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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510008457.1 (22)申请日 2015.01.08 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104515851 A (43)申请公布日 2015.04.15 (73)专利权人 河南农业大学 地址 450002 河南省郑州市金水区文化路 95号 专利权人 河南省环境监测中心 (72)发明人 宋安东张炎达彭华王风芹 谢慧杨森任天宝 (74)专利代理机构 郑州联科专利事务所(普通 合伙) 41104 代理人 时立新张智伟 (51)Int.Cl. C12Q 1/3。
2、2(2006.01) (56)对比文件 CN 101978042 A,2011.02.16,说明书实施 例XIV、 XV. US 2012/0064622 A1,2012.03.15,说明书 实施例6. WO 2014/197746 A1,2014.12.11,说明书实 施例1， 第0044段. US 2009/0155875 A1,2009.06.18,全文. US 2013/0273628 A1,2013.10.17,全文. US 4732855 A,1988.03.22,全文. CN 102229888 A,2011.11.02,全文. L. YU AND M. J. WOLIN.Hyd。
3、rogenase Measurement with Photochemically Reduced Methyl Viologen. JOURNAL OF BACTERIOLOGY .1969,第98卷(第1期), 连莉文 等.产甲烷菌的MV氢化酶活性分析 法. 中国沼气 .1987,第5卷(第4期), Haiyan Huang,et al.Electron Bifurcation Involved in the Energy Metabolism of the Acetogenic Bacterium Moorella thermoacetica Growing on Glucose or 。
4、H2 plus CO2. Journal of Bacteriology .2012,第194卷(第14期), 审查员 许珊萍 (54)发明名称 一种直接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧 化碳脱氢酶活性的方法与装置 (57)摘要 本发明属于酶活性测定领域， 公开一种直接 测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活 性的方法与装置。 先向反应体系内连续通气至少 2min， 测定氢化酶和一氧化碳脱氢酶活性时对应 的气体分别为氢气和一氧化碳， 然后将0.5mL待 测厌氧微生物的菌液注射入反应体系内， 再连续 通气至少2min， 接着于37条件下保持6min， 反 应过程结束时冰浴终止反应， 取0.2mL反。
5、应液测 定吸光度值， 经换算即得酶活。 装置包括气体供 给装置、 酶活反应装置和酶标仪。 本发明步骤简 单， 操作简便， 无需对样品进行处理， 检测时间 短， 取样量小， 酶活稳定有效， 设备要求较低， 避 免酶活必须在厌氧操作箱内操作， 减少氮气耗用 量， 灵活性好， 适用于对厌氧微生物样品中的氢 化酶和一氧化碳脱氢酶活性测定。 权利要求书1页 说明书8页 附图1页 CN 104515851 B 2016.09.14 CN 104515851 B 1.一种直接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的方法， 其特征在于： 先 向反应体系内连续通气至少2min， 测定氢化酶和一氧化碳脱氢酶活。
6、性时对应的气体分别为 氢气和一氧化碳， 然后将0.5mL待测厌氧微生物的菌液注射入反应体系内， 再连续通气至少 2min， 接着于37条件下保持6min， 反应过程结束时冰浴终止反应， 取0.2mL反应液测定吸 光度值， 经换算即得酶活； 测定氢化酶活性时， 对应的反应体系组成为： 0.4mL1M、 pH=7.5 的Tris-HCl缓冲液， 0.2mL0.04M的甲基紫精溶液， 0.2mL0.04M的二硫苏糖醇溶液， 0.1mL 5v%的Triton-X100溶液， 2mL脱气去离子水； 测定一氧化碳脱氢酶活性时， 对应的反应体系 组成为： 0.8mL0.5M、 pH=6.8的Tris-HCl。
