一种混合菌种微生物转化法高效合成L茶氨酸的方法.pdf

本发明涉及一种混合菌种微生物转化法高效合成L-茶氨酸的方法，其特征在于采用黄色短杆菌和硝基还原假单胞菌进行混合发酵，发酵结束后将发酵液升温进行菌体灭活处理，然后加入乙胺进行合成转化。本发明的混合菌种微生物转化法高效合成L-茶氨酸的方法，是将发酵过程中产生的谷氨酰胺在发酵液中经谷氨酰胺酶作用直接转化合成茶氨酸，省去了谷氨酰胺复杂的提取步骤，避免了谷氨酰胺提取过程中造成的收率损失，从而简化了生产工艺，大大降低了生产成本，提高了谷氨酰胺的利用率，降低了生产成本。

1.   一种混合菌种微生物转化法高效合成L-茶氨酸的方法，其特征在于采用黄色短杆菌和硝基还原假单胞菌进行混合发酵，发酵结束后将发酵液升温进行菌体灭活处理，然后加入乙胺进行合成转化。

2.   按照权利要求1所述的混合菌种微生物转化法高效合成L-茶氨酸的方法，其特征在于所述混合发酵是以葡萄糖为底物，辅以氮源和微量元素作为基础培养基进行的。

3.   按照权利要求1或2所述的混合菌种微生物转化法高效合成L-茶氨酸的方法，其特征在于所述混合发酵控制条件为：搅拌转速200～400rpm，通风体积比1:1～1:5，30℃～34℃条件下恒温培养，发酵过程中，控制溶氧在10%-20%。

4.   按照权利要求1所述的混合菌种微生物转化法高效合成L-茶氨酸的方法，其特征是：在发酵培养8小时后开始取样检测发酵液中pH、OD、谷氨酰胺含量及谷氨酸含量，当检测到谷氨酰胺含量不再增长，且镜检菌体老化时，停止培养。

5.   按照权利要求1所述的混合菌种微生物转化法高效合成L-茶氨酸的方法，其特征在于所述菌体灭活处理是指将将发酵液升温至60℃～80℃，维持5分钟～10分钟。

6.   按照权利要求1所述的混合菌种微生物转化法高效合成L-茶氨酸的方法，其特征在于所述合成转化过程中，按谷氨酰胺：乙胺=0.3M：1.5M～0.3M：2.0M加入乙胺，然后在30℃～34℃，搅拌转速200rpm～400rpm条件下，维持16～24小时。

