疏螺旋体属抗原
本发明涉及编码蛋白质的分离的核酸分子，编码超免疫血清反应性抗原的分离的核酸分子，包含此类核酸分子的载体，包含此类载体的宿主细胞，来自疏螺旋体属(Borrelia)物种的超免疫反应性抗原，优选为超免疫血清反应性抗原的蛋白质，超免疫血清反应性抗原，抗原，用于产生此类蛋白质、超免疫血清反应性抗原或抗原的方法、用于产生表达此类蛋白质、超免疫血清反应性抗原或抗原的细胞的方法，结合此类蛋白质、超免疫血清反应性抗原或抗原的抗体，产生此类抗体的杂交瘤细胞，用于产生此类抗体的方法，包含此类核酸分子、蛋白质、超免疫血清反应性抗原、抗原或抗体的药物组合物，此类核酸分子、蛋白质、超免疫血清反应性抗原、抗原或抗体用于制备药物的用途，用于鉴定能够减少或抑制此类蛋白质、超免疫血清反应性抗原或抗原的相互作用活性的拮抗剂的方法，用于诊断感染的方法和用于治疗感染的方法。更特别地此类蛋白质、超免疫血清反应性抗原或抗原通过引起莱姆病的细菌性病原体产生或与其或由广义布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi s.1)引起的细菌性感染相关。
莱姆疏螺旋体病(Lyme borreliosis)或莱姆病是欧洲和北美最常报导的蜱传播的疾病。所述疾病由节肢动物传播的螺旋体属广义布氏螺旋体(B.burgdorferi s.1.)引起的且为可牵涉多个器官或组织，从而导致皮肤、心脏(cardiac)、神经学和肌骨骼病症的多系统感染。广义布氏螺旋体可分成12个基因型群(genospecies)。这12个基因型群发生在不同的地理区域，其在自然界中以涉及蓖子硬蜱复组(Ixodes ricinus complex)(也称为全沟硬蜱复组(Ixodespersulcatus complex))的蜱和广泛的动物宿主(表A))的地方性动物病周期(enzootic cycle)生活。这12个基因型群中至少3个对于人是致病性的：狭义布氏疏螺旋体(B.burgdorferi s.s.)、阿氏疏螺旋体(B.afzelii)和嘎氏疏螺旋体(B.garinii)。两个其他基因型群路西塔尼亚螺旋体(B.lusitaniae)和B.valaisiana偶尔在人中被检测到，它们在莱姆疏螺旋体病中的作用仍未明确。
三个病原性物种 主要的媒介蜱(Principal 位置
tick vector)
狭义布氏疏螺旋体 肩板硬蜱 美国的东北部和北部中
太平洋硬蜱 心
蓖子硬蜱 美国西部
欧洲
嘎氏疏螺旋体 蓖子硬蜱 欧洲
全沟硬蜱 亚洲
阿氏疏螺旋体 蓖子硬蜱 欧洲
太平洋硬蜱 亚洲
9个最小的病原性或非 主要的媒介蜱 位置
病原性物种
Borrelia andersonii Ixodes dentatus 美国东部
Borrelia bissettii Ixodes spinipalpis 美国西部
太平洋硬蜱
Borrelia valaisiana 蓖子硬蜱 欧洲和亚洲
Borrelia lusitaniae 蓖子硬蜱 欧洲
Borrelia spielmani 蓖子硬蜱 欧洲
Borrelia japonica 卵形硬蜱 日本
Borrelia tanukii Ixodes tanukii 日本
Borrelia turdae Ixodes turdus 日本
Borrelia sinica 全沟硬蜱 中国
表A：广义布氏疏螺旋体基因型群、它们的媒介蜱和地理位置。
莱姆疏螺旋体病在1976被描述为新型临床实体。Allen C.Steere在Old Lyme，Connecticut调查了一组患有皮诊和肿胀关节(swollenjoint)的人，并且把莱姆疏螺旋体病误诊为青少年类风湿性关节炎(Steere等人，1977)。然而，在欧洲，自1880年代以来，所述疾病已在各种名称下得到了解。在1883年，Buchwald描述了称为慢性萎缩性肢皮炎(ACA)的慢性皮肤变化。在1910，瑞典医师Afzelius发现了昆虫或蜱叮咬后产生的称为游走性红斑(EM)的环形移动的红诊(circularly moving red rash)。法国研究者Garin和Bujadoux于1922年描述了蜱叮咬后产生的神经学症状。在1951年，瑞典临床医师![]()
成功地用青霉素治疗患有EM的患者，在1984年，在采自EM伤口的皮肤活组织检查中观察到疏螺旋体细胞。这暗示着，与脑膜炎相关的EM可能是蜱传播或昆虫传播的细菌引起的感染的结果。莱姆疏螺旋体病的致病因子最终于1982年由W.Burgdorfer和同事发现，他们从硬蜱肩板硬蜱(ixodes scapularis)分离出后来命名为布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)的之前未鉴定的螺旋体细菌(Burgdorfer等人.，1982)。
莱姆疏螺旋体病的流行病学
