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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710678003.4 (22)申请日 2017.08.10 (71)申请人 博雅生物制药集团股份有限公司 地址 344000 江西省抚州市高新技术产业 园区惠泉路333号 (72)发明人 梁小明张忠兵刘敏亮何淑琴 黄燚黄璠张猛 (74)专利代理机构 南昌新天下专利商标代理有 限公司 36115 代理人 郭显文 (51)Int.Cl. C07K 14/755(2006.01) C07K 1/36(2006.01) C07K 1/34(2006.01) C07K 1/30(2。
2、006.01) C07K 1/18(2006.01) (54)发明名称 一种人凝血因子的制备方法 (57)摘要 本发明公开了一种人凝血因子的制备方 法， 在人凝血因子制备过程中， 对人血浆初料 处理时采用二步压滤法， 即在冷沉淀溶解之后； 采用K700滤板进行压滤； 收集压滤液； 调整pH值， 加入2%氢氧化铝凝胶吸附； 再EK滤板进行压滤， 采用二步压滤法提高分离效果， 同时结合氢氧化 铝凝胶吸附法去除维生素K依赖的凝血因子， 氢氧化铝凝胶不吸附人凝血因子， 产品收得率 高。 本发明在制备过程中采用二步压滤法替代传 统的二步高速离心法， 及采用CUNODELP深层滤 芯过滤， 两步梯度透析法。
3、， 冻干工艺增加了复溶 复冻工艺等， 同时， 生产过程采用多种病毒去除/ 灭活技术， 可提高产品的收得率， 可减少传播病 毒的风险， 提高临床用药的安全性。 权利要求书3页 说明书8页 附图1页 CN 107226859 A 2017.10.03 CN 107226859 A 1.一种人凝血因子的制备方法， 其特征在于， 在人凝血因子制备过程中， 对人血浆 初料处理时采用二步压滤法， 即在冷沉淀溶解之后； 采用K700滤板进行压滤； 收集压滤液； 调整pH值， 加入2%氢氧化铝凝胶吸附； 再EK滤板进行压滤， 采用二步压滤法提高分离效果， 同时结合氢氧化铝凝胶吸附法去除维生素 K 依赖的凝血因。
4、子， 氢氧化铝凝胶不吸附人凝 血因子， 产品收得率高。 2.根据权利要求1所述的一种人凝血因子的制备方法， 其特征在于， 在人凝血因子 制备过程中， 收集的洗脱液用30KD超滤膜超滤浓缩， 在超滤浓缩时采用两步梯度透析法， 减 少超滤导致的蛋白活性降低， 降低制品中的聚山梨酯80残留量、 磷酸三丁酯残留量和铝残 留量， 用两步梯度透析法为： 加入透析液进行等体积超滤透析液3倍， 再加入透析液进行等体积超滤透析液3 倍， 用0.45um的滤芯过滤得人凝血因子原液； 透析液配制方法： 5.85g氯化钠， 0.9g氯化钙， 2.94g枸橼酸钠， 12g甘氨酸， 补加注射 用水至1L， 调节pH为6.。
5、57.5； 透析液配制方法： 2.94g枸橼酸钠， 12g甘氨酸， 补加注射用 水至1L， 调节pH为6.57.5。 3.根据权利要求1或2所述的一种人凝血因子的制备方法， 其特征在于， 制备方法依 次包括： 人血浆的融解； 低温离心收集冷沉淀； 冷沉淀溶解； K700滤板进行压滤； 收集压滤 液； 调整pH值， 加入2%氢氧化铝凝胶吸附； EK滤板进行压滤， 收集压滤液； 调节pH值， 蛋白浓 度， 滤芯过滤， 收集滤液； S/D法病毒灭活； 调整pH值， 离子强度； 离子交换层析上样， 洗涤， 洗 脱， 收集洗脱液； 超滤， 浓缩， 稀配； 0.22 m滤芯除菌过滤； 无菌分装； 冷冻干燥。
6、； 干热病毒灭 活； 真空检测； 成品入库。 4.根据权利要求3所述的一种人凝血因子的制备方法， 其特征在于， 所述滤芯过滤采 用CUNO DELP深层滤芯过滤， 提高对内毒素和病毒的脱除能力， 能够吸附带负电的内毒素、 病毒及脂质蛋白， 提高产品的纯度， 为患者安全用药提供更为可靠的保证。 5.根据权利要求3所述的一种人凝血因子的制备方法， 其特征在于， 人血浆的融解； 低温离心收集冷沉淀， 称重； 加入冷沉淀重量6倍溶解液， 搅拌至冷沉淀完全溶解， 循环水的 温度控制在2026。 6.根据权利要求3所述的一种人凝血因子的制备方法， 其特征在于， 冷沉淀溶解后， 用K700滤板进行压滤， 控。