一种混合菌种微生物转化法高效合成L-茶氨酸的方法
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，特别是涉及一种混合菌种微生物转化法高效合成L-茶氨酸的方法。
背景技术
茶氨酸（Theanine）是茶叶中的特征氨基酸，也是茶叶的呈味物质之一。它是1950年由日本酒户弥二郎从玉露茶新梢中发现的，并命名为茶氨酸（Theanine）。一般干茶叶中茶氨酸的含量为1%-2%。从发现到目前为止，除了在蕈、茶梅、蘑菇、油茶、红山茶等中检测出微量存在外，在其他植物中尚未发现。茶氨酸还是茶树中含量最高的游离氨基酸，在茶树的新梢芽叶中，70%左右的游离氨基酸是茶氨酸。近年对茶叶保健成分的研究中，茶氨酸是一种比较引人注目的化合物，在它的许多生理作用被发现以后，如何制造、合成及提取茶氨酸也成了广泛关注的研究课题。
茶氨酸属于酰胺类化合物，它的化学名为：N-乙基-γ-L-谷氨酰胺（N-ethyl-γ-L-glutamine），分子式为：HOOCCHNH₂CH₂CH₂CONHCH₂CH₃，分子量为174.2。自然界存在的茶氨酸均为L型，纯品为白色针状结晶，熔点217-218℃（分解）。极易溶于水，而不溶于无水乙醇和乙醚，且溶解性随温度升高而增大，具有焦糖的香味和类似味精的鲜爽味。经6mol/L盐酸水解后生成L-谷氨酸和乙胺，茚三酮反应成紫色。
一、茶氨酸的功能与应用
1．茶氨酸的功能
茶氨酸自发现以来，一直是被作为茶叶的主要品质成分广为研究。近年来，茶氨酸具有的一些特殊生理功能不断地被发现，从而成为茶叶功能性成分合成和提取、应用的又一大热点，研究表明，茶氨酸具有许多有价值的药用保健功效：
（1）降血压作用；
（2）增强抗肿瘤药物的疗效；
（3）松弛神经紧张、焦虑等作用；
（4）对脑神经细胞保护作用；
（5）促进大脑功能作用；
（6）改善经期综合症作用；
（7）减肥作用；
（8）抗疲劳作用；
（9）提高免疫力，防御病毒。
2.茶氨酸的应用
2.1 茶氨酸在医药领域中的应用
茶氨酸在医药领域中的应用主要集中在以下几个方面：
1）茶氨酸可以用作抗肿瘤药物。动物实验证明茶氨酸对小鼠可转移性肿瘤有延缓作用，对患白血病小鼠可延长其存活期。
2）茶氨酸可以用于降压药物。动物实验表明喂饲高剂量茶氨酸，人为升压大鼠的收缩压、舒张压，均有明显的下降。
3）茶氨酸可以用在安神镇静药物中。此外茶氨酸现已作为镇静剂中的有效成分，对帕金森氏症、老年性痴呆、传导神经功能紊乱等疾病起预防效果。
2.2 茶氨酸在食品工业中的应用
作为一种新兴的食品添加剂，茶氨酸具有优良的加工特性和稳定性，可以广泛应用于点心类、糖果及果冻、饮料、口香糖等食品中。概括起来，茶氨酸主要应用在如下领域：
1）可作为茶饮料的品质改良剂 ，在茶饮料生产过程中添加一定量的茶氨酸，能明显改善茶饮料的品质和风味。
2）可作为改善食品风味的添加剂。研究表明，茶氨酸可改善咖啡、可可、高丽参饮料、葡萄柚饮料、啤酒等的苦味，减轻葡萄酒的涩味，因此，可作为这些食品风味的改良剂。并且，茶氨酸在通常的食品加工条件下(如杀菌、pH和加热等)比较稳定，所以应用范围很广。目前日本已开发出添加茶氨酸的巧克力、果冻、布丁、口香糖、保健茶和各种清凉饮料。
3）可作为功能食品的添加剂 。茶氨酸具有增强脑中α波的强度，使人产生轻松感和提高记忆力等作用，并已通过人体试验。因此，将来可作为功能性成分添加到食品中，开发出缓解神经紧张和益智的功能食品。
二、茶氨酸的生产方法
1.化学合成法
茶氨酸化学合成法目前主要是将L-谷氨酸去氢成为吡咯烷酮羟酸(PCA)，然后加入纯乙胺(99%，气-液)反应得到茶氨酸。化学合成手段制备茶氨酸成本低、操作复杂、反应条件苛刻。化学合成制造的都是D L-型消旋体，需要进行拆分才能得到L-型产品。
2.茶叶提取法
传统的提取方法是:因茶叶中存在的游离氨基酸为水溶性，选用热水浸提。用醋酸铅沉淀去除茶汤中的蛋白质、多酚类和部分色素。通H₂S去除过剩的铅，用氯仿萃取去除咖啡碱。茶汤中茶氨酸经碱式碳酸铜成盐后，过滤除去其它组分。茶氨酸铜盐经稀硫酸溶解、加入H₂S和适量Ba(0H)₂抽滤去滤渣、浓缩、精制后得天然茶氨酸纯品。但是此法收率较低，引入杂质重金属离子Pb²⁺、Cu²⁺。
3.利用茶树愈伤组织培养生产茶氨酸