7、缓冲液， 0.2mL0.04M的甲基紫精溶液， 0.2mL 0.04M的二硫苏糖醇溶液， 0.1mL5v%的Triton-X100溶液， 1.2mL脱气去离子水； 以上反应体 系中， Tris-HCl缓冲液、 甲基紫精溶液、 二硫苏糖醇溶液、 Triton-X100溶液配制时采用的水 均为脱气去离子水。 2.如权利要求1所述的方法， 其特征在于： 涉及的两处通气， 其流速范围均控制在1- 10mL/min。 3.如权利要求1所述的方法， 其特征在于： 采用酶标仪测定反应液的吸光度值， 测定波 长为578nm， 同时以未加待测厌氧微生物的菌液的反应体系作为对照液。 4.如权利要求1或3所述的方法。
8、， 其特征在于： 所述待测厌氧微生物的菌液为待测厌氧 微生物的种子液或发酵液。 权利要求书 1/1 页 2 CN 104515851 B 2 一种直接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的 方法与装置 技术领域 0001 本发明属于氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性测定技术领域， 具体涉及一种直接测定 厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的方法与装置。 背景技术 0002 厌氧菌是一类在无氧条件下比在有氧环境中生长好的微生物， 且不能直接暴露在 含氧量大于或等于18%的空气里， 对氧气敏感， 一般可分为绝对厌氧菌和兼性厌氧菌两类。 厌氧菌属于较为古老的原核菌进化而来， 目前不断发现较多的厌氧菌。
9、特别是绝对厌氧菌具 有很大的发酵应用和工业生产价值， 如ClostridiumcarboxidivoransP7、 Clostridium strainP11、 Clostridiumljungdahlii和ClostridiumautoethanogenumDSM10061等。 此 类厌氧菌能够利用乙酰CoA/Wood-Ljungdahl代谢途径行使生命活动进行生长繁殖， 另外研 究证明该类菌的代谢物还可作为人类所需要的生物燃料或原料， 如乙醇、 丁醇和脂类等。 0003 氢化酶(hydrogenase， 简称H2ase)是一类存在于微生物尤其是厌氧菌体内的重要 生物酶， 是一种催化伴有氢分。
10、子释放或分子氢转化质子的氧化还原反应酶， 它通过控制微 生物体内氢的代谢来调节细菌的其他生理活动。 0004 0005 一氧化碳脱氢酶(COdehydrogenase,简称CODH)是一类存在于能够利用CO或CO2 的绝对厌氧菌内， 是该类菌利用CO或CO2作为碳源进行生命活动的关键性酶， 它可催化CO氧 化为CO2， 也可还原CO2为CO， 在CO氧化过程中不仅为厌氧菌提供了碳源还提供了代谢所必需 的还原力。 0006 0007 氢化酶和一氧化碳脱氢酶活性测定均对环境氧含量要求严格， 如Peters在研究 H2ase结构和性质时发现极微量的氧气都会对该酶活性产生抑制作用。 Diekert和T。
11、hauer首 先在厌氧乙酸菌中发现CO脱氢酶， 但由于CODH对氧极端敏感， 几年之后才得以纯化此酶。 同 样， 因为两种酶对环境的要求较高而使得目前该两种酶的活性测定方法较少， 主要包括： 超 声波法、 酶法和全细胞法， 而不同测定方法优缺点不同， 已有的测定方法报道如下： 0008 超声波法： 该方法测定酶活的主要原理是利用超声波对厌氧菌菌体细胞的作用使 得细胞膜破裂进而释放细胞内的氢化酶和一氧化碳脱氢酶， 再将破碎液高速离心得到上清 液 （含粗酶溶液） ， 最后进行酶活体系反应获取酶活大小。 该法应用较为广泛， 但存在许多缺 点： 首先是超声波法对酶活性损失大， 其次是超声过程易于产热且。
12、时间较长， 一般全过程需 要1520min， 均不利于酶的稳定性， 最后是该法的超声对象体系内的还原环境难以控制。 0009 酶法： 该方法原理为使用溶菌酶分解厌氧菌细胞壁使之形成原生质体， 然后经高 速离心作用获取粗酶液， 进而同反应体系反应获得酶活。 该方法中溶菌酶缓冲液处理样品 说明书 1/8 页 3 CN 104515851 B 3 时需于37下操作1224h。 虽然处理条件较为柔和， 但酶活反应时间长， 中间还需多次补 加溶菌酶缓冲液弥补因蒸发作用对实验的影响。 同样， 该方法不适于多样品甚至大批量样 品酶活测定。 0010 全细胞法： 该方法的主要原理是利用厌氧菌细胞直接参与酶活体。
