抑制凝血酶的二酮哌嗪衍生物.pdf

摘要
申请专利号：	CN00816317.0	申请日：	2000.11.29
公开号：	CN1402725A	公开日：	2003.03.12
当前法律状态：	终止	有效性：	无权
法律详情：	专利权的终止(未缴年费专利权终止)授权公告日：2004.11.10\|\|\|专利申请权、专利权的转移(专利权的转移)变更项目:专利权人变更前权利人:四川达鑫生物科技有限公司变更后权利人:上海加中生物技术有限公司变更项目:地址变更前:四川省成都市王府井大厦B座13楼A单元变更后:200031上海市宛平南路381号宛轻商务楼606-608室登记生效日:2005.1.28\|\|\|授权\|\|\|公开
IPC分类号：	C07D471/04; A61K31/495	主分类号：	C07D471/04; A61K31/495
申请人：	四川达鑫生物科技有限公司;
发明人：	程毓渡; 杰弗里·曼韦尔
地址：	四川省成都市王府井大厦B座13楼A单元
优先权：	1999.11.30 US 60/167,901; 2000.04.04 US 60/194,366
专利代理机构：	上海智信专利代理有限公司	代理人：	薛琦
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内容摘要

本发明涉及抑制血凝固的化合物，尤其是特异性地抑制凝血酶新的二酮派嗪衍生物；药学上可接受的盐类及其成分。化合物具有如下通式：其中R1、R2和R4代表氢、烷基或芳基部分，R3代表烷基或芳基部分，R5代表氢、烷基、芳基、氢芳基、杂芳基、氢杂芳基、磺酰烷基、磺酰芳基、磺酰氢芳基、磺酰杂芳基或磺酰氢杂芳基部分，R6代表氢、烷基、芳基、氢芳基、杂芳基或氢杂芳基部分。还披露了采用化合物治疗凝血障碍(如血栓形成和肝素相关的血小板减少症)的方法。

权利要求书

1、一种具有下列结构I的化合物：

或一种药学上可接受的盐和立体异构体，其中R¹、R²和R⁴代表氢、烷
基或芳基部分，R³代表烷基或芳基部分，R⁵代表氢、烷基、芳基、氢芳基、
杂芳基、氢杂芳基、磺酰烷基、磺酰芳基、磺酰氢芳基、磺酰杂芳基或磺酰
氢杂芳基部分，R⁶代表氢、烷基、芳基、氢芳基、杂芳基或氢杂芳基部分。
2、根据权利要求1所述一种化合物，其中R¹、R²和R⁴代表氢、烷基
或芳基部分，R³代表烷基或芳基部分，R⁵代表烷基、芳基、氢芳基、杂芳
基或氢杂芳基部分。
3、根据权利要求2所述一种化合物，其中R³代表甲基部分，R⁵代表1，2，3，4-
四氢-3-甲基-8-喹啉磺酰基，R⁶代表3-胍丙基。
4、根据权利要求1所述的一种药物成分，包括一种化合物作为与药学
上可接受的载体相结合的活性组份。
5、根据权利要求1所述的一种药物成分，包括与药学上可接受的载体
相结合的一种化合物，所述的药物成分适合于口服。
6、一种明显阻止哺乳动物或人或组织中的凝血酶活性的方法，包括对
哺乳动物、人或组织给与根据权利要求1所述的一种有效量的化合物。
7、一种治疗哺乳动物或人或组织中的凝血障碍的方法，包括对哺乳动
物、人或组织给与根据权利要求1所述的一种有效量的化合物。
8、根据权利要求6所述的方法，障碍包括血栓形成或肝素诱导血小板
减少症。
9、一种明显阻止哺乳动物或人或组织中的凝血酶活性的方法包括对哺
乳动物、人或组织给与根据权利要求5所述的一种有效量的药物成分。
10、一种明显阻止哺乳动物或人或组织中的溶解血纤维蛋白的酶活性的
方法，包括对哺乳动物、人或组织给与根据权利要求5所述的一种有效量的
药物成份。
11、根据权利要求10所述的一种方法，溶解血纤维蛋白的酶是从一组
尿激酶、血浆和组织纤溶酶原激活物(tPA)中挑选出的。
12、一种治疗哺乳动物或人或组织中的凝血障碍的方法，包括对哺乳动
物、人或组织给与根据权利要求5所述的一种有效量的药物成分。
13、根据权利要求12所述的一种方法，障碍包括血栓形成或肝素诱导
的血小板减少症。

说明书

抑制凝血酶的二酮哌嗪衍生物

发明的背景

a.发明的领域

本发明涉及抑制血凝固的化合物，特别是特异性地抑制凝血酶的二酮哌
嗪衍生物，在药学上可接受的盐类及其成份。

b.现有技术的描述

血栓病的特征在于形成阻碍血管血液流动的血栓，导致动脉或静脉血栓
形成或血栓栓塞。凝血酶由血纤维蛋白、血小板、白细胞和红细胞组成。血
栓形成涉及一些遗传和环境因素。基因不配对的抗凝血剂机制包括抗活化的
C蛋白的因子V、高半胱氨基酸血过多、C蛋白缺乏、S蛋白缺乏、抗凝血
酶缺乏和缺陷性血纤维蛋白溶解作用，而血栓刺激包括外科、怀孕、使用口
服避孕药和抗磷脂抗体。急、慢性血栓并发症包括静脉和动脉血栓、心房纤
维颤动、中风、心肌梗塞和肺栓塞是全球死亡的主要原因。

抗血栓治疗包括溶解血栓药物治疗除去血栓，使用抗血小板药物和抗凝
血剂抑制凝血。进一步的治疗根据参与的静脉或动脉循环系统和血管的大小
和位置而变化。

目前采用的抗凝血剂有一些缺点(Exp.Opin.Inves.Drugs 1997，6：1591-
1622；Current pHarmaceutical Design 1995，1：441-468；Circulation 1994，
90：1522-1536)。例如，肝素是在需要急性抗凝血时肠胃外给药的首选药物。
肝素由一种动物来源的粘多糖组成。标准的或高分子量的肝素(HMWHs)
由许多大小不同的分子组成，而降解的或低分子量肝素(LMWHs)的分子
量为4000-6000D。

使用肝素有一些缺点，即(1)肝素是一种需要静脉或皮下给药的肠胃外药
物；(2)肝素的抗凝血剂剂量反应曲线是非线性的，体外凝血参数(APTT)
必须跟踪监测抗凝血的程度；(3)肝素对抑制凝块结合的凝血酶无效；(4)有报
导在停止肝素治疗之后，又出现不稳定的心绞痛的“反跳”，而且肝素与血
小板减少有关，需要监测血小板计数。肝素诱导的血小板减少症(HIT)是
一种免疫球蛋白介导的药物副反应，其特征是血小板活化、血小板减少和正
接受或最近接受肝素治疗的患者中有高危血栓并发症。

在静脉血栓形成或肺栓塞病例中，肠胃外肝素给药7-10天疗程通常是
继之以长时间给予目前通用的口服抗凝血药物华法令(Warfarin)；以延长对
血栓并发症的治疗。在停止肝素治疗之前，肝素一般与华法令共同给药数天。

华法令有一些缺点(The Annals of pHarmacotherapy 1995，29：1274-1282；
Clin.pHarmacokinet.1996，30：416-444)，即(1)它有出血的危险；(2)有不良
的药物和饮食之间的相互作用；(3)需要经常性监测。

肝素和华法令均系间接抗凝血剂，它们的功能分别取决于抗凝血酶和维
生素K的存在。因此，在停止华法令治疗后，需等待依赖维生素K的凝血
因子通过肝脏重新合成，以恢复止血平衡。这些缺点阻碍了医生接受和使用
华法令来治疗血栓病。