7、制压力不大于0.2Mpa， 出液温度为2026， 收集压滤液， 再用 0.5mol/L HCl调节pH至6.466.66； 加入2%氢氧化铝凝胶， 搅拌； 开始用EK滤板进行压滤， 控制压力不大于0.2Mpa， 出液温度为2026， 收集压滤液， 称重。 7.根据权利要求3所述的一种人凝血因子的制备方法， 其特征在于， 二步压滤法后收 集压滤液， 制得物用0.5M氢氧化钠溶液调节上清液pH至6.57.5； 用蛋白浓度缓冲液调节 蛋白浓度不大于15.0g/L； 用CUNO DELP深层滤芯过滤， 收集过滤液， 称重。 8.根据权利要求3所述的一种人凝血因子的制备方法， 其特征在于， 冷冻干燥采用。
8、复 溶复冻工艺， 得人凝血因子冻干品； 复溶复冻工艺如下： 制品常温进柜； 隔板20分钟从常温降至-5， 在-5保持60分钟； 隔板120分钟从-2降到-30， 在-30保持60分钟； 隔板120分钟从-2降到-10， 在-10保持60分钟； 权利要求书 1/3 页 2 CN 107226859 A 2 隔板120分钟从-2降到-30， 在-30保持60分钟； 开真空泵到真空达到0.3mbar稳定； 60分钟隔板升温到-20， 保持480分钟； 90分钟隔板升温到0， 保持240分钟； 180分钟隔板升温到15， 保持240分钟； 240分钟隔板升温到30， 保持120分钟； 抽真空到0.05。
9、mbar， 压塞， 出柜。 9.根据权利要求3所述的一种人凝血因子的制备方法， 其特征在于， 所述人血浆的融 解的溶解液配制方法： 3000IU肝素钠， 2.5g三羟甲基氨基甲烷， 0.75g甘氨酸， 补加注射用水 至1L， 调节pH为6.57.5， 温度控制在2026。 10.根据权利要求7所述的一种人凝血因子的制备方法， 其特征在于， 所述蛋白浓度 缓冲液的配制方法： 2.5g三羟甲基氨基甲烷， 0.9g氯化钙， 4.2g氯化钠， 1.2g甘氨酸， 加适量 注射用水充分溶解， 补加注射用水至1L， 调节pH为6.57.5。 11.根据权利要求1所述的一种人凝血因子的制备方法， 其特征在于，。
10、 （1） 、 检疫期检疫合格的人血浆领取后， 75%乙醇擦拭血浆袋表面， 用注射用水冲洗， 合 并到融浆罐中， 用3035以下循环水融化， 血浆温度控制不高于4； 待融化后， 离心， 出 液温度控制在04， 收集冷沉淀， 称重； （2） 、 将步骤 （1） 的制得物冷沉淀加入其6倍重量的溶解液中， 搅拌至冷沉淀完全溶解， 循环水的温度控制在2026； 开始用K700滤板 （颇尔公司） 进行压滤， 控制压力不大于 0.2Mpa， 出液温度为2026， 收集压滤液， 称重； 溶解液配制方法： 3000IU肝素钠， 2.5g三 羟甲基氨基甲烷， 0.75g甘氨酸， 补加注射用水至1L， 调节pH为6。
11、.57.5， 温度控制在2026 ； （3） 、 将步骤 （2） 的制得物上清液用0.5mol/L HCl调节pH至6.466.66； 加入2%氢氧化 铝凝胶， 搅拌； 开始用EK滤板进行压滤， 控制压力不大于0.2Mpa， 出液温度为2026， 收集 压滤液， 称重， 测蛋白浓度； （4） 、 将步骤 （3） 的制得物压滤液用0.5M氢氧化钠溶液调节pH至6.57.5； 用蛋白浓度 缓冲液调节蛋白浓度不大于15.0g/L； 用CUNO DELP深层滤芯过滤， 收集过滤液， 称重； 蛋白 浓度缓冲液的配制方法： 2.5g三羟甲基氨基甲烷， 0.9g氯化钙， 4.2g氯化钠， 1.2g甘氨酸， 。
12、加 适量注射用水充分溶解， 补加注射用水至1L， 调节pH为6.57.5； （5） 、 按步骤 （4） 的制得物过滤液体积的1/10加入S/D溶液， 搅拌均匀， 温度控制在24 26， 连续保温6小时； 0.45 m滤芯过滤收集滤液； S/D溶液的配制方法： 用清洁容器装约 850ml， 70以上注射用水， 在搅拌情况下加入聚山梨酯80 110g， 再缓慢加入磷酸三丁酯 33g， 继续搅拌至澄清透明后降温至30以下， 补加注射用水至1L； （6） 将步骤 （5） 所得过滤液用2M氯化钠溶液调整电导至35ms/cm （20） ， 再调节pH至6.5 7.5， 称重； （7） 、 将步骤 （6） 。
