一种亲和素/链亲和素磁性复合微粒用于细胞分选的方法.pdf

本发明涉及一种利用亲和素/链亲和素磁性复合微粒用于对目的细胞分选的方法。该方法是在实验体系中加入生物素标记的单抗，磁粒通过亲和素/链亲和素与生物素标记的单抗结合，单抗与细胞表面相应抗原特异结合从而使细胞被磁粒捕获，达到纯化分离细胞的目的。由于生物素-亲和素，生物素-链亲和素具有系统特异性强、稳定性高、适用范围广、实验成本低的特点，所以得到的亲和素/链亲和素磁性复合微粒具有高生物素结合活性，在检测技术中标记量提高，且不易使生物分子变性失活，进一步提高了细胞分选的特异性。通过生物素与亲和素或链亲和素的特异结合能够高纯度的分选得到目的细胞，该方法不需要昂贵的仪器，且操作过程简单省时。

1.  一种亲和素/链亲和素磁性复合微粒用于细胞分选的方法，该方法包括以下步骤：
(1)亲和素/链亲和素磁性复合微粒的预处理
将亲和素/链亲和素磁性复合微粒分散于平衡盐溶液中，磁性分离，弃上清；
(2)封闭
向步骤(1)产物中加入封闭剂，反应20-120分钟，再用pH＝7.4，0.02M的磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液或醋酸盐缓冲液清洗；
(3)生物素化抗体与细胞的孵育
取待分选的样本细胞，加入生物素抗体，室温反应10-60分钟，再以800rpm-1500rpm的转速离心5～10分钟，弃去上清中未结合的生物素抗体，将样本细胞重悬在偶联缓冲液中；
(4)细胞分选
(4.1)目的细胞和亲和素/链亲和素磁性复合微粒的结合
将步骤(3)得到的结合有生物素抗体的待分选的样本细胞与经步骤(2)封闭处理后的亲和素/链亲和素磁性复合微粒混合，在20℃-35℃下孵育10-60分钟，间隔5-10分钟轻轻晃动反应管，使生物素与亲和素或者链亲和素充分的结合而将要分离的目的细胞固定在亲和素/链亲和素磁性复合微粒的表面；
(4.2)清洗
将步骤(4.1)的反应产物磁性分离，弃上清，加入清洗缓冲液，磁性分离，弃上清，洗去未结合的细胞。

2.  根据权利要求1所述亲和素/链亲和素磁性复合微粒用于细胞分选的方法，其特征在于：所述步骤(1)平衡盐溶液是pH＝7.0-7.6，0.02-0.2M的三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液、pH＝7.0-7.6，0.02-0.2M的磷酸缓冲液、N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸盐溶液，或者是加入了0.1-1.0MNaCl的上述溶液。

3.  根据权利要求1所述亲和素/链亲和素磁性复合微粒用于细胞分选的方法，其特征在于：所述步骤(2)封闭剂是浓度为1-10％的脱脂奶粉、1-5％的BSA或0.2-2.0％明胶。

4.  根据权利要求1所述亲和素/链亲和素磁性复合微粒用于细胞分选的方法，其特征在于：所述步骤(3)偶联缓冲液是：pH＝7.0-9.0，5mM-1M的三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液、pH＝5.0-8，0.02-0.2M的磷酸缓冲液、pH＝9.0-11.0，5mM-1M的碳酸盐缓冲液、pH＝3.6-5.6，5mM-1M的醋酸盐缓冲液、pH＝3.0-7.0，5mM-1M的柠檬酸缓冲液或pH＝7.0-9.0，5mM-1M的TE缓冲液。

5.  根据权利要求1所述亲和素/链亲和素磁性复合微粒用于细胞分选的方法，其特征在于：所述步骤(4.2)清洗缓冲液是pH＝7.0-9.0，5Mm-1M的三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液、pH＝5.0-8，0.02-0.2M的磷酸缓冲液、pH＝9.0-11.0，5mM-1M的碳酸盐缓冲液、pH＝3.6-5.6，5mM-1M的醋酸盐缓冲液、pH＝3.0-7.0，5mM-1M的柠檬酸缓冲液或pH＝7.0-9.0，5mM-1M的TE缓冲液或者是含有0.02-0.2％吐温的上述缓冲液。

