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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710025330.X (22)申请日 2017.01.13 (71)申请人 广东康普泰生物科技有限公司 地址 528000 广东省佛山市南海区桂城街 道深海路17号瀚天科技城A区8号楼十 三楼1304单元 (72)发明人 毛海燕 (74)专利代理机构 广州嘉权专利商标事务所有 限公司 44205 代理人 王国标 (51)Int.Cl. C12N 5/10(2006.01) (54)发明名称 CAR修饰的NK细胞的制备方法 (57)摘要 本发明提供了一种CAR修饰的NK细胞。
2、的制备 方法， 构建嵌合抗原受体基因重组到病毒载体上 并转染NK细胞； 所述CAR基因的cDNA构建在病毒 载体中， 并转染NK细胞， 再将NK细胞培养到第21 天， 获得CAR-NK细胞； 通过荧光定量PCR技术检 测， 转染了CAR病毒载体的NK细胞其表达CAR基因 高于未转染的NK细胞为50倍以上； 所获得的CAR- NK细胞能高表达CAR基因， 可特异结合表达信号 淋巴细胞激活分子家族成员的肿瘤细胞， 并抑制 NK细胞抑制性受体表达， 阻止了肿瘤细胞免疫逃 避， 同时激活第一信号和共刺激信号； 其高表达 其特异标志物CD16。 权利要求书1页 说明书2页 CN 106701685 A 。
3、2017.05.24 CN 106701685 A 1.CAR修饰的NK细胞的制备方法， 其特征在于， 构建成含特异结合信号淋巴细胞激活分 子家族成员的嵌合抗原受体基因重组到病毒载体上并转染NK细胞； 所述CAR基因的cDNA构建在病毒载体中， 并转染NK细胞， 再将NK细胞培养到第21天， 获 得CAR-NK细胞； 通过荧光定量PCR技术检测， 转染了CAR病毒载体的NK细胞其表达CAR基因高 于未转染的NK细胞为50倍以上； 所获得的CAR-NK细胞能高表达CAR基因， 可特异结合表达信号淋巴细胞激活分子家族 成员的肿瘤细胞， 并抑制NK细胞抑制性受体表达， 阻止了肿瘤细胞免疫逃避， 同时。
4、激活第一 信号和共刺激信号； 其高表达其特异标志物CD16， 阳性率高于80以上， 激活性受体阳性率 超过80以上， 而抑制性受体阳性率低于10以下。 2.根据权利要求1所述的CAR修饰的NK细胞的制备方法， 其特征在于， 所述的含特异结 合信号淋巴细胞激活分子家族成员的特异嵌合抗原受体基因， 包括特异结合信号淋巴细胞 激活分子家族成员7的单链抗体并串联了两个共刺激分子胞内域和CD3 胞内信号区的基因 片段； 所述两个共刺激分子为CD28和CD137。 3.根据权利要求1或2所述的CAR修饰的NK细胞的制备方法， 其特征在于， 所述NK细胞来 源于自体静脉血、 自体骨髓、 脐带血和胎盘血等的单。
5、个核细胞。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106701685 A 2 CAR修饰的NK细胞的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及引入外来遗传物质修饰细胞技术领域， 特别涉及一种CAR修饰的NK细 胞的制备方法。 背景技术 0002 自然杀伤 (Natural Killer， 缩写NK)细胞是非特异性免疫系统的重要组成部分， 先天免疫系统反应的关键性介质细胞。 NK细胞是一种广谱免疫细胞， 具有快速发现和摧毁 异常细胞(如癌症或病毒感染的细胞)的特异功能， 而且不需要提前致敏或HLA配型， 即可展 示强大的溶解异常细胞的活性。 使用免疫细胞 （包括NK细胞） 来治疗癌症是近年来新趋势， 。
6、这种新疗法有望为对传统手术、 化疗和放疗无效的肿瘤提供了新的治愈希望。 0003 嵌合抗原受体 （Chimeric Antigen Receptor， 缩写CAR） 修饰的免疫细胞使用遗传 生物工程手段修饰免疫细胞使其表达外源性抗肿瘤基因。 CAR基因主要包括细胞外识别域 和细胞内信号转导结构域： 前者用于识别肿瘤表面特异性分子和后者用于启动识别肿瘤表 面分子后的免疫细胞应答， 发挥细胞毒作用。 其主要以T-细胞为载体， 但CAR-T细胞存在细 胞因子风暴， 靶向/脱靶毒性和神经毒性等问题. 抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 （Antibody-Dependent Cell-Mediated Cy。