13、的制得物用经平衡液平衡的Q-Sepharose-FF离子交换柱进行上样， 上 样完毕后用洗涤液洗涤柱子直至成基线， 用洗脱液洗脱， 收集洗脱液， 称重； 平衡液的配制 方法： 2.5g三羟甲基氨基甲烷， 1.0g氯化钙， 17.5g氯化钠， 补加注射用水至1L， 调节pH为6.5 7.5； 洗涤液的配制方法： 2.5g三羟甲基氨基甲烷， 1.0g氯化钙， 19.5g氯化钠， 补加注射用 权利要求书 2/3 页 3 CN 107226859 A 3 水至1L， 调节pH为6.57.5； 洗脱液的配制方法： 2.5g三羟甲基氨基甲烷， 1.0g氯化钙， 58.5g氯化钠， 补加注射用水至1L， 调。
14、节pH为6.57.5； （8） 将步骤 （7） 收集的洗脱液用30KD超滤膜超滤浓缩至1/4后， 加入透析液进行等体 积超滤透析液3倍， 再加入透析液进行等体积超滤透析液3倍， 用0.45um的滤芯过滤得人 凝血因子原液， 送原液样品检测效价及pH值； 透析液配制方法： 5.85g氯化钠， 0.9g氯化 钙， 2.94g枸橼酸钠， 12g甘氨酸， 补加注射用水至1L， 调节pH为6.57.5； 透析液配制方 法： 2.94g枸橼酸钠， 12g甘氨酸， 补加注射用水至1L， 调节pH为6.57.5； （9） 依据人凝血因子原液检测结果， 将步骤 （8） 得到原液加入透析液进行稀配至 24IU/m。
15、l， 调整pH至6.57.5， 即为稀配液； （10） 将步骤 （9） 得到的稀配液经0.22 m除菌滤芯过滤， 过滤后进行分装， 分装规格为 10ml/瓶， 既得人凝血因子半成品； （11） 将步骤 （10） 得到的人凝血因子半成品装入冷冻干燥机进行冷冻干燥， 既得人凝 血因子冻干品； 冻干工艺： 制品常温进柜； 隔板20分钟从常温降至-5， 在-5保持60分钟； 隔板120分钟从-2降到-30， 在-30保持60分钟； 隔板120分钟从-2降到-10， 在-10保持60分钟； 隔板120分钟从-2降到-30， 在-30保持60分钟； 开真空泵到真空达到0.3mbar稳定； 60分钟隔板升温。
16、到-20， 保持480分钟； 90分钟隔板升温到0， 保持240分钟； 180分钟隔板升温到15， 保持240分钟； 240分钟隔板升温到30， 保持120分钟； 抽真空到0.05mbar， 压塞， 出柜； （12） 将步骤 （11） 得到的人凝血因子冻干品出柜， 扎盖， 后将制品装入水浴灭菌柜进 行99100、 30分钟、 压力0.4Mpa干热灭活； （13） 将步骤 （12） 得到的人凝血因子制品进行真空检测， 真空合格制品送检， 检验合格 后包装； 所述百分数除有限定之外， 其余为质量百分数。 权利要求书 3/3 页 4 CN 107226859 A 4 一种人凝血因子的制备方法 技术领。
17、域 0001 本发明涉及一种人凝血因子的制备方法， 属于生物制药领域。 背景技术 0002 甲型血友病(HA)为最常见的遗传性出血性疾病， 系由血浆中凝血因子(F)缺 失所致。 F基因位于X染色体， 所以患者绝大多数为男性， 女性杂合子为携带者， 而女性患 者极少见。 重型患者自幼即有反复自发性出血， 不经治疗者往往造成关节畸形和致残， 严重 者可因颅内出血死亡。 目前仍以替代疗法为主， 如全血、 冷沉淀、 人凝血因子制剂等， 由于 全血和冷沉淀纯度低、 输注量大、 副反应多、 存在传播血液病毒的风险等， 临床全血或冷沉 淀替代疗法已少用， 多用人凝血因子制剂替代疗法。 0003 人凝血因子亦。
18、称抗血友病球蛋白， 是一种血浆糖蛋白， 在凝血机制中的内部途 径的级联反应中起着必不可少的作用。 临床上广泛应用于治疗甲型血友病和获得性凝血因 子缺乏而致的出血症状及这类病人的手术出血治疗。 0004 随着蛋白质纯化技术的发展， 以冷沉淀或Cohn组分I为原料的各种纯化方法不断 建立、 完善和改良， 纯度越来越高F产品相继产生。 低温乙醇法、 凝胶过滤法、 离子交换层 析法、 亲和层析等方法都是制备F制剂的有效方法， 特别是几种方法的联合使用， 使F的 纯度甚至比原血浆有较大幅度的提高。 纯度越来越高的F制剂在甲型血友病的治疗中发 挥着巨大的作用。 目前一般接受治疗的血友病人都能够进行正常的生。