在过去的二十余年中，常规的抗凝血剂治疗的不利条件促使人们开发新
的抗凝血剂。1976年发现低分子量肝素具有与肝素相似的效果。由于它们
良好的药物动力学分布和危险/比率，自1992年起欧洲广泛使用，最近获准
在美国使用。

新的抗凝血剂方法基于在凝血阶段直接抑制关键酶。作为凝血阶段中的
最终酶，凝血酶已是广泛测试的对象。血栓过程的关键调节剂凝血酶是胰蛋
白样的丝氨酸蛋白酶。凝血酶有多种多样的生物功能，但其主要作用是催化
血纤维蛋白原转化为血纤维蛋白，不论凝血酶溶于血浆还是与血纤维蛋白结
合。通过激活的血因子XIII的作用，然后血纤维蛋白聚合和交联形成不溶
解的血块。凝血酶还激活血因子V和VIII，再经反馈机制加速血液凝固。作
为一种强的血小板激活剂，在动脉循环中，凝血酶还在激发富集血小板的血
栓的生长中起重要作用。当凝血酶被抑制时可中断血纤维蛋白沉积和血小板
聚集。然而凝血酶与在人体中，尤其是血液中存在的许多丝氨酸蛋白酶(如
纤溶酶)相似。因此，需要一种对凝血酶具有特异性的凝血酶抑制剂。

凝血酶抑制剂可通过与凝血酶活性部位和/或血纤维蛋白原藉此转化为
血纤维蛋白的血纤维蛋白原识别外部位(FRE)结合直接使凝血酶失活，。
例如，水蛭素是一种天然存在的63-氨基酸抗凝血剂，它是在吸血水蛭(Hirudo
medicinalis)的唾液腺中产生的。水蛭素通过直接与凝血酶活性部位和FRE
结合来抑制凝血酶，其对凝血酶的抑制常数(Ki)值为2.0×10^-15M
(Biochemistry 1986，25：4622-4628)。Hirugen是一个从水蛭素的阴离子羧基
端衍生的肽，只与凝血酶的FRE结合，其Ki值为1.44×10^-7M(J.Biol.Chem.
1989，264：8692-8698)。Hirulogs或Bivalirudin是一种合成肽，由一种与FRE
结合的Hirugen样的序列经一个甘氨酸-间隔区连接底物样活性部位结合部
分，D-苯丙氨酸-脯氨酰-精氨酸，连接组成，其Ki值为2.3×10^-9M。

除了在出血并发症方面有稍好的安全性外，上述直接的凝血酶抑制剂没
有显示比肝素有较好，甚至更差的特点，即(1)半衰期相对短；(2)肠胃外给
药；(3)无成本效益。

美国专利4,258,192和4,201,863披露了一种合成的小分子凝血酶抑制
剂，对人凝血酶的Ki值为1.9×10^-10M，其商品名为Argatroban(Novastan，
Mitsubishi Chemical Corp Cardiovasc.Drug Rev.1991，9：247-263)。对抗凝血
酶III(ATIII)缺乏的患者和有HIT危险的患者作为肝素的替代物，Argatroban
用于治疗慢性动脉阻塞、急性局部缺血性中风和血液透析。但由于以下问题
Argatroban仍不是一种理想的小分子凝血酶抑制剂：(1)无口服生物药效；
(2)对静脉血栓形成的作用比对动脉血栓形成的作用差；(3)可能有剂量依赖
性；(4)凝血酶再结合作用；(5)对治疗不稳定的心绞痛、冠状动脉血管成形
术和急性心肌梗塞不比肝素更有效。

因此，提供一种口服有效的凝血酶抑制剂是极为理想的。人们对口服生
物药效的凝血酶抑制剂的兴趣甚高(Am.J.Cardiol.1995，75：27B-33B)。如
上所述，一种有选择性并可逆地抑制凝血酶的小分子凝血酶活性部位抑制剂
在副作用和监测方面明显优于华法令。与华法令相比，凝血酶抑制剂的选择
性使其在治疗动脉和静脉血栓中有相对的安全性。小分子凝血酶抑制剂的另
一明显优点或许对抑制血块结合的凝血酶及流动相凝血酶具有潜在重要的能
力。

发明的概要

本发明的目的是提供一种口服有效的、特异的凝血酶抑制剂。

根据本发明提供具有下列结构式I的化合物：

或药学上可接受的盐或其立体异构体，其中R¹、R²和R⁴代表氢、烷基
或芳基部分，R³由烷基或芳基部分组成，R⁵代表氢、烷基、芳基、氢芳基、
杂芳基、氢杂芳基、磺酰烷基、磺酰芳基、磺酰氢芳基、磺酰杂芳基或磺酰
氢杂芳基部分，R⁶代表氢、烷基、芳基、氢芳基、杂芳基或氢杂芳基部分。
这种化合物抑制凝血酶或血凝固，还可用作一种抗血栓剂或抗凝血剂。

例如，R⁵代表烷基、芳基、氢芳基、杂芳基或氢杂芳基部分。尤其是R¹、
R²和R⁴代表氢部分，R³可由甲基部分组成，R⁵代表1，2，3，4-四氢-3-甲基-8-
喹啉磺酰基，R⁶代表3-胍丙基。这种化合物具有高的抑制常数(Ki为5.3×
10^-15M)。

根据本发明，进一步提供一种药物成分包括一种象活性组分那样的化合
物，与一种药学上可接受的载体结合。药物成分适合口服给药。活性组分可
用于，如片剂、胶囊、溶液或悬浮液成分中(约含5-500mg/结构式I的化合
物或混合物的剂量单位)。化合物可以常规方法与生理上可接受的赋形剂或
载体结合，包括合适的应急药物、结合剂、防腐剂、稳定剂、香料等，如在
制药实践中接受的那样。

根据本发明，进一步提供一种方法基本上阻止哺乳动物或人或其组织中
的凝血酶活性。该方法包括对哺乳动物、人或组织给与有效剂量的这种化合
物或药物成分。

根据本发明，进一步提供一种治疗哺乳动物或人或其组织中的凝血障碍
的方法。该方法包括对哺乳动物、人或组织给与有效剂量的化合物或药物成
分。凝血障碍的例子包括血栓形成或肝素诱导的血小板减少(HIT)。

本发明的化合物可对已知血栓障碍的各种哺乳动物，如人、猫、狗、猴、
鼠以及类似物口服给药，有效剂量范围为0.1-100mg/kg，约0.2-50mg/kg较
好，约0.5-25mg/kg最好，以单剂量或日剂量分为2-4次方法。

虽然本发明的结构式I的化合物抑制凝血酶，且可用作抗凝血剂，但还
可与其他抗血栓或抗凝血药物结合使用。

本发明的化合物包括对一种二酮哌啶结构附加环和取代，且与已知的二
酮哌啶衍生物相比更坚固。

与抗凝血剂药物如肝素、华法令、水蛭素、Hirugen、Hirulogs和Argatroban
相比，本发明的化合物通过与凝血酶特异结合来抑制血凝固。与肝素相反，
本发明的化合物具有口服生物药效，半衰期增加，对静脉血栓形成有效，对
凝血酶有限制或没有“反跳”作用。本发明的化合物还降低了HIT的危险。

对本发明目的，下列术语解释如下：

术语“烷基”是指在18碳范围以内的直链或支链基团或环状环，最好
是1-8碳，例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、
癸基、十一烷基、十二烷基及其各种支链异构体，和/或1或2个以下取代
基：芳基取代基(例如，形成苄基或苯乙基)，环烷基取代基，烷环烷基取
代基，链烯基取代基，炔基取代基、羟基、烷氧基、卤基、氨基、烷氨基、
二烷氨基、胍基或羧基取代基。