茶树愈伤组织培养法是以嫩茶叶作为外植体材料，用特殊培养基诱导产生愈伤组织，优化培养条件如光照、温度、培养基，添加适当的生长因子，选择合适的前体物质可得到较好的生产效果。一般认为当培养基中乙胺的浓度为25mol/L时，茶叶愈伤组织的茶氨酸生物合成达到最大值，茶愈伤组织（干质量）中茶氨酸的含量达200mg/g以上，占干重的20%左右。Furuya T等在改良MS培养基中，加入20mM的底物(初级胺，如2-氰乙胺、延胡索酸、盐酸苯胺、盐酸苄胺、盐酸苯乙胺等)、温度控制在25℃、黑暗中振荡培养4-5周，可获得较高的茶氨酸产量。该方法产量低，产品分离纯化过程复杂及生产工艺的控制难度大等限制了该方法的工业化。
4．生物发酵酶法
随着生物技术的发展和应用，利用微生物发酵来生产酶，进而利用酶的提取物来进行目的物的生产越来越被广泛地应用。与化学合成法相比，微生物发酵法生产茶氨酸具有完全不同的特色。由于酶促反应所具有的高度专一性，所以无需对α-氨基进行乙胺基化。但是由于生物体内合成茶氨酸需要ATP水解成ADP来提供能量，而ATP的获得与再生要靠葡萄糖的降解来推动。因此，茶氨酸的合成反应必须与葡萄糖的降解反应相偶联。微生物发酵合成茶氨酸的反应，实际上是运用微生物中的谷氨酰胺酶在特殊的条件下（高乙胺浓度和特定的pH值）进行的非特异反应，而该酶在通常情况下对氨的亲和力比乙胺大得多。
目前已经发现的可以催化茶氨酸合成的酶主要有3种：茶氨酸合成酶（Theanine synthetase,EC6.3.1.6）、谷氨酰胺酶（L-Glutaminase，EC 3.5.1.2）、γ-谷氨酰转肽酶（γ-Glutamyltranspeptidase,γ-GGT）。其中，茶氨酸合成酶是茶叶中的生物合成酶，但一直未能将其基因克隆出来；其它两种酶来自微生物，比较方便进行利用。目前主要用于发酵生产L-茶氨酸的酶是γ-谷氨酰转肽酶。
采用微生物发酵法可直接得到L-茶氨酸，可大量生产茶氨酸，适合工业化生产。但是目前酶法生产茶氨酸的方法主要是以谷氨酰胺、乙胺为前体，用微生物培养产γ-谷氨酰转肽酶或谷氨酰胺酶，合成茶氨酸。
如中国专利《高效转化谷氨酰胺合成L-茶氨酸的大肠杆菌菌株及其应用》CN200910035096.4[P].2010-02-10，此发明所说的高效转化L-谷氨酰胺和乙胺的大肠杆菌，是大肠杆菌(Escherichia coli)南师一号CCTCC No.M 209166。该菌株高产茶氨酸合成酶，高效转化谷氨酰胺和乙胺为L-茶氨酸并在工业化生产过程中获得成功；对谷氨酰胺的转化超过80％。（江苏, 南京师范大学,常州阿格罗生物科技有限公司.）。
如中国专利《固定化基因工程菌生物合成茶氨酸的方法》，CN200810162598.9[P].2009-06-03，提供了一种固定化基因工程菌，命名为：大肠埃希氏菌Escherichia coli，在中国微生物菌种保藏中心的保藏号为：CGMCC No.2714，通过克隆E.coli DH5α中γ-谷氨酰转肽酶(γ-GGT)基因构建，含有重组质粒pET32a-GGT，质粒大小7563bp，GGT片段大小1743bp，具有氨苄青霉素抗性，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导表达γ-谷氨酰转肽酶，可以将谷氨酰胺转化合成为L-茶氨酸（中国农业科学院茶叶研究所.）。
上述这种以谷氨酰胺为底物的转化法成本较高，工艺复杂，步骤较多，收率较低，导致成本较高。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种符合工业生产，工艺简单，生产成本低，收率高，且产品纯度高、质量好的混合菌种微生物转化法高效合成L-茶氨酸的方法。
为实现上述发明目的所采取的技术方案为：
一种混合菌种微生物转化法高效合成L-茶氨酸的方法，其特征在于采用黄色短杆菌和硝基还原假单胞菌进行混合发酵，发酵结束后将发酵液升温进行菌体灭活处理，然后加入乙胺进行合成转化。
所述混合发酵是以葡萄糖为底物，辅以氮源和微量元素作为基础培养基进行的，首先将基础培养基在115℃～121℃湿热灭菌15分钟，待基础培养基降至32℃～34℃ 后，接入已培养好的黄色短杆菌和硝基还原假单胞菌的菌种斜面菌苔。
所述混合发酵控制条件为：搅拌转速200rpm～400rpm，通风体积比1:1～1:5，32℃～34℃条件下恒温培养，发酵过程中通过调节搅拌转速和通风量，使溶氧维持在10%-20%。
在发酵培养8小时后开始取样检测发酵液中pH、OD、谷氨酰胺含量及谷氨酸含量，当检测到谷氨酰胺含量不再增长，且镜检菌体老化时，停止培养。
所述菌体灭活处理是指将发酵液升温至60℃～80℃，维持5分钟～10分钟。
所述合成转化过程中，按谷氨酰胺：乙胺=0.3M：1.5M～0.3M：2.0M加入乙胺，然后在30℃～34℃，搅拌转速200rpm～400rpm条件下，维持16～24小时。