19、活和工作， 生活质量 和平均寿命基本接近正常人。 0005 F在血浆中的含量极微， 1ml血浆中仅含0.10.2 g， 故其纯品的获得受到蛋白 纯化技术发展的限制而极为困难。 由于国家对原料血浆的严格控制和人凝血因子提取困 难， 国内只有少数几家公司生产人凝血因子， 而我国甲型血友病患者保守估计为710 万， 临床需求巨大， 导致人凝血因子临床供应十分紧张， 甚至出现 “一药难求” 的现象。 国 家食品药品监督管理局批准拜耳医药生产的重组人凝血因子在国内上市， 但其高昂的价 格(约6元/IU)让国内普通的患者难以承受。 而国内生产的人凝血因子价格(约2元/IU)， 远低于进口重组人凝血因子， 。
20、可大大降低患者的医疗成本。 本发明为健康人血浆经低温 离心分离得到冷沉淀， 再经粗分离、 离子交换层析提纯、 超滤、 进行脂包膜病毒灭活(有机溶 剂/去污剂法， S/D法)、 配制、 除菌过滤、 分装冻干， 冻干后再进行非脂包膜病毒灭活或去除 处理(干热法， 100， 30分钟)制成人凝血因子。 对缺乏人凝血因子所致的凝血机能障 碍具有纠正作用， 主要用于防治甲型血友病和获得性凝血因子缺乏而致的出血症状及这 类病人的手术出血治疗。 0006 传统人凝血因子制备方法中有甘氨酸沉淀法、 PEG沉淀法、 酸沉淀法、 离子交换 层析法等， 制备过程中多采用高速离心法去除杂质不溶物， 由于人凝血因子易激。
21、活、 易水 解， 特别是剧烈条件易导致活性丧失， 蛋白激活从而影响制品的质量。 其次， 人凝血因子 制备过程颗粒物的去除多采用滤芯过滤去除如用1.0 m、 0.65. m、 0.45 m等， 该种滤芯可去 除蛋白颗粒物， 但很难去除可溶性的脂质蛋白。 再者人凝血因子冷冻干燥过程冻干工艺 说明书 1/8 页 5 CN 107226859 A 5 不成熟易引起蛋白活性损失、 质量不合格等。 0007 在人凝血因子制备方法中还应该注意到溶解性、 复溶时间、 效价及比活性等问 题。 由于人凝血因子存在含量低、 易激活、 易水解等现象， 导致在制备过程中存在以下问 题(1)纯度不高， 产品杂质含量偏多，。
22、 临床使用易发生皮疹、 心动过速、 发热等不良反应； (2) 效价及比活性低， 由于制备过程中易激活、 易水解， 导致产品的效价及比活性低， 从而影响 临床疗效； (3)得率不高， 由于血浆中人凝血因子含量低， 提取困难， 导致得率低； (4)可能 存在传播血液病毒的风险。 0008 本申请人是一家经国家认定的血液制品定点生产单位。 正在研发人凝血酶原复合 物和凝血因子等系列产品， 力争成为全国血液制品行业中品种最多、 规格最全的厂家之 一。 先后申请授权了多项有关人凝血因子的发明专利并查询对比国内现有的人凝血因子 的发明专利， 如： 0009 ZL201010534849.9 一种人凝血因子。
23、的制备工艺 ， 制备工艺包括取冷沉淀： 室 温融解1-2h， 处理成1.8-2.2cm的方块； 冷沉淀溶解； 铝胶吸附； 离心收集上清液； 酸沉淀； 离 心收集上清液； S/D灭活； 过滤； DEAEsepHaroseFF层析柱平衡； 层析； 洗涤； 洗脱； 超滤透析， 配液； 分装； 冻干； 干热灭活。 本发明它采用离子交换层析技术， 并在生产工艺采用离心法结 合氢氧化铝凝胶吸附及酸沉淀法去除杂质； 此外生产过程中采用S/D法去除脂包膜病毒及 99.50.5干热法去除非脂包膜病毒， 经过这2次病毒灭活步骤显著提高了临床用药的安 全性。 0010 CN201510879630.5 一种冻干人凝。
24、血因子的制备方法 ， 制备工艺包括取冷沉淀 的溶解， 50P滤板串联0.45 m滤芯过滤， 收集澄清滤液； DEAESephadexA-50凝胶去除维生素K 依赖的凝血因子； 阴离子交换树脂柱层析纯化F； 超滤透析并浓缩洗脱液； 浓缩液中加入 稳定剂并调节F的效价及pH值； 纳米膜除病毒过滤； 除菌过滤及分装； 冻干； 干热病毒灭 活。 该制备工艺采用DEAESephadexA-50凝胶吸附去除维生素K依赖的凝血因子， 代替传统的 氢氧化铝及PEG沉淀方式， 具有生产稳定、 得率高、 质量好的优点； 采用三步病毒灭除措施使 产品的安全性大大提高。 0011 ZL 201410524351.2 。