术语“芳基”意指环部分中含6-14碳的单环、双环或三环芳基，例如
苯基、萘基或蒽基。芳基部分可包括取代的芳基，其可有1或2个取代基，
例如烷基、氰基、氨基、烷氨基、二烷氨基、硝基、羧基、羰烷氧基、三氟
甲基、卤基、烷氧基、芳烷氧基或羟基。

术语“氢芳基”意指10-14元芳基环，例如四氢萘基、四氢蒽基和类似
物。氢芳基可包括取代的氢芳基，其可有1或2个取代基，例如烷基、氰基、
氨基、烷氨基、二烷氨基、硝基、羧基、羰烷氧基、三氟甲基、卤基、烷氧
基、芳烷氧基或羟基。

术语“杂芳基”意指包括1，2或3个杂原子(如氮、氧或硫)的5-14
元芳基环，例如：

和类似物。杂芳基环可任意与如以前所说明的芳基环稠合。杂芳基环可包括
1个取代的杂芳基，其可有1或2个取代基，例如烷基、氰基、氨基、烷氨
基、二烷氨基、硝基、羧基、羰烷氧基、三氟甲基、卤基、烷氧基、芳烷氧基
或羟基。

术语“氢杂芳基”意指上述杂芳基环的还原形式，例如：

和类似物。氢杂芳基环可任意与如以前所说明的芳基环稠合。氢杂芳基环可
包括取代的氢杂芳基，其可有1或2个取代基，例如烷基、氰基、氨基、烷
氨基、二烷氧基、硝基、羧基、羰烷氧基、三氟甲基、卤基、烷氧基、芳烷
氧基或羟基。

术语“磺酰烷基”意指一个磺酰基(SO₂)，连上一个如以前所说明的烷
基。

术语“磺酰烷基”意指一个磺酰基(SO₂)，连上一个如以前所说明的芳
基。

术语“磺酰氢芳基”意指一个磺酰基(SO₂)，连上一个如以前所说明的
氢芳基。

术语“磺酰杂芳基”意指一个磺酰基(SO₂)，连上一个如以前所说明的
杂芳基。

术语“磺酰氢杂芳基”意指一个磺酰基(SO₂)，连上一个如以前所说明
的氢杂芳基。

通过游离碱基与酸(例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、硫酸、磷酸、
乙酸、柠檬酸、马来酸、琥珀酸、乳酸、酒石酸、葡糖酸、苯甲酸、甲磺酸、
乙磺酸、苯磺酸、P-甲苯磺酸或类似物)反应，从本发明的结构式I的化合
物可得到一种药学上可接受的酸盐。

附图说明

图1表示用化合物Cycloargatroban(结构式I，R¹、R²和R⁴是氢，R³是
甲基，R⁵是1，2，3，4-四氢-3-甲基-8-喹啉磺酰基和R⁶是3-胍丙基)，在底物浓
度([s])为2.5μm时体内测定凝血酶抑制作用的累进曲线。

图2表示用化合物Cycloargatroban(结构式I，R¹、R²和R⁴是氢，R³是
甲基，R⁵是1，2，3，4-四氢-3-甲基-8-喹啉磺酰基和R⁶是3-胍丙基)，在底物浓
度([s])为10μm时体内测定凝血酶抑制作用的累进曲线。

图3表示用化合物Cycloargatroban(结构式I，R¹、R²和R⁴是氢，R³是
甲基，R⁵是1，2，3，4-四氢-3-甲基-8-喹啉磺酰基和R⁶是3-胍丙基)，在底物浓
度([s])为22μm时体内测定胰蛋白酶抑制作用的累进曲线。

图4表示用化合物Cycloargatroban(结构式I，R¹、R²和R⁴是氢，R³是
甲基，R⁵是1，2，3，4-四氢-3-甲基-8-喹啉磺酰基和R⁶是3-胍丙基)，运用体内
动力学测定法测定凝血酶抑制常数(Ki)。

图5表示用化合物Cycloargatroban(结构式I，R¹、R²和R⁴是氢，R³是
甲基，R⁵是1，2，3，4-四氢-3-甲基-8-喹啉磺酰基和R⁶是3-胍丙基)和具有结
构XIII所示化学成分的对照化合物argatroban的体外凝血测定。

发明的详细描述

根据本发明，提供的化合物可在哺乳动物体外和体内用作强效和特异性
的凝血酶和血凝固抑制剂。

本发明包括结构式I的二酮哌嗪衍生物的制备：

可按照下列反应步骤I制备本发明的结构式I的化合物：

氨基酸II用叔-丁氧羰基(BOC)保护，采用在含10％三乙胺(TEA)
的甲醇中与二-叔-丁基碳酸酯反应，或用苄氧羰基(Cbz)保护，采用在有
机溶剂(如二噁烷、四氢呋喃或乙醚)中与苄基氯甲酸酯和氢氧化钠水溶液
反应。在二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)或2-(1H-
苯三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)和4-二甲氨基吡啶
(DMAP)或N-羟基苯三唑(HOBT)存在下，在惰性有机溶剂，如二甲酰
胺(DMF)、N-甲基吡咯二酮(NMP)、二氯甲烷(DCM)或四氢呋喃(THF)
中，在-20℃～-5℃温度范围内，被保护的氨基酸III被酯化，通过偶联反应
与乙醇生成酯IV。

在干燥惰性溶剂，如DCM、THF、乙酸乙酯或氯仿中，用三氟乙酸或
盐酸处理对酯IV去保护(BOC)，或在室温下，在醇溶剂中用钯炭进行氢化
去保护(Cbz)。

或者，在0℃-20℃温度范围内，在氨基酸II的醇溶液中加氯化亚砜，
然后用碱(如碳酸氢钠或碳酸钾和类似物)中和，可制备酯V。在偶合剂(如
DCC、DIC或TBTU，和DMAP或HOBT)，和叔胺有机碱(如TEA或二异
丙基乙胺)存在下。

在惰性有机溶剂(如DMF、NMP、THF或DCM)中，在0℃-20℃范围
内，酯V与被保护的氨基酸衍生物VI进行偶合反应生成肽VII。在哌啶或
二乙胺存在下，在惰性有机溶剂(如DMF、NMP、DCM或THF)中，室
温下，肽VII被去保护并环化(FMOC)。或在干燥惰性溶剂，如DCM、THF、
乙酸乙酯或氯仿中，用TFA或盐酸处理进行去保护(BOC)，或在室温下，
在醇溶剂中用钯炭进行氢化去保护(Cbz)，然后加碱环化。在0℃干燥的THF
溶剂中，用氨化有机碱，如二(三甲硅烷基)氨化锂(LHMDs)或二异丙
基氨化基(LDA)处理二酮哌嗪VIII，再在0℃-20℃添加烷化剂IX得到二
酮哌嗪I。

按照下列反应步骤II也可制备本发明的结构式I的化合物：

室温条件下，在干燥惰性溶剂(如DCM、THF、乙酸乙酯或氯仿)中，
用TFA或HCl处理对肽VII(其中PG是BOC或Cbz)进行去保护(BOC)，
或在醇溶剂用钯炭进行氢化(Cbz)。在叔胺有机碱(如吡啶、TEA或DIPEA)
存在下，在干燥惰性溶剂(如DCM、THF或氯仿)中，室温下肽X与烷化
剂IX进行反应生成肽XI。在醇溶剂(如甲醇或乙醇)中，用碱金属碱(如
氢氧化钠或氢氧化锂)处理将肽XI的酯进行水解。反应混合物用盐酸或硫
酸酸化，生成酸XII。