13、系内进行酶活反 应， 然后将反应液利用比色皿比色法获得酶活大小。 该方法酶活测定过程中需要在厌氧环 境内进行， 目前主要选择在厌氧箱内操作或者利用4.5mL带盖比色皿内进行， 厌氧箱内酶活 反应不仅需要大量氮气， 同时因为箱体空间的局限性而致使反应的样品量受到限制并且操 作灵活性低； 利用比色皿进行酶活反应及测定较厌氧箱简化了操作环节甚至增加了操作灵 活性， 但仍然存在一些缺陷， 如密封性差和所需样品量较大， 且一般需要样品进行前处理。 同样， 无论为哪种途径， 最终酶活测定均在分光光度计内测定， 因分光光度计内最多设置4 个插孔并人工手动操作， 则不利于数量稍多的样品酶活测定作业。 因而有必。
14、要来根据厌氧 菌实际情况， 通过实验研究建立一种有针对性的、 快速、 灵活、 简便、 可靠、 酶活损失小和样 品使用量少的测定方法。 这将对测定和评价厌氧微生物内H2ase和CODH酶活性具有重要意 义。 发明内容 0011 本发明的目的在于提供一种快速、 灵活、 简便、 可靠、 酶活损失小和样品使用量少 的直接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的方法与装置。 0012 为实现以上目的， 本发明采取以下的技术方案： 0013 一种直接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的方法： 先向反应体系 内连续通气至少2min， 测定氢化酶和一氧化碳脱氢酶活性时对应的气体分别为氢气和一氧 化。
15、碳， 然后将0.5mL待测厌氧微生物的菌液注射入反应体系内， 再连续通气至少2min， 接着 于37条件下保持6min， 反应过程结束时冰浴终止反应， 取0.2mL反应液测定吸光度值， 经 换算即得酶活。 0014 进一步， 测定氢化酶活性时， 对应的反应体系组成为： 0.4mL1M、 pH=7.5的Tris- HCl缓冲液， 0.2mL0.04M的甲基紫精溶液， 0.2mL0.04M的二硫苏糖醇溶液， 0.1mL5v%的 Triton-X100溶液， 2mL脱气去离子水； 测定一氧化碳脱氢酶活性时， 对应的反应体系组成 为： 0.8mL0.5M、 pH=6.8的Tris-HCl缓冲液， 0.。
16、2mL0.04M的甲基紫精溶液， 0.2mL0.04M的 二硫苏糖醇溶液， 0.1mL5v%的Triton-X100溶液， 1.2mL脱气去离子水； 以上反应体系中， Tris-HCl缓冲液、 甲基紫精溶液、 二硫苏糖醇溶液、 Triton-X100溶液配制时采用的水均为 脱气去离子水。 0015 较好地， 涉及的两处通气， 其流速范围均控制在1-10mL/min。 0016 较好地， 采用酶标仪测定反应液的吸光度值， 测定波长为578nm， 同时以未加待测 厌氧微生物的菌液的反应体系作为对照液。 0017 较好地， 所述待测厌氧微生物的菌液为待测厌氧微生物的种子液或发酵液。 种子 液或发酵液。
17、按本领域常规培养基培养方法获得。 0018 一种实现所述方法的装置： 该装置包括气体供给装置、 酶活反应装置和酶标仪； 所 述气体供给装置的结构构造为： 包括气体储罐、 带铁夹的铁架台、 多通管， 多通管固定在铁 夹上， 气体储罐的罐顶设有气罐阀， 气体储罐的气体出管上依次设有安全阀和流量调节阀， 说明书 2/8 页 4 CN 104515851 B 4 安全阀上连接有低压表和高压表， 流量调节阀上连接有气体流量计， 气体出管的末端通过 第一输气管路连接至多通管其中的一个管口， 多通管的剩余管口则分别各连接一个第二输 气管路， 第二输气管路又与连接导管连接； 所述酶活反应装置的结构构造为： 包。
18、括固定座 板， 固定座板上设有至少一个反应管， 反应管顶部设有密封垫， 密封垫上针头朝下插入有进 气针头和出气针头， 并且进气针头插入密封垫直至反应管底部， 出气针头插入密封垫直至 漏出部分的长度为0.5-2cm； 气体供给装置和酶活反应装置之间通过连接导管连接至进气 针头的尾部实现连接， 酶标仪则相对气体供给装置和酶活反应装置独立设置。 0019 较好地， 所述酶标仪为进口全波长酶标仪， 如MultisuanGo1510， 酶标仪采用96 孔板， 每孔上样量均为0.2mL， 扫描震动10s。 0020 较好地， 所述反应管为5mLEP管； 所述密封垫为一次性医用10mL注射器橡胶活塞 且凸面。