25、一种从冷沉淀提取凝血因子的废料中提取人纤维蛋白原 的制备工艺 ， 包括： 冷沉淀溶解、 离心收集上清液、 2氢氧化铝凝胶吸附、 离心收集上清 液、 调节离子强度、 串联过滤、 S/D病毒灭活、 离子交换层析、 EDTA除Ca2+、 甘氨酸沉淀、 第一 次低温乙醇沉淀、 AT-抑制凝血酶、 第二次低温乙醇沉淀、 纳米膜过滤以及干热灭活。 本发 明为了确保安全性， 除了S/D及干热灭活外， 新增纳米膜过滤除病毒； 新增AT-灭活凝血酶 及EDTA除Ca2+工艺， 有效阻止在生产过程中纤维蛋白原激活成纤维蛋白； 用甘氨酸沉淀去 除制品中的纤维蛋白单体和多聚体， 以获得高纯度的人纤维蛋白原； 所得制剂。
26、产品安全可 靠， 复溶时间短， 满足临床上救急之需， 同时间接节约稀缺血浆资源具有重要意义。 0012 CN201610077346.0 一种从冷沉淀提取凝血因子的废料中提取人血管性血友病 因子的制备工艺 ， 用一步Q-Sepharose阴离子交换层析及一步亲和层析纯化得到纯度较高 的vWF： 收集冷沉淀提取凝血因子的废料即在冷沉淀提取凝血因子的制备中经层析柱 流出来的液体作为原料； 通过Q-Sepharose离子交换柱层析后， 收集洗脱液， 再经明胶亲和 层析， 去除残余的纤维结合蛋白及杂质， 得到血管性血友病因子。 本发明获得高纯度的血管 性血友病因子， 质量可靠， 可满足临床上血管性血友。
27、病人急需的治疗用药需求。 同时对于冷 说明书 2/8 页 6 CN 107226859 A 6 沉淀的综合利用， 间接节约稀缺血浆资源具有十分重要的意义。 0013 目前， 人凝血因子为治疗甲型血友病的特效药， 目前国内市场仍处于短缺状况， 开发人凝血因子可提高血浆这一宝贵资源的利用率， 增加血液制品的附加值， 有效降低 甲型血友病患者的医疗成本， 部分缓解人凝血因子临床用药的紧张局面。 发明内容 0014 本发明的目的在于提供一种新的人凝血因子的制备方法。 0015 本发明的主要技术构思如下： 0016 本发明于人血浆融解后， 经二步压滤粗分离人凝血因子； 对经前期粗分离后的 蛋白液经一步Q。
28、-sepharose-FF离子交换， 效价及比活性进一步提高， 再经干热灭活， 进一步 提高临床用药的安全性； 0017 本发明的制备工艺， 依次包括： 人血浆的融解、 低温离心收集冷沉淀、 冷沉淀溶解、 K700滤板进行压滤， 收集压滤液、 调整pH值， 加入2氢氧化铝凝胶吸附、 EK滤板进行压滤， 收集压滤液、 调节pH值， 蛋白浓度， CUNO DELP深层滤芯过滤， 收集滤液、 S/D法病毒灭活、 调 整pH值， 离子强度、 离子交换层析上样， 洗涤， 洗脱， 收集洗脱液、 两步梯度透析， 浓缩， 稀配、 0.22 m滤芯除菌过滤、 无菌分装、 冷冻干燥、 干热病毒灭活、 真空检测、 。
29、成品入库。 本发明是 这样来实现的， 其具体工艺方案如下： 0018 (1)、 检疫期检疫合格的人血浆领取后， 75乙醇擦拭血浆袋表面， 用注射用水冲 洗， 合并到融浆罐中， 用3035以下循环水融化， 血浆温度控制不高于4； 待融化后， 离 心， 出液温度控制在04， 收集冷沉淀， 称重； 0019 (2)、 将步骤(1)的制得物冷沉淀加入其6倍重量的溶解液中， 搅拌至冷沉淀完全溶 解， 循环水的温度控制在2026； 开始用K700滤板(颇尔公司)进行压滤， 控制压力不大于 0.2Mpa， 出液温度为2026， 收集压滤液， 称重； 溶解液配制方法： 3000IU肝素钠， 2.5g三 羟甲基。
30、氨基甲烷， 0.75g甘氨酸， 补加注射用水至1L， 调节pH为6.57.5， 温度控制在2026 ； 0020 (3)、 将步骤(2)的制得物上清液用0.5mol/L HCl调节pH至6.466.66； 加入2氢 氧化铝凝胶， 搅拌； 开始用EK滤板进行压滤， 控制压力不大于0.2Mpa， 出液温度为2026， 收集压滤液， 称重， 测蛋白浓度； 0021 (4)、 将步骤(3)的制得物压滤液用0.5M氢氧化钠溶液调节pH至6.57.5； 用蛋白 浓度缓冲液调节蛋白浓度不大于15.0g/L； 用CUNO DELP深层滤芯过滤， 收集过滤液， 称重； 蛋白浓度缓冲液的配制方法： 2.5g三羟甲。