在TBTU、HOBT、DIPEA存在下，在惰性有机溶剂(如DMF、NMP、
THF或DCM)中，室温下酸XII进行分子内环化反应，生成二酮哌嗪I。

本发明的结构式I的化合物，其中R⁶是：

Y是烷基、芳基、氢芳基、杂芳基或氢杂芳基部分，可按照下列反应步
骤III制备：

二酮哌嗪I是按照下列反应步骤I或II制备的，其中R⁶是：

在干燥惰性溶剂如DCM、THF、乙酸乙酯或氯仿中，用TFA或盐酸处
理去保护(BOC、三苯甲基和类似物)，或室温下在醇溶剂中用钯炭进行氢
化(Cbz)。在胍化剂XIV(如N，N′-双-(叔-丁氧羰基)-N″-三氟甲烷磺酰胍，
1-[N，N′-双(叔-丁氧羰基)酰胺]吡唑或N，N′-双-(叔-丁氧羰基)-S-甲基异硫脲和
叔胺有机碱(如TEA或DIPEA)存在下，在惰性有机溶剂(如DMF、NMP、
THF或DCM)中，室温下，对二酮哌嗪XIII进行胍化，生成一种被保护的、
胍化的二酮哌嗪XV。

在干燥惰性溶剂(如DCM、THF、乙酸乙酯或氯仿)中，室温下用TFA
或盐酸对二酮哌嗪XV去保护，生成二酮哌嗪I，其中R⁶是

本发明的结构式I的化合物(其中R⁵是氢杂芳基)，可按照下列反应步
骤IV制备。

按照反应步骤II制备酸XII，其中R⁵是芳基部分，且在一种含金属(如
钯炭、铂、铑或镍)的催化剂存在下进行还原反应，在温度20℃-100℃内，
压力1-100大气压形成酸XII，其中R⁵是氢杂芳基部分。酸XII(其中R⁵是
氢杂芳基)在惰性有机溶剂(如DMF、NMP、THF或DCM)中，在偶联
剂TBTU、HOBT和DIPEA存在下，室温中进行分子内环化反应，生成二
酮哌嗪I，其中R⁵是氢杂芳基。

通过下列实施例更易理解本发明，这些例子是说明本发明，而不是限制
其范围。

实施例1 N-(叔-丁氧羰基)-D-2-哌啶羧酸，烯丙酯

N-(叔-丁氧羰基)-D-2-哌啶羧酸(2.0g，8.7mmol，BACHEM公司)溶解
于二氯甲烷(40ml)，冷却到-20℃，加入烯丙醇(1.0ml，15.0mmol，Aldrich
公司)、二环己基碳二亚胺(1.8g，8.7mmol，Aldrich公司)和4-二甲氨基
吡啶(0.11g，0.87mmol，Aldrich公司)，反应混合液在-5℃和-10℃之间搅
拌4小时。过滤除去副产物脲后，反应混合液减压浓缩。得到的油用100克
硅胶层析，用15∶1己烷/乙酸乙酯洗脱，得到题述的化合物为一种清晰、无
色的液体(2.33克，99％)。

实施例2 (2R，4R)-N-(叔-丁氧羰基)-4-甲基-2-哌啶羧酸，烯丙酯

(2R，4R)-4-甲基-2-哌啶羧酸(250mg，1.75mmol)溶解于含10％三乙胺
的甲醇30ml中，冷却到0℃，加入二-叔-丁基碳酸酯钠(0.48ml，2.10mmol，
Aldrich公司)，2小时后反应混合液减压浓缩，加入磷酸二氢钠10mg。残余
物溶解于1∶1乙酸乙酯/水(10ml)，用1N盐酸调节溶液pH值至2.0。混合
液用乙酸乙酯(4×20ml)提取，合并的有机提取物用无水硫酸钠干燥，减
压浓缩。得到的白色固体溶解于二氯甲烷(8ml)中，冷却到-20℃。加入烯
丙醇(0.20ml，2.98mmol，Aldrich公司)、二环己基碳二亚胺(361mg，
1.75mmol，Aldrich公司)和4-二甲基氨基吡啶(22mg，0.18mmol，Aldrich
公司)，反应混合液在-5℃和-10℃之间搅拌5小时。过滤除去副产物脲后，
反应混合液减压浓缩。得到的油用10克硅胶层析，用9∶1己烷/乙酸乙酯洗
脱，得到题述的化合物为一种清晰、无色的液体(457mg，92％)。

实施例3 (3S，6R)-二环[4.4.0]-1，4-二氮-3-[(4-硝苯基)甲基]-4-N-(4-叔-
丁苯磺酰基)-2，5-癸二酮，三氟乙酸盐

3A)1-[N^α-(9-芴甲氧羰氧基)-L-4-硝基苯丙氨酰]-D-2-哌啶羧酸，烯丙酯

实施例1的2-哌啶酯(259mg，0.96mmol)溶解于1∶1三氟乙酸/二氯甲
烷(5ml)，搅拌3小时。反应混合液减压浓缩，置于真空泵过夜。得到的油
溶解于二甲基甲酰胺(5ml)，冷却到0℃，加入二异丙基乙胺(0.50ml，
2.88mmol，Aldrich公司)。搅拌5分钟后，加入N^α-(9-芴甲氧羰氧基)-L-4-硝
基苯丙氨酸(500mg，1.16mmol，Novabiochem公司)，N-羟基苯并三唑
(205mg，1.34mmol，Nobaviochem公司)和2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-
四甲基脲四氟硼酸盐(430mg，1.34mmol，Novabiochem公司)。反应混合
液搅拌72小时，倾入乙酸乙酯(125ml)中，用10％盐酸(2×25ml)、饱和
的碳酸氢钠溶液(2×25ml)和盐水(25ml)洗涤。有机层用无水硫酸钠干
燥，减压浓缩。得到的油用50克硅胶层析，用7∶3己烷/乙酸乙酯洗脱，得
到题述的化合物为一种白色固体(457mg，82％)。

3B)(3S，6R)-二环[4.4.0]-1，4二氮-3[(4-硝苯基)甲基]-2，5-癸二酮

将哌啶(1.68ml，17.0mmol，Aldrich公司)加入到含3A部分的酯(200mg，
0.34mmol)的二氯甲烷(68ml)溶液中，反应混合液搅拌1小时。反应混合
液减压浓缩。得到的油用20g硅胶层析，用19∶1二氯甲烷/甲醇洗脱，得到
题述的化合物为一种淡黄色固体(69mg，67％)。

3C)(3S，6R-二环[4.4.0]-1，4-二氮-3[(4-硝苯基)甲基]-4-N-(4-叔-丁苯磺酰
基)-2，5-癸二酮，三氟乙酸盐

在0℃，氮气保护下，将1.0M二(三甲硅烷基)氨化锂溶于四氢呋喃，
(0.090ml，0.090mmol，Aldrich公司)加入到含3B部分的二酮哌嗪(20mg，
0.066mmol)的无水四氢呋喃(1ml，Aldrich公司)溶液中，反应混合液搅
拌1小时。一次性加入4-叔-丁基苯磺酰氯(23mg，0.10mmol)，混合液于
室温搅拌2小时。加入盐水(5ml)，反应混合液用乙酸乙酯(3×10ml)提
取。合并的有机提取物用无水硫酸钠干燥，减压浓缩。得到的油用25克硅
胶层析，先用9∶1己烷/乙酸乙酯，然后用7∶3己烷/乙酸乙酯洗脱，得到题述
的化合物为一种白色固体(23mg，70％)：质谱(EI)：(M⁺)于499。