19、朝下放置； 所述进气针头和出气针头的规格型号分别优选为0.5100SB （麻醉用） 与 0.4516RWLB （通用型） 。 0021 较好地， 在测定氢化酶和一氧化碳脱氢酶活性时， 为方便在两者之间以及与对照 试验之间来回切换， 所述多通管优选为四通管， 所述反应管的数量优选为三个， 一个反应管 用于测定氢化酶活性， 一个反应管用于测定一氧化碳脱氢酶活性， 一个反应管用于测定对 照液活性。 0022 较好地， 所述第一输气管路和第二输气管路优选为橡胶管； 所述连接导管优选由 1mL无菌医用注射器切除尾部制成。 0023 本发明的有益效果是： 步骤简单， 操作简便， 无需对样品进行处理， 检测。
20、时间短， 取 样量小， 酶活稳定有效， 设备要求较低， 避免酶活必须在厌氧操作箱内操作， 减少氮气耗用 量， 灵活性好， 适用于对厌氧微生物样品中的氢化酶和一氧化碳脱氢酶活性测定。 附图说明 0024 图1： 本发明直接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的装置示意图； 0025 附图标记说明： 1-气体储罐， 2-气罐阀， 3-高压表， 4-低压表， 5-安全阀， 6-流量调 节阀， 7-气体流量计， 8-第一输气管路， 9-铁夹， 10-铁架台， 11-四通管， 12-第二输气管路， 13-连接导管， 14-进气针头， 15-反应管， 16-出气针头， 17-固定座板， 18-密封垫。
21、。 具体实施方式 0026 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本范明的范围。 此外应理解， 在阅读了本发明的讲授的内容之后， 本领域技术 人员可以对本发明做各种改动， 这些等价形式同样落于本申请权利要求书所限定的范围。 0027 实施例1 0028 一种直接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的装置， 如图1所示， 该 装置包括气体供给装置、 酶活反应装置和酶标仪； 所述气体供给装置的结构构造为： 包括气 体储罐1、 带铁夹9的铁架台10、 四通管11， 四通管11固定在铁夹9上， 气体储罐1的罐顶设有 气罐阀2， 气体储罐1的气。
22、体出管上依次设有安全阀5和流量调节阀6， 安全阀5上连接有低压 表4和高压表3， 流量调节阀6上连接有气体流量计7， 气体出管的末端通过第一输气管路8连 接至四通管11其中的一个管口， 四通管11的剩余管口则分别各连接一个第二输气管路12， 说明书 3/8 页 5 CN 104515851 B 5 第二输气管路12又与连接导管13连接； 所述酶活反应装置的结构构造为： 包括固定座板17， 固定座板17上设有三个反应管15 （一个反应管15用于测定氢化酶活性， 一个反应管15用于 测定一氧化碳脱氢酶活性， 一个反应管15用于测定对照液活性） ， 反应管15顶部设有密封垫 18， 密封垫18上针头。
23、朝下插入有进气针头14和出气针头16， 并且进气针头14插入密封垫18 直至反应管15底部， 出气针头16插入密封垫18直至漏出部分的长度为0.5-2cm； 气体供给装 置和酶活反应装置之间通过连接导管13连接至进气针头14的尾部实现连接， 酶标仪则相对 气体供给装置和酶活反应装置独立设置。 其中， 所述酶标仪为进口全波长酶标仪Multisuan Go1510； 所述反应管15为5mLEP管； 所述密封垫18为一次性医用10mL注射器橡胶活塞且凸 面朝下放置； 所述进气针头14和出气针头16的规格型号分别为0.5100SB （麻醉用） 与0.45 16RWLB （通用型） ； 所述第一输气管路。
24、8和第二输气管路12为橡胶管； 所述连接导管13由 1mL无菌医用注射器切除尾部制成。 0029 利用上述装置直接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的方法： 0030 （1） 实例对象为绝对厌氧菌Clostridiumautoethanogenum(菌种编号DSM 10061)(购自德国微生物菌种保藏中心， DSMZ)， 将该厌氧菌接种于种子培养基中， 37厌 氧箱内静止培养。 0031 （2） 首先按照反应体系具体要求的试剂于厌氧箱内添加至反应管15内并盖入密封 垫18； 然后将反应管15取出到外部操作环境内， 分别依次打开气罐阀2 安全阀5和流量调节 阀6， 调节通气 （测定氢化酶。