31、基氨基甲烷， 0.9g氯化钙， 4.2g氯化钠， 1.2g甘氨 酸， 加适量注射用水充分溶解， 补加注射用水至1L， 调节pH为6.57.5； 0022 (5)、 按步骤(4)的制得物过滤液体积的1/10加入S/D溶液， 搅拌均匀， 温度控制在 2426， 连续保温6小时； 0.45 m滤芯过滤收集滤液； S/D溶液的配制方法： 用清洁容器装 约850ml， 70以上注射用水， 在搅拌情况下加入聚山梨酯80 110g， 再缓慢加入磷酸三丁酯 33g， 继续搅拌至澄清透明后降温至30以下， 补加注射用水至1L； 0023 (6)将步骤(5)所得过滤液用2M氯化钠溶液调整电导至35ms/cm(20。
32、)， 再调节pH 至6.57.5， 称重； 0024 (7)、 将步骤(6)的制得物用经平衡液平衡的Q-Sepharose-FF离子交换柱进行上 说明书 3/8 页 7 CN 107226859 A 7 样， 上样完毕后用洗涤液洗涤柱子直至成基线， 用洗脱液洗脱， 收集洗脱液， 称重； 平衡液的 配制方法： 2.5g三羟甲基氨基甲烷， 1.0g氯化钙， 17.5g氯化钠， 补加注射用水至1L， 调节pH 为6.57.5； 洗涤液的配制方法： 2.5g三羟甲基氨基甲烷， 1.0g氯化钙， 19.5g氯化钠， 补加 注射用水至1L， 调节pH为6.57.5； 洗脱液的配制方法： 2.5g三羟甲基氨。
33、基甲烷， 1.0g氯化 钙， 58.5g氯化钠， 补加注射用水至1L， 调节pH为6.57.5； 0025 (8)将步骤(7)收集的洗脱液用30KD超滤膜超滤浓缩至1/4后， 加入透析液进行 等体积超滤透析液3倍， 再加入透析液进行等体积超滤透析液3倍， 用0.45um的滤芯过滤 得人凝血因子原液， 送原液样品检测效价及pH值； 透析液配制方法： 5.85g氯化钠， 0.9g 氯化钙， 2.94g枸橼酸钠， 12g甘氨酸， 补加注射用水至1L， 调节pH为6.57.5； 透析液配制 方法： 2.94g枸橼酸钠， 12g甘氨酸， 补加注射用水至1L， 调节pH为6.57.5； 0026 (9)依。
34、据人凝血因子原液检测结果， 将步骤(8)得到原液加入透析液进行稀配 至24IU/ml， 调整pH至6.57.5， 即为稀配液； 0027 (10)将步骤(9)得到的稀配液经0.22 m除菌滤芯过滤， 过滤后进行分装， 分装规格 为10ml/瓶， 既得人凝血因子半成品； 0028 (11)将步骤(10)得到的人凝血因子半成品装入冷冻干燥机进行冷冻干燥， 既得 人凝血因子冻干品； 0029 冻干工艺： 0030 制品常温进柜； 0031 隔板20分钟从常温降至-5， 在-5保持60分钟； 0032 隔板120分钟从-2降到-30， 在-30保持60分钟； 0033 隔板120分钟从-2降到-10，。
35、 在-10保持60分钟； 0034 隔板120分钟从-2降到-30， 在-30保持60分钟； 0035 开真空泵到真空达到0.3mbar稳定； 0036 60分钟隔板升温到-20， 保持480分钟； 0037 90分钟隔板升温到0， 保持240分钟； 0038 180分钟隔板升温到15， 保持240分钟； 0039 240分钟隔板升温到30， 保持120分钟； 0040抽真空到0.05mbar， 压塞， 出柜； 0041 (12)将步骤(11)得到的人凝血因子冻干品出柜， 扎盖， 后将制品装入水浴灭菌 柜进行99100、 30分钟、 压力0.4Mpa干热灭活； 0042 (13)将步骤(12)。
36、得到的人凝血因子制品进行真空检测， 真空合格制品送检， 检验 合格后包装； 0043 所述百分数除有限定之外， 其余为质量百分数。 0044 本发明相比于传统的人凝血因子制备方法， 创新点在于： 0045 1、 在人凝血因子制备过程中采用二步压滤法(K700压滤法和EK压滤法)替代现 有的高速离心法， 如专利ZL201010534849.9、 ZL 201410524351.2、 CN201610077346.0均采 用二步离心法， 专利ZL201410496187.9采用一步离心法。 由于人凝血因子制备过程中采 用高速离心法容易引起激活， 水解， 导致收得率下降， 部分产品的外观不合格等。 。
