《熊蜂短膜虫实时荧光定量PCR检测试剂盒.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《熊蜂短膜虫实时荧光定量PCR检测试剂盒.pdf（10页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710057647.1 (22)申请日 2017.01.26 (71)申请人 福建出入境检验检疫局检验检疫技 术中心 地址 350003 福建省福州市鼓楼区湖东路 312号国检广场 (72)发明人 张体银郑腾李丹丹白泉阳 王武军张志灯于师宇 (74)专利代理机构 福州元创专利商标代理有限 公司 35100 代理人 蔡学俊 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) (54)发明名称 熊蜂短膜虫实时荧光定量PCR检测试剂。
2、盒 (57)摘要 本发明涉及熊蜂短膜虫实时荧光定量PCR检 测试剂盒， 专用于熊蜂短膜虫的检测。 该试剂盒 包括：（1） 阳性标准品；（2） 阴性对照；（3） PCR反应 液；（4） ExTaq酶；（5） 无菌水。 本发明具有以下优 点：（1） 良好的稳定性和特异性： 对熊蜂短膜虫的 检测具有高度特异性， 与其它蜂类寄生病原无交 叉反应， 且重复性好；（2） 灵敏度高： 灵敏度能达 到100拷贝/L；（3） 操作简便、 快速： 整个反应可 在2小时内完成。 本发明试剂盒可用于熊蜂短膜 虫病的诊断和检测， 对该病的防控和及时治疗具 有重要意义。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图3页 。
3、CN 106755495 A 2017.05.31 CN 106755495 A 1.一种熊蜂短膜虫实时荧光定量PCR检测试剂盒， 其特征在于： 包括正向引物Cri-F、 反 向引物Cri-R及TaqMan探针qPCR-P， 各引物核苷酸序列如下： 正向引物Cri-F： 5 -GTTGGGAAAGAGAGTCTA-3 ， 反向引物Cri-R： 5 -GACGAGAAGG AGAGTAAG-3 ； TaqMan探针qPCR-P： 5 -AACACACAAACAAACCAA ACACACA-3 ， 探针的 5 端和3 端分别采用荧光基团FAM和TAMRA进行修饰。 2.根据权利要求1所述的一种熊蜂。
4、短膜虫实时荧光定量PCR检测试剂盒， 其特征在于： 该试剂盒由下列试剂组成： （1） 阳性标准品： 100 L浓度为1103拷贝/ L的阳性标准品1支， 采用含有目的DNA片段 的阳性质粒作为阳性标准品， -20 保存； （2） 阴性对照： 100 L浓度为100 ng/ L的阴性对照1支， 采用未感染熊蜂短膜虫的健康 熊蜂组织提取的总DNA为阴性对照样品， -20 保存； （3） PCR反应液： 50个反应体系的PCR反应液组成成分为： 2PCR 缓冲液625 L， 浓度为 10 mol/L的正向引物Cri-F和反向引物Cri-R各25 L， 浓度为5 mol/L的TaqMan探针 qPCR。
5、-P 50 L， 浓度为10 mmol/L的dNTP 25 L， 浓度为25 mmol/L的MgCl2 100 L， 共计850 L； -20 保存； （4） ExTaq酶： 25 L浓度为5 U/ L ExTaq酶1支， -20 保存； （5） 无菌水： 2 mL无菌水2支。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106755495 A 2 熊蜂短膜虫实时荧光定量PCR检测试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及一种熊蜂短膜虫实时荧光定量PCR检测试剂盒， 属于动物卫生技术领 域， 适用于熊蜂短膜虫病的检测和诊断。 背景技术 0002 熊蜂短膜虫 （Crithidia bombi， 简称C. bo。