25、和一氧化碳脱氢酶活性时对应的气体分别为氢气和一氧化碳） 流速为1mL/min， 待气体流量计7读数稳定后进行通气1min后再将进气针头14插入密封垫18 直至反应管15底部， 接着向密封垫18上插入出气针头16， 插出长度 （即漏出密封垫18部分的 长度） 约0.5cm， 连续通气。 使用一次性注射器 （1mL无菌医用注射器） 抽取步骤 （1） 厌氧菌对 数期种子液 （菌体干重y与ODx关系的回归方程： y=0.715x0.004， R2=0.992） ， 取样量为 0.5mL， 待通气2min后立即插入密封垫18并注射进反应管15内的反应体系内， 再通气2min， 最后于37条件下保持6mi。
26、n， 全部反应过程结束时立即进行冰浴终止反应， 使用镊子将密 封垫18取出并由微量移液枪取0.2mL反应液加入96孔板， 扫描震动10s， 在波长578nm下利用 酶标仪测定吸光度值， 获取数值并按下式计算并得出酶活 （理论计算值） 。 上述测定试验过 程中， 以未加待测厌氧微生物的菌液的反应体系作为对照并且每个样品平行测定三次， 为 减小实验误差， 厌氧菌酶活实际值=厌氧菌酶活理论计算值对照酶活理论计算值； 其中， 测 定氢化酶活性时， 对应的反应体系组成为： 0.4mL1M、 pH=7.5的Tris-HCl缓冲液， 0.2mL 0.04M的甲基紫精溶液， 0.2mL0.04M的二硫苏糖醇溶。
27、液， 0.1mL5v%的Triton-X100溶液， 2mL脱气去离子水； 测定一氧化碳脱氢酶活性时， 对应的反应体系组成为： 0.8mL0.5M、 pH= 6.8的Tris-HCl缓冲液， 0.2mL0.04M的甲基紫精溶液， 0.2mL0.04M的二硫苏糖醇溶液 （现 配现用） ， 0.1mL5v%的Triton-X100溶液， 1.2mL脱气去离子水； 以上反应体系中， Tris-HCl 缓冲液、 甲基紫精溶液、 二硫苏糖醇溶液、 Triton-X100溶液配制时采用的水均为脱气去离 子水。 0032 氢化酶和一氧化碳脱氢酶活性计算公式： 0033酶的比活力 （U/mg菌体干重） = 0。
28、034 式中： 说明书 4/8 页 6 CN 104515851 B 6 0035 OD吸光度值每分钟降低的变化值， min-1； 0036 V测定中所加入反应体系和种子液/发酵液的总体积， mL； 0037 摩尔消光系数， 9780L/ （molcm） ； 0038 0.5696孔板的光程， cm； 0039 C测定中所加入菌体干重的量， g； 0040 106摩尔转化为微摩尔的系数； 0041 酶活单位： 单位干菌体每分钟还原1 mol甲基紫精 （1e-1还原） 。 0042 （3） 测定结果： H2ase： 35.623、 37.360、 37.201U/gDCW， 酶活平均值36.72。
29、8U/g DCW， 标准差为0.960； CODH： 34.232、 32.759、 32.896U/gDCW， 酶活平均值为33.296U/gDCW， 标准差为0.814。 0043 实施例2 0044 直接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的装置同实施例1。 0045 利用上述装置直接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的方法： 0046 （1） 实例对象为绝对厌氧菌Clostridiumautoethanogenum(菌种编号DSM 10061)(购自德国微生物菌种保藏中心， DSMZ)， 将该厌氧菌接种于发酵培养基中， 37， 150r/min摇床发酵培养。 0047 （。
30、2） 首先按照反应体系具体要求的试剂于厌氧箱内添加至反应管15内并盖入密封 垫18； 然后将反应管15取出到外部操作环境内， 分别依次打开气罐阀2 安全阀5和流量调节 阀6， 调节通气 （测定氢化酶和一氧化碳脱氢酶活性时对应的气体分别为氢气和一氧化碳） 流速为3mL/min， 待气体流量计7读数稳定后进行通气1min后再将进气针头14插入密封垫18 直至反应管15底部， 接着向密封垫18上插入出气针头16， 插出长度 （即漏出密封垫18部分的 长度） 约1cm， 连续通气。 使用一次性注射器 （1mL无菌医用注射器） 抽取步骤 （1） 厌氧菌对数 期发酵液 （菌体干重y与ODx关系的回归方程：。