37、而采用压 滤法进液速度不需随时调节， 出液温度几乎不变， 条件温和， 不易导致蛋白变性， 可有效提 说明书 4/8 页 8 CN 107226859 A 8 高产品的收得率约10。 专利CN201510879630.5采用一步50P压滤法结合DEAESephadexA- 50凝胶去除维生素K依赖的凝血因子 ， 其中采用一步50P压滤法分离效果有限 ， DEAESephadexA-50凝胶在使用过程中吸附人凝血因子导致得率有所下降且工艺复杂， 而 本方法采用二步压滤法可提高分离效果， 结合氢氧化铝凝胶吸附法去除维生素K依赖的凝 血因子， 氢氧化铝凝胶不吸附人凝血因子， 产品收得率高。 0046 。
38、2、 采用CUNO DELP深层滤芯过滤， 提高对内毒素和病毒的脱除能力， 能够吸附带负 电的内毒素、 病毒及脂质蛋白， 提高产品的纯度， 为患者安全用药提供更为可靠的保证。 现 有制备人凝血因子的过程中多采用筒式滤芯过滤， 可去除颗粒物， 但无对内毒素、 病毒、 脂蛋白的脱除能力， 如专利ZL201010534849.9、 ZL201410524351.2、 CN201510879630.5、 CN201610077346.0等采用筒式滤芯。 0047 3、 采用两步梯度透析法， 不仅可以减少超滤导致的蛋白活性降低， 也可有效降低 制品中的聚山梨酯80残留量、 磷酸三丁酯残留量、 铝残留量。。
39、 国内大多专利采用一步透析 法， 超滤过程中可能导致的蛋白活性降低， 对聚山梨酯80残留量、 磷酸三丁酯残留量、 铝残 留量的去除效果低于两步梯度透析法， 如专利ZL201010534849.9、 ZL201410524351.2、 CN201510879630.5、 CN201610077346.0等均采用一步透析法。 0048 4、 将步骤(2)的制得物蛋白上清液用0.5mol/L HCl调节pH至6.466.66， 进行酸 沉淀可去除大量的人纤维蛋白原， 提高产品的纯度， 防止制品的激活。 pH过低可去除更多人 纤维蛋白原， 但人凝血因子的稳定性降低； pH过高， 去除人纤维蛋白原的量有。
40、限， 导致产 品纯度较低， 如ZL201010534849.9采用调节pH至6.256.45。 0049 5、 采用自主研究的人凝血因子冻干工艺， 该冻干工艺增加了复溶复冻工艺， 冻 干时可保证产品冻结完全， 降低最终制品水分， 保护制品的活性， 提升产品的质量。 国内大 多人凝血因子冻干工艺专利中采用直接冻结过程， 有时导致部分产品不能冻结完全， 最 终制品水分偏高， 如ZL201010534849.9冻干过程中采用直接冻结过程， 产品的合格率约 85， 而本冻干工艺增加了复溶复冻工艺， 产品的合格率约93。 0050 本发明制备方法的创新不是简单替换， 是基于到整个工艺的重新设计， 创造性。
41、地 采用了新的技术路线组合， 主要表现在积极效果方面： 0051 1、 在人凝血因子制备过程中采用二步压滤法替代传统的高速离心法， 可有效提 高产品的收得率约10， 提升产品的质量。 0052 2、 该专利技术的实施， 提升产品质量， 人凝血因子比活性可提升至20IU/mg以 上， 高于现行版药典要求(10IU/mg)； 复溶时间为10分钟内溶解完全， 高于现行版药典要求 (30分钟)。 0053 3、 采用两步梯度透析法， 不仅可以减少超滤导致的蛋白活性降低， 而且可有效去 除制品中的聚山梨酯80残留量、 磷酸三丁酯残留量、 铝残留量， 均高于现行版药典要求。 0054 4、 生产过程采用多。
42、种病毒去除/灭活技术， 如S/D法灭活脂包膜病毒、 干热法灭活 非脂包膜病毒、 CUNO DELP深层滤芯过滤吸附病毒颗粒、 离子交换层析吸附病毒颗粒等， 可 减少传播病毒的风险， 提高临床用药的安全性。 0055 5、 在血浆原料日趋紧缺的今天， 通过从冷沉淀提取凝血因子， 对冷沉淀的综合 利用， 提高市场竞争力具有重大意义， 另一方面也能间接节约稀缺血浆资源。 说明书 5/8 页 9 CN 107226859 A 9 附图说明 0056 图1为本发明工艺流程图。 具体实施方式 0057 本发明通过下面的实施例可以对本发明作进一步的描述， 然而， 本发明的范围并 不限于下述实施例。 0058。