实施例4 (3S，6R)-二环[4.4.0]-1，4-二氮-3-(3-胍丙基)-4-N-(4-叔-丁苯磺
酰基)-2，5-癸二酮，三氟乙酸盐

4A)1-[N^γ-(4-三苯甲基)-N^α-(9-芴甲氧羰氧基)-L-鸟氨酰]-D-2-哌啶羧酸，
烯丙酯

实施例1的2-哌啶酯(500mg，1.86mmol)溶解于1∶1三氟乙酸/二氯
甲烷(8ml)，搅拌3小时。反应混合液减压浓缩，置真空泵过夜。得到的油
溶解于二甲基甲酰胺(8ml)，冷却到0℃，加入二异丙基乙胺(0.97ml，
5.58mmol，Aldrich公司)。搅拌5分钟后，加入N^γ-(4-三苯甲基)-N^α-(9-芴甲
氧羰氧基)-L-鸟氨酸(1.36g，2.23mmol，Novabiochem公司)，N-羟基苯并
三唑(398mg，2.60mmol，Novabiochem公司)和2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-
四甲基脲四氟硼酸盐(835mg，2.60mmol，Novabiochem公司)。反应混合
液搅拌96小时，倾入乙酸乙酯(125ml)中，用10％盐酸(2×25ml)、饱和
的碳酸氢钠(2×25ml)和盐水(25ml)洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，
减压浓缩。得到的油用75克硅胶层析，用3∶1己烷/乙酸乙酯洗脱，得到题
述的化合物为一种白色固体(1.22g，86％)。

4B)(3S-6R)-二环[4.4.0]-1，4-二氮-3-(3-N-(4-三苯甲基)胺丙基)-2，5-癸二
酮

将哌啶(3.26ml，33.0mmol，Aldrich公司)加入到含4A部分的酯(500mg，
0.66mmol)的二氯甲烷(132ml)溶液中，反应混合液搅拌3小时。反应混
合液减压浓缩。得到的油用40克硅胶层析，用1∶1己烷/乙酸乙酯洗脱，得
到题述的化合物为一种白色固体(288mg，91％)。

4C)(3S，6R)-二环[4.4.0]-1，4-二氮-3-(3-N-(4-三苯甲基)胺丙基)-4-N-(4-叔-
丁苯磺酰基)-2，5-癸二酮

在0℃，氮气保护下，将1.0M二(三甲硅烷基)氨化锂溶于四氢呋喃
(0.42ml，0.42mmol，Aldrich公司)，加入到含4B部分的二酮哌嗪(150mg，
0.30mmol)的无水四氢呋喃(5ml，Aldrich公司)溶液中，反应混合液搅拌
1小时。一次性加入4-叔-丁基苯磺酰氯(109mg，0.47mmol)，混合液于室
温搅拌2小时。加入盐水(10ml)，反应混合液用乙酸乙酯(3×20ml)提取。
合并的有机提取物用无水硫酸钠干燥，减压浓缩。得到的油用25克硅胶层
析，先用9∶1己烷/乙酸乙酯，然后用7∶3己烷/乙酸乙酯洗脱，得到题述的化
合物为一种白色固体(135mg，64％)。

4D)(3S，6R)-二环[4.4.0]-1，4-二氮-3(3-N，N′-(二-叔-丁氧羰基)胍丙基)-4-
N-(4-叔-丁苯磺酰基)-2，5-癸二酮

4C部分的二酮哌嗪(296mg，0.44mmol)溶解于含1％三氟乙酸的二氯
甲烷(30ml)中，搅拌30分钟。反应混合液减压浓缩，得到的油用25克硅
胶层析，先用1∶1己烷/乙酸乙酯，然后用4∶1二氯甲烷/甲醇洗脱，冷冻干燥
得到的(3S，6R)-二环[4.4.0]-1，4-二氮-3-(3-氨丙基)-4-N-(4-叔-丁苯磺酰基)-2，5-
癸二酮，三氟乙酸盐为一种白色固体。

在上述含胺的二氯甲烷(10ml)溶液中加入三乙胺(0.061ml，0.44mmol，
Aldrich公司)和N，N′-二-叔-丁氧基-N″-三氟甲烷磺酰基胍(157mg，
0.40mmol，Journal of Organic Chemistry 63(12)：3804-3805(1998))。搅拌12
小时后，反应混合液倾入二氯甲烷(50ml)中，用1M硫酸氢钠溶液(10ml)，
5％碳酸氢钠溶液(10ml)和水(10ml)洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，
减压浓缩。得到的油用20克硅胶层析，先用9∶1己烷/乙酸乙酯，然后用1∶1
己烷/乙酸乙酯洗脱，得到题述的合物为一种白色固体(239mg，93％)。

4E)(3S，6R)-二环[4.4.0]-1，4-二氮-3-(3-胍丙基)-4-N-(4-叔-丁苯磺酰基)-
2，5-癸二酮，三氟乙酸盐

4D部分的二酮哌嗪(100mg，0.16mmol)溶液溶解于1∶1三氟乙酸/二
氯甲烷(2ml)中，搅拌1小时，反应混合液减压浓缩。得到的油用5克硅
胶层析，先用19∶1二氯甲烷/甲醇，然后用9∶1二氯甲烷/甲醇洗脱，冷冻干
燥得到题述的化合物为一种白色固体(88mg，96％)。电喷雾质谱：(M+H⁺)
于464.5。

实施例5 (3S，6R)-二环[4.4.0]-1，4-二氮-3-(4-胍丁基)-4-N-(4-叔-丁苯磺
酰基)-2，5-癸二酮，三氟乙酸盐

5A)1-[N^ε-(4-三苯甲基)-N^α-(9-芴甲氧羰氧基)-L-赖氨酰]-D-2-哌啶羧酸，
烯丙酯

将实施例1的2-哌啶酯(253g，0.94mmol)溶解于1∶1三氟乙酸/二氯
甲烷(5ml)中，搅拌2小时。反应混合液减压浓缩，置真空泵过夜。得到
的油溶解于二甲基甲酰胺(5ml)中，冷却到0℃，加入二异丙基乙胺(0.49ml，
2.82mmol，Aldrich公司)。搅拌5分钟后，加入N^ε-(4-三苯甲基)-N^α-(9-芴甲
氧羰氧基)-L-赖氨酸(706mg，1.13mmol，Novabiochem公司)、N-羟基苯并
三唑(202mg，1.32mmol，Novabiochem公司)和2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-
四甲基脲四氟硼酸盐(424mg，1.32mmol，Novabiochem公司)。反应混合
液搅拌72小时，倾入乙酸乙酯(125ml)中，用10％盐酸(2×25ml)，饱和
的碳酸氢钠溶液(2×25ml)和盐水(25ml)洗涤。有机层用无水硫酸钠干
燥，减压浓缩。得到的的油用50克硅胶层析，用3∶1己烷/乙酸乙酯洗脱，
得到题述的化合物为一种白色固体(605mg，83％)。

5B)(3S，6R)-二环[4.4.0]-1，4-二氮-3-(4-N-(4-三苯甲基)丁基)-2，5-癸二酮

将哌啶(1.58ml，16.0mmol，Aldrich公司)加入到含5A部分酯(250mg，
0.32mmol)的二氯甲烷(64ml)溶液中，反应混合液搅拌2小时。反应混合
液减压浓缩。得到的油用25克硅胶层析，用乙酸乙酯洗脱，得到题述的化
合物为一种白色固体(149mg，94％)。