6、mbi） 是熊蜂重要的寄生性原虫， 属于动 鞭毛虫纲 （Zoomastigophorea） 动质目 （Kinetoplastida） 锥虫科 （Trypanosomatidae） 短膜 虫属Crithidia， 只具锥虫亚目6个发育期中的无鞭毛期和前鞭毛期两个发育期。 它是熊蜂 最重要的病虫害之一， 感染个体寿命缩短， 卵巢变小， 蜂王巢穴和工蜂存活能力降低， 严重 影响熊蜂的健康 (Skykoff and Schmid-Hempel, 1992)， 而且感染后症状并不明显， 也延 误了对该病的治疗。 熊蜂短膜虫通过降低寄主熊蜂识别和采集花蜜能力， 来改变寄主熊蜂 的觅食行为， 采集花粉的能力。
7、降低60%以上 （Otterstatter et al., 2005） 。 这种觅食行为 的变化， 对需要其授粉植物的影响是不可预测的； 同时， 增加的采集能量支出， 也影响到整 个蜂群的健康 （Schmid-Hempel et al., 2007） 。 通过对我国各地所采到的30份熊蜂样品进 行流行病学调查显示， 感染率达到了46.7%， 感染状况十分严重， 另外熊蜂短膜虫在夏季的 感染情况是寄主冬季致死率的预测标记 （Ravoet et al., 2013） ， 夏季的高流行率预示着 蜂群在越冬过程中存在着一定的死亡风险。 熊蜂短膜虫病的流行会降低该地区熊蜂的遗传 多样性； 反过来， 熊蜂。
8、遗传多样性的降低， 又会促进熊蜂短膜虫病的发生， 这种相互影响最 终给经济和生态带来巨大的危害。 0003 目前对于熊蜂短膜虫的检测主要根据病原形态学特征以镜检法为主， 但这种方法 需要丰富的临床经验， 而且感染初期蜂群表面状况良好， 无任何临床症状， 所以极易造成漏 检， 也容易和微孢子虫病混淆。 Salath等 （2012） 介绍了一种用流式细胞仪从熊蜂粪便中分 离和培养熊蜂短膜虫的方法， 但这种方法需要昂贵的仪器设备和专业的操作技术， 不适宜 在基层检测部门推广， 另外Popp和Lattorff （2011） 建立的一种体外培养单个寄生虫菌株的 方法也不适用于大批量熊蜂样品的检测。 基因。
9、内转录间隔区 （internal transcribed space, ITS） 是位于寄生虫的遗传物质特别是核糖体DNA ( rDNA )上18S和28S rDNA之间 的区域片段， 作为一种遗传标记， 由于它在生物种和亚种间变异较大， 已经被广泛应用于寄 生虫的分类与鉴定、 病原诊断等不同方面的研究 （牛庆丽等, 2008） 。 0004 本发明利用熊蜂短膜虫18S-28S rDNA ITS基因保守序列设计一对特异性引物和 探针， 通过对反应体系的优化， 研制用于检测熊蜂短膜虫的实时荧光定量PCR试剂盒， 具有 灵敏性高、 特异性和稳定性强、 操作简便等优点， 该方法可在2 h内完成熊蜂短。
10、膜虫的快速 检测， 可满足大批量样品快速筛查的要求， 可以在口岸检验检疫和基层兽医部门进一步应 用和推广。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种熊蜂短膜虫实时荧光定量PCR检测试剂盒， 弥补现有 说明书 1/4 页 3 CN 106755495 A 3 检测技术的不足， 其具有特异性强、 灵敏度高、 操作简单的特点， 能够对熊蜂短膜虫进行快 速、 准确的检测和诊断。 0006 为了实现本发明的目的， 本发明的技术方案如下： 一种熊蜂短膜虫实时荧光定量PCR检测试剂盒， 包括正向引物Cri-F、 反向引物Cri-R及 TaqMan探针qPCR-P， 各引物核苷酸序列如下： 正向引物Cri。