43、 实施例1： 以5000升血浆为例， 具体制备工艺如下： 0059 (1)、 检疫期检疫合格的人血浆领取后， 75乙醇擦拭血浆袋表面， 用注射用水冲 洗， 合并到融浆罐中， 用3035以下循环水融化， 血浆温度控制不高于4； 待融化后， 离 心， 出液温度控制在04， 收集得冷沉淀34.2kg； 0060 (2)、 将步骤(1)的制得的冷沉淀加入205L溶解液中， 搅拌至冷沉淀完全溶解， 循环 水的温度控制在2026； 开始用K700滤板进行压滤， 控制压力不大于0.2Mpa， 出液温度为 2026， 收集压滤液， 称重236.2kg； 0061 (3)、 将步骤(2)的制得物上清液用0.5m。
44、ol/L HCl调节pH至6.51； 加2氢氧化铝凝 胶80kg， 搅拌； 开始用EK滤板进行压滤， 控制压力不大于0.2Mpa， 出液温度为2026， 收集 压滤液， 称重260.4kg， 蛋白浓度为1.6； 0062 (4)、 将步骤(3)的制得物压滤液用0.5M氢氧化钠溶液调节上清液pH至6.96； 加入 蛋白浓度缓冲液17.4kg调节蛋白浓度为15.0g/L； 用CUNO DELP深层滤芯过滤， 收集过滤液， 称重278.6kg； 0063 (5)、 按步骤(4)的制得物加入S/D溶液27.8kg， 搅拌均匀， 温度控制在2426， 连 续保温6小时； 0.45 m滤芯过滤， 收集滤液。
45、274.6kg； 0064 (6)将步骤(5)所得过滤液用2M氯化钠溶液调整电导至35ms/cm(20)， 再调节pH 至7.1， 称重308.2kg； 0065 (7)、 将步骤(6)的制得物超滤液用经平衡液平衡的Q-sepharose-FF离子交换柱进 行上样， 上样完毕后用平衡液洗涤柱子直至成基线， 用洗脱液洗脱， 收集洗脱液， 称量81kg； 0066 (8)将步骤(7)收集的洗脱液用30KD超滤膜超滤浓缩至20kg， 加入透析液进行等 体积超滤透析液3倍， 再加入透析液进行等体积超滤透析液3倍， 用0.45um的滤芯过滤得 人凝血因子原液， 称重17.3kg， 检测效价36.2IU/。
46、ml及pH值为6.9； 0067 (9)依据人凝血因子原液检测结果， 将步骤(8)得到原液加入透析液8.8kg进 行稀配至24IU/ml， 调整pH至7.0， 即为稀配液26.1kg； 0068 (10)将步骤(9)得到的稀配液经0.2 m除菌滤芯过滤， 过滤后进行分装， 分装规格 为10ml/瓶， 既得人凝血因子半成品； 0069 (11)将步骤(10)得到的人凝血因子半成品装入冷冻干燥机进行冷冻干燥， 既得 人凝血因子冻干品； 0070 冻干工艺： 0071 制品常温进柜； 0072 隔板20分钟从常温降至-5， 在-5保持60分钟； 0073 隔板120分钟从-2降到-30， 在-30保。
47、持60分钟； 说明书 6/8 页 10 CN 107226859 A 10 0074 隔板120分钟从-2降到-10， 在-10保持60分钟； 0075 隔板120分钟从-2降到-30， 在-30保持60分钟； 0076 开真空泵到真空达到0.3mbar稳定； 0077 60分钟隔板升温到-20， 保持480分钟； 0078 90分钟隔板升温到0， 保持240分钟； 0079 180分钟隔板升温到15， 保持240分钟； 0080 240分钟隔板升温到30， 保持120分钟； 0081抽真空到0.05mbar， 压塞， 出柜； 0082 (12)将步骤(11)得到的人凝血因子冻干品出柜， 扎盖。
48、， 后将制品装入水浴灭菌 柜进行99100、 30分钟、 压力0.4Mpa干热灭活； 0083 (13)将步骤(12)得到的人凝血因子制品进行真空检测， 真空合格制品送检， 检 验合格后包装； 0084 所述百分数除有限定之外， 其余为质量百分数。 0085 本发明方法产品的收得率、 合格率与传统的人凝血因子制备方法比较如下表1。 0086 表1 0087 0088 0089 本发明方法制备的产品与 中国药典 (2015年版， 三部)中描述的人凝血因子在 关键质量指标的对比如下表2。 0090 表2 说明书 7/8 页 11 CN 107226859 A 11 0091 说明书 8/8 页 12 CN 107226859 A 12 图1 说明书附图 1/1 页 13 CN 107226859 A 13 。