本发明的混合菌种微生物转化法高效合成L-茶氨酸的方法，是将发酵过程中产生的谷氨酰胺在发酵液中经谷氨酰胺酶作用直接转化合成茶氨酸，省去了谷氨酰胺复杂的提取步骤，避免了提取过程中造成的收率损失，从而简化了生产工艺，大大降低了生产成本，提高了谷氨酰胺的利用率，降低了生产成本。
具体实施方式
实施例1
以罐体容积10L发酵罐为例，采取本发明通过两种微生物混合发酵，将葡萄糖转化合成为L-茶氨酸的工艺，步骤如下：
1.    发酵培养基的制备
发酵培养基由以下组分组成：
酪朊水解物10 g/L，酵母膏5 g/L，牛肉膏5 g/L，葡萄糖20 g/L，柠檬酸二铵2 g/L，吐温80 1.0 mL/L，KH₂PO₄ 6 g/L, MgSO₄·7 H₂O 0.58 g/L，MnSO4·4H₂O 0.15 g/L，FeSO₄·7H₂O 0.03 g/L，L-谷氨酸钠25g/L。
灭菌条件为115℃湿热灭菌15分钟。
2.    黄色短杆菌和硝基还原假单胞菌混合发酵
发酵培养基制备完成后，从菌种斜面上挑取一环菌苔接入5L发酵培养基中，pH值为6.0，培养温度为32℃，通气量为1.0（v/v·min），搅拌转速为220r/min。
3.    发酵的结束和菌体灭活
在发酵培养8小时后开始取样检测发酵液中pH、OD、谷氨酰胺含量及谷氨酸含量，38小时后检测到谷氨酰胺含量不再增长，停止发酵。谷氨酰胺含量为5%。
将发酵液升温至60℃，维持5分钟。
4.    添加乙胺转化合成L-茶氨酸
按谷氨酰胺：乙胺=0.3M：1.5M加入乙胺，然后在温度30℃，搅拌转速200rpm
的条件下维持20小时。
5.    生物转化过程的终止
6.    生物转化20小时后，L-茶氨酸含量不再增加，生物转化过程终止。L-茶氨酸含量为7%。
实施例2
以罐体容积10L发酵罐为例，采取本发明通过两种微生物混合发酵，将葡萄糖转化合成为L-茶氨酸的工艺，步骤如下：
1.发酵培养基的制备
发酵培养基由以下组分组成：
酪朊水解物9 g/L，酵母膏5 g/L，牛肉膏5 g/L，葡萄糖30 g/L，柠檬酸二铵2 g/L，吐温80 1.0 mL/L，KH₂PO₄ 6 g/L, MgSO₄·7 H₂O 0.58 g/L，MnSO4·4H₂O 0.15 g/L，FeSO₄·7H₂O 0.03 g/L，L-谷氨酸钠20g/L。
灭菌条件为120℃湿热灭菌20分钟。
2.黄色短杆菌和硝基还原假单胞菌混合发酵
发酵培养基制备完成后，从菌种斜面上挑取一环菌苔接入5L发酵培养基中，pH值为6.2，培养温度为33℃，通气量为1.2（v/v·min），搅拌转速为300r/min。
3.发酵的结束和菌体灭活
在发酵培养8小时后开始取样检测发酵液中pH、OD、谷氨酰胺含量及谷氨酸含量，40小时后检测到谷氨酰胺含量不再增长，停止发酵。谷氨酰胺含量为5.5%。
将发酵液升温至65℃，维持8分钟。
4.添加乙胺转化合成L-茶氨酸
按谷氨酰胺：乙胺=0.3M：1.8M加入乙胺，然后在温度32℃，搅拌转速250rpm
的条件下维持22小时。
5.生物转化过程的终止
6.生物转化22小时后，L-茶氨酸含量不再增加，生物转化过程终止。L-茶氨酸含量为6.5%。
实施例3
以罐体容积10L发酵罐为例，采取本发明通过两种微生物混合发酵，将葡萄糖转化合成为L-茶氨酸的工艺，步骤如下：
1.发酵培养基的制备
发酵培养基由以下组分组成：
酪朊水解物12 g/L，酵母膏5 g/L，牛肉膏5 g/L，葡萄糖22 g/L，柠檬酸二铵2 g/L，吐温80 1.0 mL/L，KH₂PO₄ 6 g/L, MgSO₄·7 H₂O 0.58 g/L，MnSO4·4H₂O 0.15 g/L，FeSO₄·7H₂O 0.03 g/L，L-谷氨酸钠21g/L。
灭菌条件为119℃湿热灭菌13分钟
2.黄色短杆菌和硝基还原假单胞菌混合发酵
发酵培养基制备完成后，从菌种斜面上挑取一环菌苔接入5L发酵培养基中，pH值为6.5，培养温度为34℃，通气量为2.0（v/v·min），搅拌转速为400r/min。
3.发酵的结束和菌体灭活
在发酵培养8小时后开始取样检测发酵液中pH、OD、谷氨酰胺含量及谷氨酸含量，42小时后检测到谷氨酰胺含量不再增长，停止发酵。谷氨酰胺含量为6%。
将发酵液升温至75℃，维持8分钟。
4.添加乙胺转化合成L-茶氨酸
按谷氨酰胺：乙胺=0.3M：1.9M加入乙胺，然后在温度33℃，搅拌转速300rpm
的条件下维持24小时。
5.生物转化过程的终止
6.生物转化24小时后，L-茶氨酸含量不再增加，生物转化过程终止。L-茶氨酸含量为8.5%。
本发明不限于上述具体实施方式所提供的方案。