6.  根据权利要求1所述亲和素/链亲和素磁性复合微粒用于细胞分选的方法，其特征在于：所述步骤(1)亲和素/链亲和素磁性复合微粒预处理三次。

7.  根据权利要求1所述亲和素/链亲和素磁性复合微粒用于细胞分选的方法，其特征在于：所述样本细胞是外周血，骨髓，脐带血和淋巴组织液中的细胞。

一种亲和素/链亲和素磁性复合微粒用于细胞分选的方法
技术领域
本发明涉及生物检测领域，尤其涉及一种利用亲和素/链亲和素磁性复合微粒用于对目的细胞分选的方法。
背景技术
随着生命科学的不断发展，细胞生物学和免疫学基础研究以及临床疾病的诊断都需要从含有不同细胞的混合样本中分离出纯化细胞，现有的细胞分离技术主要有：Ficoll密度梯度离心，离心洗涤，双水相分离，这些方法都是利用细胞大小，密度，表面电荷等物理性质的特征加以分离，其缺点是难以获得理想纯度及回收率，而流式细胞仪分选虽然能获得很高的纯度和回收率却需要昂贵的仪器，且操作过程复杂费时。而磁性复合微粒用于细胞分选是近些年来迅速发展起来的一项细胞分离的技术，就是将结合有抗体的磁性复合微粒在混合细胞体系中利用抗体与细胞表面标志物特异的结合，在外加磁场的作用下，将要分离的目的细胞分离。但是目前的磁性复合微粒用于细胞分选也存在一些问题譬如，磁性复合微粒存在对目的抗体外的蛋白的非特异性吸附，或者抗体结合量少等缺点，造成细胞分选中分选的目的细胞纯度和效率低。
发明内容
本发明的目的
为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种利用亲和素/链亲和素磁性复合微粒用于对目的细胞分选的方法，该方法简单迅速，不需昂贵的仪器，成本低，并且对所结合细胞毒性小，不易使之失活；分选出的目的细胞纯度高，并能够用于后续培养。
本发明的技术方案
本发明提供的一种亲和素/链亲和素磁性复合微粒用于细胞分选的方法，包括以下步骤：
(1)亲和素/链亲和素磁性复合微粒的预处理
将亲和素/链亲和素磁性复合微粒分散于平衡盐溶液中，磁性分离，弃上清；亲和素/链亲和素磁性复合微粒预处理三次为宜。
(2)封闭
向步骤(1)产物中加入封闭剂，反应20-120分钟，再用pH＝7.4，0.02M的磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液或醋酸盐缓冲液。
(3)生物素化抗体与细胞的抚育
取待分选的样本细胞，加入生物素抗体，室温反应10-60分钟，再以800rpm-1500rpm的转速离心5～10分钟，弃去上清中未结合的生物素抗体，将样本细胞重悬在偶联缓冲液中；
(4)细胞分选
(4.1)目标细胞和亲和素/链亲和素磁性复合微粒的结合
将步骤(3)得到的结合有生物素抗体的待分选的样本细胞与经步骤(2)封闭处理后的亲和素/链亲和素磁性复合微粒混合，在20℃-35℃下孵育10-60分钟，间隔5-10分钟轻轻晃动反应管，避免磁粒的沉淀，使生物素与亲和素或者链亲和素充分的结合而将要分离的目的细胞固定在亲和素/链亲和素磁性复合微粒的表面；
(4.2)清洗
将步骤(4.1)的反应产物磁性分离，弃上清，加入清洗缓冲液，磁性分离，弃上清，洗去未结合的细胞。
上述步骤(1)平衡盐溶液可选自pH＝7.0-7.6，0.02-0.2M的三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液、pH＝7.0-7.6，0.02-0.2M的磷酸缓冲液PBS、N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸盐溶液HEPES的一种，或者是加入了0.1-1.0M NaCl的上述溶液中的一种。
上述步骤(2)封闭剂可选自浓度为1-10％的脱脂奶粉、1-5％的BSA、0.2-2.0％明胶中的一种。
上述步骤(3)偶联缓冲液可选自pH＝7.0-9.0，5mM-1M的三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液Tris-HCl、pH＝5.0-8，0.02-0.2M的磷酸缓冲液PBS、pH＝9.0-11.0，5mM-1M的碳酸盐缓冲液CBS、pH＝3.6-5.6，5mM-1M的醋酸盐缓冲液、pH＝3.0-7.0，5mM-1M的柠檬酸缓冲液或pH＝7.0-9.0，5mM-1M的TE缓冲液中的一种。
上述步骤(4.2)清洗缓冲液可选自pH＝7.0-9.0，5mM-1M的三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液Tris-HCl、pH＝5.0-8，0.02-0.2M的磷酸缓冲液PBS、pH＝9.0-11.0，5mM-1M的碳酸盐缓冲液CBS、pH＝3.6-5.6，5mM-1M的醋酸盐缓冲液、pH＝3.0-7.0，5mM-1M的柠檬酸缓冲液或pH＝7.0-9.0，5mM-1M的TE缓冲液中的一种或者是含有0.02-0.2％吐温的上述缓冲液中的一种。