31、y=0.810 x+0.013，R2=0.990） ， 取样量为 0.5mL， 待通气2min后立即插入密封垫18并注射进反应管15内的反应体系内， 再通气2min， 最后于37条件下保持6min， 全部反应过程结束时立即进行冰浴终止反应， 使用镊子将密 封垫18取出并由微量移液枪取0.2mL反应液加入96孔板， 扫描震动10s， 在波长578nm下利用 酶标仪测定吸光度值， 获取数值并按实施例1的计算公式计算并得出酶活 （理论计算值） 。 上 述测定试验过程中， 以未加待测厌氧微生物的菌液的反应体系作为对照， 并且每个样品平 行测定三次， 为减小实验误差， 厌氧菌酶活实际值=厌氧菌酶活理论计。
32、算值对照酶活理论 计算值； 其中， 测定氢化酶活性时， 对应的反应体系组成为： 0.4mL1M、 pH=7.5的Tris-HCl 缓冲液， 0.2mL0.04M的甲基紫精溶液， 0.2mL0.04M的二硫苏糖醇溶液， 0.1mL5v%的 Triton-X100溶液， 2mL脱气去离子水； 测定一氧化碳脱氢酶活性时， 对应的反应体系组成 为： 0.8mL0.5M、 pH=6.8的Tris-HCl缓冲液， 0.2mL0.04M的甲基紫精溶液， 0.2mL0.04M的 二硫苏糖醇溶液 （现配现用） ， 0.1mL5v%的Triton-X100溶液， 1.2mL脱气去离子水； 以上反 应体系中， Tr。
33、is-HCl缓冲液、 甲基紫精溶液、 二硫苏糖醇溶液、 Triton-X100溶液配制时采用 的水均为脱气去离子水。 0048 （3） 测定结果： H2ase： 38.900、 36.861、 35.7437U/gDCW， 酶活平均值为37.168U/g DCW， 标准差为1.307； CODH： 21.896、 20.021、 20.005U/gDCW， 酶活平均值为20.641U/gDCW， 标准差为0.888。 说明书 5/8 页 7 CN 104515851 B 7 0049 实施例3 0050 直接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的装置同实施例1。 0051 利用上述装置直。
34、接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的方法： 0052 （1） 实例对象为绝对厌氧菌Clostridiumljungdahlii(菌种编号DSM13528)(购 自德国微生物菌种保藏中心， DSMZ)， 将该厌氧菌接种于种子培养基中， 37厌氧箱内静止 培养。 0053 （2） 首先按照反应体系具体要求的试剂于厌氧箱内添加至反应管15内并盖入密封 垫18； 然后将反应管15取出到外部操作环境内， 分别依次打开气罐阀2 安全阀5和流量调节 阀6， 调节通气 （测定氢化酶和一氧化碳脱氢酶活性时对应的气体分别为氢气和一氧化碳） 流速为5mL/min， 待气体流量计7读数稳定后进行通气1min。
35、后再将进气针头14插入密封垫18 直至反应管15底部， 接着向密封垫18上插入出气针头16， 插出长度 （即漏出密封垫18部分的 长度） 约1cm， 连续通气。 使用一次性注射器 （1mL无菌医用注射器） 抽取步骤 （1） 厌氧菌对数 期种子液 （菌体干重y与ODx关系的回归方程：y=0.810 x+0.013，R2=0.990） ， 取样量为 0.5mL， 待通气2min后立即插入密封垫18并注射进反应管15内的反应体系内， 再通气2min， 最后于37条件下保持6min， 全部反应过程结束时立即进行冰浴终止反应， 使用镊子将密 封垫18取出并由微量移液枪取0.2mL反应液加入96孔板， 扫。
36、描震动10s， 在波长578nm下利用 酶标仪测定吸光度值， 获取数值并按实施例1的计算公式计算并得出酶活 （理论计算值） 。 上 述测定试验过程中， 以未加待测厌氧微生物的菌液的反应体系作为对照， 并且每个样品平 行测定三次， 为减小实验误差， 厌氧菌酶活实际值=厌氧菌酶活理论计算值对照酶活理论 计算值； 其中， 测定氢化酶活性时， 对应的反应体系组成为： 0.4mL1M、 pH=7.5的Tris-HCl 缓冲液， 0.2mL0.04M的甲基紫精溶液， 0.2mL0.04M的二硫苏糖醇溶液， 0.1mL5v%的 Triton-X100溶液， 2mL脱气去离子水； 测定一氧化碳脱氢酶活性时， 。