11、-F： 5 -GTTGGGAAAGAGAGTCTA-3 ， 反向引物Cri-R： 5 -GACGAGAAGG AGAGTAAG-3 ； TaqMan探针qPCR-P： 5 -AACACACAAACAAACCAA ACACACA-3 ， 探针的 5 端和3 端分别采用荧光基团FAM和TAMRA进行修饰。 0007 其中， 该试剂盒的具体试剂组成为： （1） 阳性标准品： 100 L浓度为1103拷贝/ L的阳性标准品1支， 采用含有目的DNA片 段的阳性质粒作为阳性标准品， -20 保存。 0008 （2） 阴性对照： 100 L浓度为100 ng/ L的阴性对照1支， 采用未感染熊蜂短膜虫的 。
12、健康熊蜂组织提取的总DNA为阴性对照样品， -20 保存； （3） PCR反应液： 50个反应体系的PCR反应液组成成分为： 2PCR 缓冲液625 L， 浓度为 10 mol/L的正向引物Cri-F和反向引物Cri-R各25 L， 浓度为5 mol/L的TaqMan探针 qPCR-P 50 L， 浓度为10 mmol/L的dNTP 25 L， 浓度为25 mmol/L的MgCl2 100 L， 共计850 L； -20 保存； （4） ExTaq酶： 25 L浓度为5 U/ L ExTaq酶1支， -20 保存； （5） 无菌水： 2 mL无菌水2支。 0009 本发明具有以下优点：（1） 。
13、良好的稳定性和特异性： 本发明系选择熊蜂短膜虫18S- 28S rDNA ITS基因保守片段为靶目标， 不仅设计了一对特异性引物， 而且还设计了一条特 异性荧光探针， 在实时荧光定量PCR反应过程中可以对靶目标进行双重控制， 对熊蜂短膜虫 的检测具有高度特异性， 与其他蜂类寄生病原物无交叉反应， 且重复性好；（2） 灵敏度高： 检 测灵敏度可达到100拷贝/ L；（3） 操作简便、 快速： 实时荧光收集数据， 不需要进行电泳检测 核酸的扩增情况， 整个反应可在2 h内完成。 附图说明 0010 图1为实施例1的阳性标准品和阴性对照PCR扩增结果。 其中M： 50 bp Ladder DNA M。
14、arker I； 1： 阴性对照； 2： 阳性标准品。 0011 图2为实施例2的熊蜂短膜虫阳性标准品实时荧光定量PCR的动力学曲线。 图中横 坐标代表实时荧光定量PCR扩增的循环数， 纵坐标代表荧光信号强度； 从右至左扩增曲线阳 性标准品的浓度分别是1101拷贝/ L-1108拷贝/ L。 0012 图3为实施例2的熊蜂短膜虫阳性标准品实时荧光定量PCR的标准曲线。 图中横坐 标代表标准品拷贝数值， 纵坐标代表PCR扩增循环数； 标准曲线方程为Y=-3.185x+42.921； R 代表相关系数， 决定系数R2为0.974， 扩增效率为99.371%。 0013 图4为实施例3的临床样品检测。
15、结果。 其中1： 阳性对照； 2： 阴性对照； 38： 被检测的 熊蜂样品。 0014 图5为实施例4 熊蜂短膜虫实时荧光定量PCR检测试剂盒的特异性测定结果。 其中 说明书 2/4 页 4 CN 106755495 A 4 1： 熊蜂短膜虫； 2： 熊蜂微孢子虫； 3： 熊蜂孢子虫； 4： 东方蜜蜂微孢子虫； 5： 西方蜜蜂微孢子 虫； 6： 阴性对照。 具体实施方式 0015 为了进一步阐明本发明而不是限制本发明， 以下结合实施例加以说明。 下述实施 例中所述实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法； 所述试剂和生物材料如无特殊说明均可 从商业途径获得。 0016 实施例1： 一种熊蜂短膜。