5C)(3S，6R)-二环[4.4.0]-1，4-二氮-3-(4-N-(4-三苯甲基)丁基)-4-N-(4-叔-丁
苯磺酰基)-2，5-癸二酮

在0℃，氮气保护下，将1.0M二(三甲硅烷基)氨化锂溶于四氢呋喃
(0.14ml，0.14mmol，Aldrich公司)，加入到含5B部分的二酮哌嗪(50mg，
0.10mmol)的无水四氢呋喃(1.5ml，Aldrich公司)溶液中，反应混合液搅
拌1小时。一次性加入4-叔-丁基苯磺酰氯(35mg，0.15mmol)，混合液于
室温搅拌2小时。加入盐水(5ml)，反应混合液用乙酸乙酯(3×10ml)提
取。合并的有机提取物用无水硫酸钠干燥，减压浓缩。得到的油用10克硅
胶层析，先用9∶1己烷/乙酸乙酯，然后用7∶3己烷/乙酸乙酯洗脱，得到题述
的化合物为一种白色固体(47mg，68％)。

5D)(3S，6R)-二环[4.4.0]-1，4-二氮-3-(4-氨丁基)-4-N-(4-叔-丁苯磺酰基)-
2，5-癸二酮，三氟乙酸盐

5C部分的二酮哌嗪(57mg，0.082mmol)溶解于含1％三氟乙酸的二氯
甲烷(2ml)中，搅拌15分钟。反应混合液减压浓缩，得到的油用2克硅胶
层析，先用1∶1己烷/乙酸乙酯，然后用甲醇洗脱，冷冻干燥得到题述的化合
物为一种白色固体(40mg，89％)。

5E)(3S，6R)-二环[4.4.0]-1，4-二氮-3-(4-N，N′-(二-叔-丁氧羰基)胍丁基)-4-
N-(4-叔-丁苯磺酰基)-2，5-癸二酮

在含5D部分的胺(40mg，0.073mmol)的二氯甲烷(5ml)溶液中加入
三乙胺(0.011ml，0.082mmol，Aldrich公司)和N，N′-二-叔-丁氧基-N″-三
氟甲烷磺酰基胍(29mg，0.074mmol，Journal of Organic Chemistry 63
(12)：3804-3805(1998))。搅拌12小时后，反应混合液倾入二氯甲烷(25ml)
中，用1M硫酸氢钠溶液(5ml)、5％碳酸氢钠(5ml)和水(5ml)洗涤。
有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩。得到的油用5克硅胶层析，先用9∶1
己烷/乙酸乙酯，然后用1∶1己烷/乙酸乙酯洗脱，得到题述的化合物为一种
白色固体(35mg，71％)。

5F)(3S，6R)-二环-[4.4.0]-1，4-二氮-3(4-胍丁基)-4-N-(4-叔-丁苯磺酰基)-
2，5-癸二酮，三氟乙酸盐

5E部分的二酮哌嗪(35mg，0.052mmol)的溶液溶解于1∶1三氟乙酸/
二氯甲烷(1ml)中，搅拌1小时，反应混合液减压浓缩。得到的油用4克
硅胶层析，先用19∶1二氯甲烷/甲醇，然后用9∶1二氯甲烷/甲醇洗脱，得到
题述的化合物为一种白色固体(28mg，90％)。电喷雾质谱：(M+H⁺)@478.0。

实施例6 (3S，6R)-二环-[4.4.0]-1，4-二氮-3(3-胍丙基)-4-N-(3-甲基-8-喹
啉磺酰基)-2，5-癸二酮，盐酸盐

6A)(3S，6R)-二环-[4.4.0]-1，4-二氮-3(3-N-(4-三苯甲基)胺丙基)-4-N-(3-甲
基-8-喹啉磺酰基)-2，5-癸二酮

在0℃，氮气保护下，将1.0M二(三甲硅烷基)氨化锂溶于四氢呋喃
(0.88ml，0.88mmol，Aldrich公司)，加入到含实施例4B部分的二酮哌嗪
(350mg，0.73mmol)的无水四氢呋喃(12ml，Aldrich公司)溶液中，反
应混合液搅拌1小时。一次性加入3-甲基-8-喹啉磺酰氯(168mg，0.69mmol)，
混合液于室温搅拌2小时，加入盐水(15ml)，反应混合液用乙酸乙酯(3×
25ml)提取。合并有机提取物用无水硫酸钠干燥，减压浓缩。得到的油用35
克硅胶层析，用1∶1己烷/乙酸乙酯洗脱，得到题述的化合物为一种白色固体
(304mg，64％)。

6B)(3S，6R)-二环-[4.4.0]-1，4-二氮-3(3-胺丙基)-4-N-(3-甲基-8-喹啉磺酰
基)-2，5-癸二酮，三氟乙酸盐

6A部分的二酮哌嗪(304mg，0.44mmol)溶解于含1％三氟乙酸的二氯
甲烷(30ml)中，搅拌30分钟。反应混合液减压浓缩，得到的油用25克硅
胶层析，先用1∶1己烷/乙酸乙酯，然后用4∶1二氯甲烷/甲醇洗脱，冷冻干燥
得到题述的化合物为一种白色固体(240mg，100％)。

6C)(3S，6R)-二环-[4.4.0]-1，4-二氮-3(3-N，N′-(二-叔-丁氧羰基)胍丙基)-4-
N-(3-甲基-8-喹啉磺酰基)-2，5-癸二酮

在含6B部分的胺(240mg，0.44mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液中加
入三乙胺(0.12ml，0.8mmol，Aldrich公司)和N，N′-二-叔-丁氧基-N″-三氟
甲烷磺酰基胍(164mg，0.42mmol，Journal of Organci Chemistry 63
(12)：3804-3805(1998))。搅拌12小时后，反应混合液倾入二氯甲烷(50ml)
中，用1M硫酸氢钠溶液(10ml)、5％碳酸氢钠溶液(10ml)和水(10ml)
洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩。得到的油用25克硅胶层析，
用1∶1己烷/乙酸乙酯洗脱得到题述的化合物为一种白色固体(216mg，73％)。

6D)(3S，6R)-二环[4.4.0]-1，4-二氮-3-(3-胍丙基)-4-N-(3-甲基-8-喹啉磺酰
基)-2，5-癸二酮，盐酸盐

6C部分的二酮哌嗪(10mg，0.015mmol)溶液溶解于含3N盐酸的乙酸
乙酯(0.27ml)中，搅拌1小时，反应混合液减压浓缩，冷冻干燥得到题述
的化合物为一种白色固体(7mg，88％)。电喷雾质谱：(M+M⁺)@473.5。

实施例7 (3S，6R、8R)-二环[4.4.0]-1，4-二氮-3-(3-胍丙基)-4-N-(3-甲
基-8-喹啉磺酰基)-8-甲基2，5-癸二酮，盐酸盐

7A)(2R，4R)-1-[N^γ-(4-三苯甲基)-N^α-(9-芴甲氧羰氧基)-L-鸟氨酰]-4-甲
基-2-哌啶羧酸，烯丙酯

将实施例2的哌啶酯(406mg，1.43mmol)溶解于1∶1三氟乙酸/二氯甲
烷(7ml)中，搅拌2小时。反应混合液减压浓缩，置真空泵过夜。得到的
油溶解于二甲基甲酰胺(7ml)中，冷却到0℃，加入二异丙基乙胺(0.75ml，
4.29mmol，Aldrich公司)。搅拌5分钟后，加入N^γ-(4-三苯甲基)-N^α-(9-芴甲
氧羰氧基)-L-鸟氨酸](1.05g，1.72mmol，Novabiochem公司)，N-羟基苯并
三唑(306mg，2.00mmol，Novabiochem公司)和2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-
四甲基脲四氟硼酸盐(642mg，2.00mmol，Novabiochem公司)。反应混合
液搅拌72小时，倾入乙酸乙酯(125ml)中，用10％盐酸(2×25ml)，饱和
的碳酸氢钠溶液(2×25ml)和盐水(25ml)洗涤。有机层用无水硫酸钠干
燥，减压浓缩。得到的油用75克硅胶层析，用3∶1己烷/乙酸乙酯洗脱，得
到题述的化合物为一种白色固体(1.05g，95％)。