7、totoxicity， 缩写ADCC） 是抗体首先结合到癌靶细胞上， 然后抗体的另一端与免疫效应细 胞结合， 促进效应细胞杀死被抗体结合的癌靶细胞。 发明内容 0004 本发明旨在提供一种CAR修饰的NK细胞的制备方法， 使自然杀伤细胞同时具有嵌 合抗原受体修饰， 以及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用。 0005 本发明所采取的技术方案是： CAR修饰的NK细胞的制备方法， 构建成含特异结合信号淋巴细胞激活分子家族成员的 嵌合抗原受体基因重组到病毒载体上并转染NK细胞； 所述CAR基因的cDNA构建在病毒载体中， 并转染NK细胞， 再将NK细胞培养到第21天， 获 得CAR-NK细胞； 通过荧。
8、光定量PCR技术检测， 转染了CAR病毒载体的NK细胞其表达CAR基因高 于未转染的NK细胞为50倍以上； 所获得的CAR-NK细胞能高表达CAR基因， 可特异结合表达信号淋巴细胞激活分子家族 成员的肿瘤细胞， 并抑制NK细胞抑制性受体表达， 阻止了肿瘤细胞免疫逃避， 同时激活第一 信号和共刺激信号； 其高表达其特异标志物CD16， 阳性率高于80以上， 激活性受体阳性率 超过80以上， 而抑制性受体阳性率低于10以下。 0006 所述的含特异结合信号淋巴细胞激活分子家族成员的特异嵌合抗原受体基因， 包 括特异结合信号淋巴细胞激活分子家族成员7的单链抗体并串联了两个共刺激分子胞内域 和CD3 。
9、胞内信号区的基因片段； 所述两个共刺激分子为CD28和CD137。 0007 所述NK细胞来源于自体静脉血、 自体骨髓、 脐带血和胎盘血等的单个核细胞。 说明书 1/2 页 3 CN 106701685 A 3 0008 本发明的有益效果是： 1） NK细胞是先天性细胞， 非特异性免疫系统的重要组成部分， 具有强大的肿瘤细胞溶 解活性， 不需要提前致敏或HLA配型， 克服了某些肿瘤逃逸机制； 2） 现有的CAR-T细胞只依靠CAR来识别和杀死肿瘤细胞。 NK细胞与CAR-T细胞不同， 可以 同时通过多种NK细胞自身表达的激活型受体激发细胞毒性作用。 也可以敲除NK细胞内抑制 性信号通路， 或通。
10、过ADCC作用， 来加强NK细胞杀死肿瘤细胞的作用； 3） 现有以T细胞作为CAR基因载体， 其异体应用时会产生移植物抗宿主病 (GVHD） 。 由于 NK细胞作用是非MHC-限制性， 使用上没有必要与病人个体的组织相容性复合物相匹配， 也 就是NK细胞可用于异体病人细胞治疗， 有可能建立从健康 （异体） 供体采集扩增的off-the- shelf （ “拿来即用” ） 的细胞药品， 具有广泛的临床应用价值； 4) NK细胞较易浸润实体瘤。 NK细胞在体内可通过其独特的作用机理， 如与树突状细胞 的相互作用及大量释放一些重要的细胞因子， 来修改实体瘤的免疫环境； 5） 由于NK细胞在体内生存较。
11、为短暂的性质， 临床应用时不用象CAR-T细胞那样添加自 杀基因； 6） NK细胞可利用其专门的IgG低亲和力受体CD16与抗体结合， 是体内发挥ADCC作用的 主要效应细胞。 有实验数据证实西妥昔单抗的治疗作用主要是由于NK细胞的ADCC。 因此， 刺 激NK细胞的先天免疫应答， 增强西妥昔单抗的ADCC作用。 在西妥昔单抗使用上增强NK细胞 的作用也能增强获得性免疫 （也称特异性免疫或适应性免疫反应） 反应， 因为NK细胞与树突 状细胞的 “对话” ， 可导致西妥昔单抗治疗中的肿瘤抗原特异性T细胞应答。 具体实施方式 0009 本领域技术人员将会理解， 下列实施例仅用于说明本发明， 而不应。
12、视为限定本发 明的范围。 实施例中未注明具体技术或条件者， 按照本领域内的文献所描述的技术或条件 （例如参考J. 萨姆布鲁克等著， 黄培堂等译的 分子克隆实验指南 ， 第三版， 科学出版社） 或者按照产品说明书进行。 所用试剂或仪器未注明生产厂商者， 均为可以通过市购获得的 常规产品。 0010 CAR修饰的NK细胞的制备方法， 构建成含特异结合信号淋巴细胞激活分子家族成 员的嵌合抗原受体基因重组到病毒载体上并转染NK细胞； 所述CAR基因的cDNA构建在病毒 载体中， 并转染NK细胞， 再将NK细胞培养到第21天， 获得CAR-NK细胞； 通过荧光定量PCR技术 检测， 转染了CAR病毒载体。
13、的NK细胞其表达CAR基因高于未转染的NK细胞为50倍以上； 所获 得的CAR-NK细胞能高表达CAR基因， 可特异结合表达信号淋巴细胞激活分子家族成员的肿 瘤细胞， 并抑制NK细胞抑制性受体表达， 阻止了肿瘤细胞免疫逃避， 同时激活第一信号和共 刺激信号； 其高表达其特异标志物CD16， 阳性率高于80以上， 激活性受体阳性率超过80 以上， 而抑制性受体阳性率低于10以下。 0011 其中， 所述的含特异结合信号淋巴细胞激活分子家族成员的特异嵌合抗原受体基 因， 包括特异结合信号淋巴细胞激活分子家族成员7的单链抗体并串联了两个共刺激分子 胞内域和CD3 胞内信号区的基因片段； 所述两个共刺激分子为CD28和CD137。 0012 进一步， 所述NK细胞来源于自体静脉血、 自体骨髓、 脐带血和胎盘血等的单个核细 胞。 说明书 2/2 页 4 CN 106701685 A 4 。