上述样本细胞可以是外周血，骨髓，脐带血和淋巴组织液中的细胞。
该方法的原理是：要从混合细胞样本中分离目的细胞，只要在实验体系中加入生物素标记的单抗，磁粒通过亲和素/链亲和素与生物素标记的单抗结合，单抗与细胞表面相应抗原特异结合从而使细胞被磁粒捕获，使用亲和素/链亲和素磁性复合微粒便可以实现对特定细胞的分离，达到纯化分离细胞的目的。由于生物素-亲和素，生物素-链亲和素具有系统特异性强、稳定性高、适用范围广、实验成本低的特点，所以得到的亲和素/链亲和素磁性复合微粒具有高生物素结合活性，在检测技术中标记量提高，且不易使生物分子变性失活，进一步提高了细胞分选的特异性。该方法操作简便迅速，不需要大规模仪器，且能获很高纯度和回收率。适用于分离外周血，骨髓，脐带血和淋巴组织液中的感兴趣的细胞，并将它们用于细胞，免疫学基础的研究和临床诊断与治疗。
本发明的优点
1、通过生物素与亲和素或链亲和素的特异结合可以减少非特异的吸附问题，能够高纯度的分选得到目的细胞，对所结合的细胞毒性小，不影响细胞活力，能够用于后续培养。
2、结合磁粒的细胞可直接进行流式检测，或在目的细胞培养的条件下培养使细胞磁珠分离，给后续的检测分析及其培养提供方便。
3、不需要昂贵的仪器，且操作过程简单省时。
附图说明
图1是亲和素/链亲和素磁性复合微粒用于外周血淋巴单个核细胞的阳性分选与阴性分选经流式细胞仪分析后的结果柱状图，其中图A是经过亲和素/链亲和素磁性复合微粒分选前的混合细胞的相对细胞数量与光密度的的柱状图，图B是经过经过亲和素/链亲和素磁性复合微粒分选后的相对细胞数量与光密度的柱状图。图C是分选后的上清液中相对细胞数量与光密度的柱状图。
具体实施方式
以下用具体实施例来对本发明作进一步说明，并不是对本发明的保护范围作限定。
实施例：利用亲和素/链亲和素磁性复合微粒用于外周血淋巴单个核细胞(PBMC)中的阳性分选(目的细胞是CD3)。
待分选的样本细胞是：使用淋巴细胞分离液从抗凝血中提取外周血单个核细胞(PBMC)，或者从淋巴组织中制备单细胞悬液。PBMC用加一定量的PBS(5％热灭活胎牛血清，pH＝7.4，0.09％NaN₃)摇匀，5000转5min，重复上述操作洗3次，50um尼龙网过滤去除细胞团块和碎片，调整细胞数为1×10⁷。
(1)亲和素/链亲和素磁性复合微粒的预处理
将亲和素/链亲和素磁性复合微粒分散于平衡盐溶液中，平衡盐溶液是：pH＝7.0，1M的三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液(Tris-HCl)、磁性分离，弃上清；
(2)封闭
加入1％的脱脂奶粉，反应60min，再用PH＝7.4，浓度为0.02M的磷酸盐缓冲液清洗3次；
(3)生物素化CD3+抗体与细胞的抚育
取上述待分选的样本细胞中的外周血单个核细胞(1×10⁷PBMC)，加入适量生物素化CD3+抗体，(1×10⁷PBMC中加入1ug抗体)，室温反应30min，再以1000rpm离心5min，弃去上清中未结合的生物素抗体，加入1ml pH＝7.4，0.02M的磷酸缓冲液(PBS)重悬细胞，1000rpm离心5min，弃上清，清洗2次；
(4)细胞分选
(4.1)目的细胞和亲和素/链亲和素磁性复合微粒的结合
将步骤(3)得到的结合有生物素抗体的待分选的样本细胞与经步骤(2)封闭处理后的亲和素/链亲和素磁性复合微粒混合，在25℃下孵育30min，间隔5min轻轻晃动反应管，避免磁粒的沉淀，使生物素与亲和素或者链亲和素充分的结合而将目的细胞固定在亲和素/链亲和素磁性复合微粒的表面；
(4.2)清洗
将步骤(4.1)的反应产物磁性分离5min，收集未被亲和素/链亲和素磁性复合微粒结合的细胞悬液至另一干净的反应管中，加入1ml pH＝7.4，0.02M的磷酸缓冲液(PBS)重悬细胞，用移液器反复吹打磁粒。
结合在磁粒上的细胞即为分选出的目的细胞，即表面表达CD3+的细胞。
为了提高产率，可以将步骤(4.2)收集的未被亲和素/链亲和素磁性复合微粒结合的细胞悬液，加入1ml pH＝7.4磷酸缓冲液(PBS)重悬细胞，用移液器反复吹打磁粒后再重复步骤(4.1)，合并两次收集的细胞悬液，可直接上流式细胞检测。用亲和素/链亲和素磁性复合微粒对淋巴细胞中表达CD3的细胞分选前后用流式细胞仪的测定的结果如图1所示，其中图A是经过亲和素/链亲和素磁性复合微粒分选前的混合细胞的相对细胞数量与光密度的的柱状图，图B是经过经过亲和素/链亲和素磁性复合微粒分选后的相对细胞数量与光密度的柱状图。图C是分选后的上清液中相对细胞数量与光密度的柱状图。从中可以看出亲和素/链亲和素磁性复合微粒对CD3的细胞分选是非常明显的可以到达97.5％。该方法中不需要大规模的仪器，成本低且操作简便快捷。