37、对应的反应体系组成 为： 0.8mL0.5M、 pH=6.8的Tris-HCl缓冲液， 0.2mL0.04M的甲基紫精溶液， 0.2mL0.04M的 二硫苏糖醇溶液 （现配现用） ， 0.1mL5v%的Triton-X100溶液， 1.2mL脱气去离子水； 以上反 应体系中， Tris-HCl缓冲液、 甲基紫精溶液、 二硫苏糖醇溶液、 Triton-X100溶液配制时采用 的水均为脱气去离子水。 0054 （3） 测定结果： H2ase： 10.534、 10.868、 11.537U/gDCW， 酶活平均值为10.980U/g DCW， 标准差为0.511； CODH， 10.749、 11。
38、.323、 10.865U/gDCW， 酶活平均值为10.979U/gDCW， 标准差为0.303。 0055 实施例4 0056 直接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的装置同实施例1。 0057 利用上述装置直接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的方法： 0058 （1） 实例对象为绝对厌氧菌ClostridiumcarboxidivoransP7(菌种编号DSM 15243)(购自德国微生物菌种保藏中心， DSMZ)， 将该厌氧菌接种于种子培养基中， 37， 厌 氧箱内静止培养。 0059 （2） 首先按照反应体系具体要求的试剂于厌氧箱内添加至反应管15内并盖入密封 垫1。
39、8； 然后将反应管15取出到外部操作环境内， 分别依次打开气罐阀2 安全阀5和流量调节 阀6， 调节通气 （测定氢化酶和一氧化碳脱氢酶活性时对应的气体分别为氢气和一氧化碳） 流速为5mL/min， 待气体流量计7读数稳定后进行通气1min后再将进气针头14插入密封垫18 说明书 6/8 页 8 CN 104515851 B 8 直至反应管15底部， 接着向密封垫18上插入出气针头16， 插出长度 （即漏出密封垫18部分的 长度） 约1.5cm， 连续通气。 使用一次性注射器 （1mL无菌医用注射器） 抽取步骤 （1） 厌氧菌对 数期种子液 （菌体干重y与ODx关系的回归方程：y=0.783x0。
40、.002，R2=0.998） ， 取样量为 0.5mL， 待通气2min后立即插入密封垫18并注射进反应管15内的反应体系内， 再通气2min， 最后于37条件下保持6min， 全部反应过程结束时立即进行冰浴终止反应， 使用镊子将密 封垫18取出并由微量移液枪取0.2mL反应液加入96孔板， 扫描震动10s， 在波长578nm下利用 酶标仪测定吸光度值， 获取数值并按实施例1的计算公式计算并得出酶活 （理论计算值） 。 上 述测定试验过程中， 以未加待测厌氧微生物的菌液的反应体系作为对照， 并且每个样品平 行测定三次， 为减小实验误差， 厌氧菌酶活实际值=厌氧菌酶活理论计算值对照酶活理论 计算。
41、值； 其中， 测定氢化酶活性时， 对应的反应体系组成为： 0.4mL1M、 pH=7.5的Tris-HCl 缓冲液， 0.2mL0.04M的甲基紫精溶液， 0.2mL0.04M的二硫苏糖醇溶液， 0.1mL5v%的 Triton-X100溶液， 2mL脱气去离子水； 测定一氧化碳脱氢酶活性时， 对应的反应体系组成 为： 0.8mL0.5M、 pH=6.8的Tris-HCl缓冲液， 0.2mL0.04M的甲基紫精溶液， 0.2mL0.04M的 二硫苏糖醇溶液 （现配现用） ， 0.1mL5v%的Triton-X100溶液， 1.2mL脱气去离子水； 以上反 应体系中， Tris-HCl缓冲液、 。
42、甲基紫精溶液、 二硫苏糖醇溶液、 Triton-X100溶液配制时采用 的水均为脱气去离子水。 0060 （3） 测定结果： H2ase： 15.837、 17.260、 15.996U/gDCW， 酶活平均值为16.364U/g DCW， 标准差为0.779； CODH， 14.490、 14.794、 14.432U/gDCW， 酶活平均值为14.572U/g DCW， 标准差为0.193。 0061 实施例5 0062 直接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的装置同实施例1。 0063 利用上述装置直接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的方法： 0064 （1） 实例对象。