16、虫实时荧光定量PCR检测试剂盒， 包括正向引物Cri-F、 反向引物Cri-R及 TaqMan探针qPCR-P， 各引物核苷酸序列如下： 正向引物Cri-F： 5 -GTTGGGAAAGAGAGTCTA-3 ， 反向引物Cri-R： 5 -GACGAGAAGG AGAGTAAG-3 ； TaqMan探针qPCR-P： 5 -AACACACAAACAAACCAA ACACACA-3 ， 探针的 5 端和3 端分别采用荧光基团FAM和TAMRA进行修饰。 0017 其中， 该试剂盒的具体试剂组成为： （1） 阳性标准品： 利用引物对Cri-F和Cri-R扩增熊蜂短膜虫基因组DNA， 将产物克隆至 。
17、pMD-18T载体， 转化DH5 大肠杆菌， 利用碱裂解法提取阳性克隆质粒， 计算质粒纯度和浓度 后， 10倍梯度稀释至1 000拷贝/ L作为阳性标准品， 100 L /支， -20 保存； （2） 阴性对照： 100 L浓度为100 ng/ L的阴性对照1支， 采用未感染熊蜂短膜虫的健康 熊蜂组织提取的总DNA为阴性对照样品， -20 保存； （3） PCR反应液： 50个反应体系的PCR反应液组成成分为： 2PCR 缓冲液625 L， 浓度为 10 mol/L的正向引物Cri-F和反向引物Cri-R各25 L， 浓度为5 mol/L的TaqMan探针 qPCR-P 50 L， 浓度为10。
18、 mmol/L的dNTP 25 L， 浓度为25 mmol/L的MgCl2 100 L， 共计850 L； -20 保存； （4） ExTaq酶： 25 L浓度为5 U/ L ExTaq酶1支， -20 保存； （5） 无菌水： 2 mL无菌水2支。 0018 实施例2： 熊蜂短膜虫实时荧光定量PCR检测试剂盒检测标准曲线的建立 （1） 标准品DNA稀释： 将含有目的片段的阳性克隆质粒用无菌水10倍递增稀释成1108 拷贝/ L 110 1拷贝/ L的一系列DNA标准品。 0019 （2） 标准曲线方程建立： 以稀释后的DNA标准品为模板， 每个标准样品处理重复3 次， 并以未感染熊蜂短膜虫的。
19、健康熊蜂组织总DNA为对照， 以无菌水为空白对照。 使用上述 试剂盒按照下列方法配置体系并进行荧光定量PCR： PCR体系配置： 实时荧光定量PCR反应总体系为25 L， 包括PCR反应液17 L， 5 U/ L的 ExTaq酶0.5 L， 标准样品DNA 2 L， 然后加入灭菌水5.5 L， 使反应总体积为25 L。 0020 PCR反应程序： 95 预变性5 min； 然后95 变性5 s、 60 退火延伸30 s， 共40 个循环， 在60 进行单点荧光检测。 0021 获得如图2所示的扩增曲线， 然后绘制如图3所示的标准曲线， 构建标准曲线方程。 本实施例构建的标准曲线方程为Y= -3。
20、.185x+42.921， 决定系数R2为0.974， 扩增效率为 说明书 3/4 页 5 CN 106755495 A 5 99.371%， 检测灵敏度可达到100拷贝/ L， 满足实时荧光定量PCR正常的标准曲线要求。 0022 实施例3： 临床样品熊蜂短膜虫的检测 （1） 提取待检测熊蜂的腹部组织基因组DNA： 剪取熊蜂腹部组织置于研钵， 加入适量液氮快速研磨， 反复几次研磨成浆， 用CTAB法提 取熊蜂腹部组织基因组DNA， 具体步骤如下： 熊蜂腹部组织研磨成浆后转移至1.5 mL离心管 中， 12 000 rpm离心2 min， 弃上清， 加入50 L TE缓冲液， 使样品充分悬浮后。
