞外基质Fibronectin的免疫 荧光染色。 0036 图3： WB检测二维及三维培养ADSC表达多能转录因子Nanog、 Sox2及Oct4的差异； 其 中显示， 三维培养的ADSC高表达多能转录因子； 0037 图4： 三维培养ADSC向内皮细胞诱导分化CD31免疫荧光染色， 及WB检测二维及三维 培养的ADSC诱导后表达CD31的差异， 其中， 0038 A为三维培养ADSC向内皮细胞诱导分化CD31免疫荧光染色； 0039 B为WB检测二维及三维培养的ADSC诱导后表达CD31的差异， 结果显示， 三维培养 ADSC具有更高的诱导效率。 0040 图5： 。
27、ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化血管内皮损伤后透射电镜及扫描电镜检 测， 可见内皮细胞脱落、 功能受损(浅色箭头所示)， 血管平滑肌细胞分泌细胞外基质蛋白导 致血管内膜重构(深色箭头所示)。 0041 图6： EGFP示踪三维培养的ADSC修复ApoE小鼠下肢缺血， 4w后免疫荧光染色见 EGFP脂肪干细胞向损伤区聚集且再内皮化CD31+； 其中， 0042 E为SMA染色； F为CD31染色； G为F4/80染色； H为MAC-3染色。 具体实施方式 说明书 4/6 页 6 CN 103966161 B 6 0043 实施例1 0044 建立模拟体内微环境的干细胞培养体系， 包括以下步骤： 。
28、0045 (1)构建干细胞培养的三维支架材料 0046 称取琼脂糖， 高温溶解， 低温冷却， 制备三维胶原支架材料， 检测其硬度及生物相 容性； 0047 (2)建立干细胞三维培养体系 0048 建立一套稳定的模拟体内微环境的干细胞三维培养体系； 通过流式分析、 免疫荧 光、 RT-PCR、 Elisa等方法鉴定并比较二维和三维培养的干细胞在不同培养条件下的表型、 生长特性及旁分泌因子或蛋白的差异； 0049 (3)研究三维培养干细胞自我更新调控机制 0050 利用基因芯片技术对二维及三维培养的干细胞进行比较， 分析在不同培养条件下 干细胞的基因表达差异， 利用qRT-PCR、 ： Weste。
29、rnblot、 Confocal共定位、 RNA干扰等技术揭 示Nanog、 Sox2、 0ct4等多能转录因子的功能及调控机制； 0051 (4)研究三维培养脂肪干细胞向内皮细胞诱导分化 0052 将二维和三维培养的干细胞在不同培养条件下进行多向诱导(内皮、 骨、 软骨、 脂 肪等)分化， 揭示其向内皮细胞诱导分化过程中的细胞表型、 标志蛋白表达及再生内皮细胞 功能等的差异； 0053 (5)研究三维培养干细胞向内皮定向分化的调控机制 0054 利用EGFP基因示踪二维及三维培养的干细胞体内移植修复ApoE基因缺陷小鼠内 皮损伤模型， 观察干细胞的存活、 迁移、 归巢及分化， 从分子基因、 。
30、蛋白、 细胞与组织水平， 揭 示三维培养脂肪干细胞自我更新及向内皮细胞定向分化的分子机制。 0055 步骤(1)中的三维胶原支架材料主要采用琼脂糖构建， 所述琼脂糖浓度0.1； 0056 步骤(2)中通过流式分析、 免疫荧光、 RT-PCR、 Elisa等方法鉴定并比较二维和三维 培养的干细胞在不同培养条件下的表型、 生长特性及旁分泌因子或蛋白的差异； 0057 步骤(3)中利用基因芯片技术对二维及三维培养的干细胞进行比较， 分析在不同 培养条件下干细胞的基因表达差异， 利用qRT-PCR、 ： Westernblot、 Confocal共定位、 RNA干 扰等技术揭示Nanog、 Sox2、。
31、 Oct4等多能转录因子的功能及调控机制； 0058 步骤(4)中将二维和三维培养的干细胞在不同培养条件下进行多向诱导(内皮、 骨、 软骨、 脂肪等)分化， 重点揭示其向内皮细胞诱导分化过程中的细胞表型、 标志蛋白表达 及再生内皮细胞功能等的差异。 0059 步骤(5)中利用EGFP基因示踪二维及三维培养的干细胞体内移植修复ApoE基因 缺陷小鼠内皮损伤模型， 观察干细胞的存活、 迁移、 归巢及分化， 从分子基因、 蛋白、 细胞与 组织水平研究三维培养脂肪干细胞自我更新及向内皮细胞定向分化的分子机制。 0060 其中， 0061 步骤(1)中的三维胶原支架材料主要采用琼脂糖构建， 所述琼脂糖浓。
32、度为为 0.1； 该三维胶原支架材料高温溶解的温度为50200， 低温冷却的温度为-2020； 所述三维胶原支架材料其形态为圆形、 方形或不规则形； 该三维胶原支架材料的厚度为1mm 50mm， 其降解时间为1h-1年。 0062 三维胶原支架材料培养体系培养的干细胞为各种干细胞， 包括成体干细胞、 胚胎 说明书 5/6 页 7 CN 103966161 B 7 干细胞和诱导的全能干细胞。 0063 步骤(5)中， 部分标本进行组织学观察观察内皮细胞的连续性及完整性， 其方法为 HE、 油红、 免疫荧光染色或透射电镜； 同时， 通过Western-blot和Realtime-PCR探讨脂肪源 细胞快速内皮化的分子机制。 说明书 6/6 页 8 CN 103966161 B 8 图1 图2 说明书附图 1/3 页 9 CN 103966161 B 9 图3 图4 说明书附图 2/3 页 10 CN 103966161 B 10 图5 图6 说明书附图 3/3 页 11 CN 103966161 B 11 。