43、为绝对厌氧菌ClostridiumstrainP11(菌种编号DSM15248)(购 自德国微生物菌种保藏中心， DSMZ)， 将该厌氧菌接种于种子培养基中， 37厌氧箱内静止 培养。 0065 （2） 首先按照反应体系具体要求的试剂于厌氧箱内添加至反应管15内并盖入密封 垫18； 然后将反应管15取出到外部操作环境内， 分别依次打开气罐阀2 安全阀5和流量调节 阀6， 调节通气 （测定氢化酶和一氧化碳脱氢酶活性时对应的气体分别为氢气和一氧化碳） 流速为10mL/min， 待气体流量计7读数稳定后进行通气1min后再将进气针头14插入密封垫 18直至反应管15底部， 接着向密封垫18上插入出气。
44、针头16， 插出长度 （即漏出密封垫18部分 的长度） 约2cm， 连续通气。 使用一次性注射器 （1mL无菌医用注射器） 抽取步骤 （1） 厌氧菌对 数期种子液 （菌体干重y与ODx关系的回归方程：y=0.660 x+0.001，R2=0.999） ， 取样量为 0.5mL， 待通气2min后立即插入密封垫18并注射进反应管15内的反应体系内， 再通气2min， 最后于37条件下保持6min， 全部反应过程结束时立即进行冰浴终止反应， 使用镊子将密 封垫18取出并由微量移液枪取0.2mL反应液加入96孔板， 扫描震动10s， 在波长578nm下利用 酶标仪测定吸光度值， 获取数值并按实施例1。
45、的计算公式计算并得出酶活 （理论计算值） 。 上 述测定试验过程中， 以未加待测厌氧微生物的菌液的反应体系作为对照， 并且每个样品平 行测定三次， 为减小实验误差， 厌氧菌酶活实际值=厌氧菌酶活理论计算值对照酶活理论 计算值； 其中， 测定氢化酶活性时， 对应的反应体系组成为： 0.4mL1M、 pH=7.5的Tris-HCl 说明书 7/8 页 9 CN 104515851 B 9 缓冲液， 0.2mL0.04M的甲基紫精溶液， 0.2mL0.04M的二硫苏糖醇溶液， 0.1mL5v%的 Triton-X100溶液， 2mL脱气去离子水； 测定一氧化碳脱氢酶活性时， 对应的反应体系组成 为：。
46、 0.8mL0.5M、 pH=6.8的Tris-HCl缓冲液， 0.2mL0.04M的甲基紫精溶液， 0.2mL0.04M的 二硫苏糖醇溶液 （现配现用） ， 0.1mL5v%的Triton-X100溶液， 1.2mL脱气去离子水； 以上反 应体系中， Tris-HCl缓冲液、 甲基紫精溶液、 二硫苏糖醇溶液、 Triton-X100溶液配制时采用 的水均为脱气去离子水。 0066 （3） 测定结果： H2ase： 35.249、 33.418、 33.597U/gDCW， 酶活平均值为34.088U/g DCW， 标准差为1.010； CODH， 31.783、 32.568、 32.210。
47、U/gDCW， 酶活平均值为32.187U/gDCW， 标准差为0.393。 0067 以上实施例1-5中： 0068 A、 1L种子培养基成分如下： NaCl0.80g， NH4Cl1.00g， KCl0.10g， MgSO47H2O 0.20g， CaCl20.04g， KH2PO40.20g， NaHCO31.00g， 酵母膏1.00g， MES5.00g， L-盐酸 半胱氨酸0.40g， 木糖5.00g， 矿质元素溶液10mL， 维生素溶液10mL， pH=5.75。 0069 B、 1L发酵培养基成分如下： NH4Cl1.00g， NaCl1.00g， MgSO40.15g， KH2。
48、PO4 0.10g， CaCl20.04g， 胰蛋白胨2.00g， 酵母膏0.30g， L-盐酸半胱氨酸0.20g， MES 10.00g， 矿质元素溶液10mL， 维生素溶液10mL， pH=7.0。 另外向每300mL发酵瓶 （内装60ml 发酵培养基） 中补加240mL合成气， 其组分为CO85.5v%， H210v%， CO24.5v%。 0070 C、 种子培养基和发酵培养基中矿质元素溶液与维生素溶液成分分别为： 0071 矿质元素溶液 （mg/L） ： 氨三乙酸2.0103， MgSO41.0103， 硫酸亚铁铵0.8 103， 氯化钴0.2103， 硫酸锌0.2103， 氯化铜20， 氯化镍20， 钼酸钠20， 硒酸钠20， 钨 酸钠20。 0072 维生素溶液 （mg/L） ： VB610， 硫胺素5.0， VB25， 泛酸钙5， 硫辛酸5， 对氨基苯甲酸 5， 烟碱酸5， VB125， 生物素2， 叶酸2； 配好后用0.22 m过滤器过滤除菌使用。 说明书 8/8 页 10 CN 104515851 B 10 图1 说明书附图 1/1 页 11 CN 104515851 B 11 。