21、， 加入 60 L 10% SDS溶液和10 L 20 mg/mL 的蛋白酶K， 混匀后于37 下温育1 h； 加入100 L 5 mol/L的NaCl 溶液， 上下颠倒充分混匀， 加入 80 L CTAB/NaCl 溶液， 混匀后65 温育10 min； 加入700 L氯仿/异戊醇 （体积比为24:1） ， 混匀后12 000 rpm离心2 min； 吸取上清至 另一干净离心管， 加入等体积的酚/氯仿/异戊醇 （三者体积比为25:24:1） ， 上下颠倒混匀， 12 000 rpm 离心2 min； 再次吸取上清至另一干净离心管， 加入2倍体积预冷的无水乙醇沉 淀 DNA， 轻轻混匀， 4 。
22、下12 000 rpm离心30 min， 彻底去除上清； 用300 L 70%预冷的乙 醇洗涤沉淀， 4 下12 000 rpm离心15 min， 弃上清， 再离心几秒， 用移液器彻底吸除酒精， 在超净工作台上自然晾干； 加入20 L TE溶液溶解DNA， -20 下保存； （2） 实时荧光定量PCR扩增 在PCR管中加入PCR反应液17 L， 5 U/ L的ExTaq酶0.5 L， 待测样品DNA 2 L， 然后加 入灭菌水5.5 L， 使反应总体积为25 L。 PCR反应程序： 95 预变性5 min； 然后95 变性 5 s、 60 退火延伸30 s， 共40个循环， 在60 进行单点荧。
23、光检测。 0023 （3） 结果判定： 阴性对照无Ct值且无扩增曲线， 同时阳性对照Ct值35， 并且出现 典型的扩增曲线， 说明实验为有效实验， 否则实验无效。 在实验有效的情况下， 待测样品无 Ct值且无扩增曲线， 表示样品中不含熊蜂短膜虫； 待测样品Ct值35， 且出现典型的扩增曲 线， 表示样品中含有熊蜂短膜虫； 待测样品Ct值35， 则对该样品重复检测： 重复检测结果 无Ct值则该样品不含熊蜂短膜虫； 重复检测结果有Ct值则该样品中含有熊蜂短膜虫。 0024 检测结果如图4所示， 阳性对照Ct值为13.57， 阴性对照无Ct值， 试验成立； 样品3、 样品4、 样品5、 样品6、 样。
24、品8均产生典型的扩增曲线， Ct值都35， 均为阳性； 样品2无典型性 扩增曲线， 结果为阴性。 0025 实施例4： 熊蜂短膜虫实时荧光定量PCR检测试剂盒的特异性测定 分别以熊蜂短膜虫、 熊蜂微孢子虫、 熊蜂孢子虫、 东方蜜蜂微孢子虫、 西方蜜蜂微孢子 虫等5种常见的蜂类寄生虫为样品， 按常规方法提取DNA后以实施例3的方法进行PCR反应和 结果判定， 由图5可知， 仅熊蜂短膜虫有产生典型的扩增曲线 （Ct值为15.63） ， 其他样品均无 扩增曲线， 说明本试剂盒具有较强的特异性. 以上所述仅为本发明的较佳实施例， 凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修 饰， 皆应属本发明的涵盖范围。。
25、 说明书 4/4 页 6 CN 106755495 A 6 SEQUENCE LISTING 福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心 熊蜂短膜虫实时荧光定量PCR检测试剂盒 3 3 PatentIn version 3.3 1 18 DNA 正向引物Cri-F 1 gttgggaaag agagtcta 18 2 18 DNA 反向引物Cri-R 2 gacgagaagg agagtaag 18 3 25 DNA TaqMan探针qPCR-P 3 aacacacaaa caaaccaaac acaca 25 序列表 1/1 页 7 CN 106755495 A 7 图 1 图 2 说明书附图 1/3 页 8 CN 106755495 A 8 图 3 图 4 说明书附图 2/3 页 9 CN 106755495 A 9 图 5 说明书附图 3/3 页 10 CN 106755495 A 10 。