7B)(3S，6R、8R)-二环[4.4.0]-1，4-二氮-3-(3-N-(4-三苯甲基)胺丙基)-
8-甲基-2，5-癸二酮

在含7A部分的酯(958mg，1.23mmol)的二氯甲烷(246ml)溶液中加
入哌啶(6.1ml，61.7mmol，Aldrich公司)，反应混合液搅拌4小时。反应混
合液减压浓缩，得到的油用65克硅胶层析，先用4∶1己烷/乙酸乙酯，然后
用1∶1己烷/乙酸乙酯洗脱，得到题述的化合物为一种白色固体(520mg，
96％)。

7C)(3S，6R、8R)-二环[4.4.0]-1，4-二氮-3-(3-N-(4-三苯甲基)胺丙基)-4-
N-(3-甲基-8-喹啉磺酰基)-8-甲基-2，5-癸二酮

在0℃，氮气保护下，将1.0M二(三甲硅烷基)氨化锂溶于四氢呋喃
(0.50ml，0.50mmol，Aldrich公司)，加入到含7B部分的二酮派嗪(250mg，
0.50mmol)的无水四氢呋喃(7ml，Aldrich公司)溶液中，反应混合液搅拌
1小时。一次性加入3-甲基-8-喹啉磺酰氯(97mg，0.40mmol)，混合物用于
室温搅拌2小时。加入盐水(7ml)，反应混合液用乙酸乙酯(3×20ml)提
取。合并的有机提取物用无水硫酸钠干燥，减压浓缩。得到的油用25克硅
胶层析，先用3∶1己烷/乙酸乙酯，然后用3∶2己烷/乙酸乙酯洗脱，得到题述
的化合物为一种白色固体(177mg，63％)。

7D)(3S，6R、8R)-二环[4.4.0]-1，4-二氮-3-(3-胺丙基)-4-N-(3-甲基-8-喹啉
磺酰基)-8-甲基-2，5-癸二酮，三氟乙酸盐

7C部分的二酮哌嗪(264mg，0.38mmol)溶解于含1％三氟乙酸的二氯
甲烷(26ml)中，搅拌30分钟。反应混合液减压浓缩，得到油用20克硅胶
层析，先用1∶1己烷/乙酸乙酯，然后用19∶1二氯甲烷/甲醇洗脱，冷冻干燥
得到题述的化合物为一种白色固体(206mg，100％)。

7E)(3S，6R、8R)-二环[4.4.0]-1，4-二氮-3-(3-N，N′-(二-叔-丁氧羰基)胍丙
基)-4-N-(3-甲基-8-喹啉磺酰基)-8-甲基-2，5-癸二酮

在7D部分的胺(206mg，0.38mmol)的二氯甲烷(8ml)溶液中加入三
乙胺(0.053ml，0.38mmol，Aldrich公司)和N，N′-二-叔-丁氧基-N″-三氟
甲烷磺酰基胍(82mg，0.34mmol，Journal of Organic Chemistry 63(12)：3804-
3805(1998))。搅拌12小时后，反应混合液倾入二氯甲烷(50ml)中，用1M
硫酸氢钠溶液(10ml)、5％碳酸氢钠溶液(10ml)和水(10ml)洗涤。有机
层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩。得到的油用15克硅胶层析，用1∶1己烷/
乙酸乙酯洗脱，得到题述的化合物为一种白色固体(140mg，60％)。

7F)(3S，6R，8R)-二环[4.4.0]-1，4-二氮-3-(3-胍丙基)-4-N-(3-甲基-8-喹啉磺
酰基)-8-甲基-2，5-癸二酮，盐酸盐

7E部分的二酮哌嗪(10mg，0.15mmol)溶液溶解于含3N盐酸的乙酸
乙酯(0.27ml)中，搅拌1小时，反应混合液减压浓缩，冷冻干燥得到题述
的化合物为一种白色固体(7.5mg，94％)。电喷雾质谱：(M+H⁺)于487.5。

实施例8 (3S，6R，8R)-二环[4.4.0]-1，4-二氮-3-(3-胍丙基)-4-N-(1，2，3，4-
四氢-3-甲基-8-喹啉磺酰基)-8-甲基-2，5-癸二酮，盐酸盐

8A)(2R，4R)-1-[N^γ(4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰基)-N^α-(叔-丁氧羰
基)-L-精氨酰]-4-甲基-2-哌啶羧酸

将实施例2的哌啶酯(375mg，1.32mmol)溶解于1∶1三氟乙酸/二氯甲
烷(8ml)中，搅拌2小时。反应混合液减压浓缩，置真空泵过夜。得到的
油溶解于二甲基甲酰胺(8ml)中，冷却到0℃，加入二异丙基乙胺(1.15ml，
6.6mmol，Aldrich公司)。搅拌5分钟后，加入N^γ-(4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯
磺酰基)-N^α-(叔-丁氧羰基)-L-精氨酸(769mg，1.58mmol，Novabiochem公司)、
N-羟基苯并三唑(283mg，1.85mmol，Novabiochem公司)和2-(1H-苯并三唑
-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲(594mg，1.85mmol，Novabiochem公司)。反应混合
液搅拌18小时，倾入乙酸乙酯(75ml)中，用10％柠檬酸(2×10ml)、饱
和的碳酸氢钠溶液(2×10ml)和盐水(10ml)洗涤。有机层用无水硫酸钠
干燥，减压浓缩得到(2R，4R)-1-[N^γ-(4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰基)-N^α-(叔
-丁氧羰基)-L-精氨酰]-4-甲基-2-哌啶羧酸、烯丙酯为一种白色泡沫样固体。

从上得到的肽溶解于1∶1三氟乙酸/二氯甲烷(8ml)中，搅拌5分钟。
反应混合液减压浓缩，置真空泵5分钟。得到的油溶解于二氯甲烷(20ml)
中，加入三乙胺(1.8ml，13.2mmol，Aldrich公司)和3-甲基-8-喹啉磺酰氯
(319mg，1.32mmol)。搅拌1小时后，反应混合液倾入二氯甲烷(50ml)
中，用水(15ml)和盐水(15ml)洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓
缩，得到(2R，4R)-1-[N^γ-(4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基)-N^α-(3-甲基-8-喹啉
磺酰基)-L-精氨酰]-4-甲基-2-哌啶羧酸、烯丙酯为一种淡黄色泡沫样固体。

从上得到的肽溶解于无水乙醇(14ml)和1N氢氧化钠溶液(3.6ml)中。
搅拌21小时后，反应混合液用1N盐酸调节至pH7，减压浓缩。得到的残余
物溶解于1∶1乙酸乙酯/水(20ml)中，溶液用1N氢氧化钠调节至pH11，
用乙酸乙酯(2×30ml)提取。水层用1N盐酸调节至pH2，用氯仿(3×50ml)
提取。合并的氯仿提取液用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到题述的化合物
为一种白色泡沫样固体(3步总收率88％，829mg)。

8B)(2R，4R)-1-[N^γ(4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基)-N^α-(1，2，3，4-四氢-3-
甲基-8-喹啉磺酰基)-L-精氨酰]-4-甲基-2-哌啶羧酸

8A部分的酸(100mg，0.14mmol)和含10％钯炭(28mg，Aldrich公司)
的95％乙醇(2ml)的悬浮液和1N盐酸(0.12ml)置15ml密封管内在75
℃-80℃，氢气条件下加热65小时。混合液冷却到室温，过滤、减压浓缩.。
得到的油用15克硅胶层析，先用乙酸乙酯，然后用4∶1二氯甲烷/甲醇洗脱，
得到题述的化合物为一种白色固体(58mg，58％)。

8C)(3S，6R，8R)-二环[4.4.0]-1，4-二氮-3-(3-(N^γ-4-甲氧基-2，3，6-三甲苯
磺酰基)胍丙基)-4-N-(3-甲基-1，2，3，4-四氢-8-喹啉磺酰基)-8-甲基-2，5-癸二酮

在含8B部分的酸(58mg，0.080mmol)的二氯甲烷(16ml)溶液中加入
N-羟基苯并三唑(12mg，0.080mmol，Novabiochem公司)、2-(1H-苯并三唑-1-
基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸盐(26mg，0.080mmol，Novabiochem公司)、
和二异丙基乙胺(0.014ml，0.080mmol，Aldrich公司)。反应混合液搅拌3
小时，倾入乙酸乙酯(30ml)中，用饱和的碳酸氢钠溶液(10ml)和盐水(10ml)
洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩。得到的油用6克硅胶层析，用
1∶4己烷/乙酸乙酯洗脱，冷冻干燥得到题述的化合物为一种白色固体(51mg，
91％)。

8D)(3S，6R，8R)-二环[4.4.0]-1，4-二氮-3-(3-胍丙基)-4-N-(1，2，3，4-四氢-
3-甲基-8-喹啉磺酰基)-8-甲基-2，5-癸二酮，盐酸盐

8C部分的二酮哌嗪(36mg，0.051mmol)溶解于1∶1三氟乙酸/二氯甲
烷(4ml)中，搅拌20小时，减压浓缩。得到的油溶解于含3N盐酸的乙酸
乙酯(4ml)中，搅拌1小时，减压浓缩。得到的油用2克硅胶层析，先用
乙酸乙酯洗脱，然后用甲醇洗脱，冷冻干燥得到题述的化合物为一种白色固
体(20mg，74％)。电喷雾质谱：(M+H⁺)于491.5。

实施例9 Cycloargatroban(分子式I)的生物学测定，其中R¹、R²和
R⁴是氢，R³是甲基，R⁵是1，2，3，4-四氢-3-甲基-8-喹啉磺酸基和R⁶是3-胍丙
基

本发明的活性和选择性可通过测定丝氨酸蛋白酶，如凝血酶、胰蛋白酶
和溶解血纤维蛋白的酶，如尿激酶、纤溶酶和组织纤溶酶原激活物(tPA)
的抑制常数(Ki)来鉴定。所有的酶购自Sigma公司。一般测定条件如下：
荧光的底物溶解于DMSO中，用含50mM Tris-HCl(pH7.8，25℃)、0.1M NaCl
和0.1％聚乙二醇8000的测定缓冲液稀释。对凝血酶，荧光的底物为Tos-
Gly-Pro-Arg-AMC(Sigma公司，Km＝4.0μM，25℃，pH7.8)(Yudu Cheng et
al.，Biochemistry，1996，35：13021-13029)；对胰蛋白酶为Bz-Arg-AMC·HCl
(Bachem公司，Km＝59±2μM，25℃，pH8.0)；对尿激酶为N-Cbz-Gly-
Gly-Arg-AMC(Sigma公司，Km＝400μM，24℃，pH7.5)；对纤溶酶为为D-
Ala-Leu-Lys-AMC(Sigma公司，Km＝620μM，25℃，pH8.0)；对tPA为
Boc-L-(p-F)FPR-ANSNH-C₂H₅(血液技术公司，Km＝71μM，25℃，pH7.4)。
采用日立F2500分光光度计在常温下进行测定，激发波长和发射波长分别为
383nm和455nm。酶测定的典型累进数据如图1-3所示，抑制常数(Ki)
的测定如图4所示。与目前临床使用且具有化学结构XIII的一种抗凝剂
argatroban比较的测定结果列于表1。

结果表明由argatroban的主链环化衍生得到的Cycloargatroban，有以下
特征：

(1)保持高的凝血酶抑制活性(比argatroban低2.1倍)；

(2)对凝血酶的选择性高于胰蛋白酶(比argatroban高12倍)；

(3)对溶解血纤维蛋白的酶无明显的抑制作用(类似于argatroban)；

(4)在侧链上保持多样性(类似于argatroban)。

表1
Argatroban(化学结构XIII见下面)和Cycloargatroban(结构式I，其中R¹、
R²和R⁴是氢，R³是甲基，R⁵是1，2，3，4-四氢-3-甲基-8-喹啉磺酸基和R⁶是3-
胍丙基)的测定结果比较

    活性

Cycloargatroban

Argatroban

Cycloargatroban与Argatroban
             比较^*
Ki(凝血酶)
    40nM
  19nM
    -2.1倍
Ki(胰蛋白酶)
    126μM
  5μM
    +12倍
Ki(尿激酶)
    295μM
  999μM
    -0.14倍
Ki(血纤溶酶)
    528μM
  372μM
    -0.67倍
Ki(tPA)
    2021μM
  777μM
    +1.2倍

^*Cycloargatroban[Ki(酶)/Ki(凝血酶)]与Argatroban[Ki(酶)/Ki(凝血酶)]
比较

实施例10 体外凝血测定

与目前临床使用且具有下列化学结构的对照抗凝剂argatroban比较：

采用采集的正常人血浆，通过在广浓度范围内分别加入凝血酶抑制剂来
测定活化的部分促凝血酶原激酶时间(APTT)的延长来测定NPI 999的体
外抗凝血作用。从Sigma公司得到冻干收集的人血浆。采用ELECTRA^TM800
自动血凝固计(医学实验室自动化公司)和自动的APTT试剂(Sigma公司)
作为血凝固的起始物，按照制造商的说明书测定APTT。在迅速融化的血浆
中配制一系列对照化合物和测试化合物的稀释液(化合物∶血浆＝
0.1ml∶0.9ml)，然后向测试流程的孔中添加混合的溶液进行测定。在整个测
定中采用三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液(pH7.8，25℃)。

图5表示NPI999(空心圆)和argatroban(空心方格)对正常用柠檬酸
盐处理的人血浆的活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)的作用。如图5
所示，两种化合物对延长了APTT有剂量依赖性。这表明凝血酶在血浆中失
活。需指出的是，APTT测定了化合物对凝血的酶，如凝血酶、血浆、尿激
酶、组织纤溶酶原激活酶(tPA)和丝氨酸蛋白酶，如胰蛋白酶、凝血因子
X等的总的抗凝血作用。因此，Cycloargatroban(结构式I)对APTT的作用
强度稍差于argatroban可归咎于cycloargatroban(结构式I)对凝血和丝氨酸
蛋白酶的选择性略高于argatroban。

虽然已描述的发明与特定的最佳实施例有关，但可以认为发明可进一步
改进，本发明意图是用来覆盖发明的任何进一步的改变、用途或适应性。总
之，遵照发明的原理，且包括目前的披露偏离与本发明有关的现有技术和已
知或习惯的范围，可适用于上文中陈述的基本特征。所附的权利要求范围如下。