莱姆疏螺旋体病是欧洲和北美最常见的蜱传播的人兽共患病。然而在大多数国家，其不是法定传染病，没有每年发生的新病例的数目的确切数据。在美国，致病因子是广义布氏疏螺旋体，莱姆疏螺旋体病局限在东北、中大西洋和中北部以北的州。在2002年，向CDC报告了总共23,763例莱姆疏螺旋体病，产生了每100,000个居民8.2例的全国发病率(Lyme Disease Surveillance in Morbidity MortalityWeekly Reports，2004)。在欧洲，阿氏疏螺旋体和嘎氏疏螺旋体与促成对地理位置更低程度依赖性的广义布氏疏螺旋体一起是在欧洲莱姆疏螺旋体病的主要致病因子。在欧洲，莱姆疏螺旋体病的发病率在国家之间是有差异的。在东德，莱姆疏螺旋体病的平均发病分别是2002的每100,000人群中17.8个病例和2003年增加31％至23.3个病例。在奥地利，莱姆疏螺旋体病的发病率要高得多，每100,000个居民中130个病例(Report of WHO workshop on Lyme borreliosis andDiagnosis and surveillance，Warsaw，Poland，20-22 June，1995)。
在一些危险群体例如农民、林业工人、徒步旅行者、跑步者或度假者中，血清阳性率和疾病发病率在如15岁以下的儿童和39至59岁之间的成人中增加，无性别偏向性。莱姆疏螺旋体病的流行率在不同的欧洲国家中变化相当大，总体地从西向东增加。莱姆病的高发病率与森林栖息地和社会因素的变化相关联。环境变化例如森林的片断化已导致啮齿目动物捕食者例如狼和食肉鸟(birds of prey)的减损，由此这又导致小鼠群体的增加和自动地增加蜱群体。更近以来，斑片状的人工造林已增加了鹿的数目，从而增加了蜱的数目。中产阶级的郊外躺卧(suburban sprawl)和用于娱乐(例如野营和徙步旅行)的此类森林区域的使用的增加使人更多地接触更大量的被感染的蜱。所有这些参数促成了莱姆疏螺旋体病的更广泛分布。
莱姆疏螺旋体病的病原
广义布氏螺旋体属于螺旋体科，其被再分为医学上重要的属：密螺旋体属(Treponema)、钩端螺旋体属(Leptospira)和疏螺旋体属(Borrelia.)。广义布氏螺旋体是螺旋形的(10-20μm长和0.2-0.5μm宽)、剧烈运动的在微需氧条件下生长的革兰阴性细菌。螺旋体细胞壁由细胞质膜组成，而细胞质膜被肽聚糖和鞭毛包围，然后由松散结合的外膜包围。疏螺旋体基因组在细菌中可能是结构最复杂的，其由一个线性染色体和不同数目的线性和环形质粒组成(Xu等人，1995)。
1997年，通过TIGR对广义布氏疏螺旋体株系B31的基因组进行完全测序(Fraser等人，1997)，下列分析显示1.5Mb的基因组序列编码在单个染色体以及12个线性和9个环状质粒的高度动态的补充物中(Casjens等人，2000)。2004年公布了嘎氏疏螺旋体株系PBi的基因组序列(![]()
等人，2004)。他们只能完全组装两个质粒，剩下其余的质粒序列作为可变的质粒序列，这表明了重复序列的复杂性和高含量。在来自广义布氏疏螺旋体株系B31和嘎氏疏螺旋体株系PBi的基因组间存在92％的核苷酸序列同一性，质粒的序列差异更大。
大约90％的染色体基因组包含编码区，大部分编码的基因与已知功能的基因同源。它们编码参与DNA复制、转录和翻译；修复系统和重组；运输、营养物吸收和能量代谢；运动性和趋化性以及基因表达的调控的蛋白质。与病原性相关的基因主要位于染色体外的基因组上。编码用于氨基酸、脂肪酸、协同因子和核苷酸的合成的基因不存在于疏螺旋体基因组中。因此疏螺旋体需要补充有血清的复合培养基(例如BSK-II培养基)以在体外生长。
莱姆疏螺旋体病的临床表现
莱姆疏螺旋体病通常分期发生，在各期具有不同临床表现的减轻和恶化(Steere，1989)。早期感染1期由皮肤的局部感染组成，然后在数天或数周类发展为2期，播散感染，数月或数年后发展为3期，持续感染。然而，感染是可变的；一些患者只具有皮肤的局部感染，而其他患者只展现疾病的更晚期的表现，例如关节炎。莱姆疏螺旋体病的不同临床综合征还可由不同广义布氏螺旋体种的感染引起。狭义布氏疏螺旋体更常引起关节表现(关节炎)和心脏问题，阿氏疏螺旋体主要引起皮肤症状(EM和ACA)，嘎氏疏螺旋体是产生神经型疏螺旋体症(neuroborreliosis)的主要因素。
局部感染-感染的1期的最常见症状是发生在70-80％的被感染的人中的游走性红斑。该皮肤病损通常伴随流行性感冒样症状，例如肌痛、关节痛、头痛和发烧。这些非特异性症状发生在50％的患有游走性红斑的患者中。
播散感染-在2期中，细菌从感染的部位迁移入血流中和迁移至更远的组织和器官。发生在该期的神经学、心血管和关节炎症状包括脑膜炎、颅神经病(cranial neuropathy)和间歇性炎性关节炎。
持续感染-感染的3期是慢性的，在蜱叮咬后数月至数年发生。北美最常见的病症是由广义布氏疏螺旋体的感染引起的类风湿性关节炎。嘎氏疏螺旋体对中枢神经系统的持续感染在3期引起更严重的神经学症状，阿氏疏螺旋体对皮肤的持续感染导致慢性萎缩性肢皮炎。
诊断和治疗
早期莱姆疏螺旋体病的诊断的最佳参数是特征性的扩展红色皮肤病损或EM。不幸的是，30％的患者不发生该皮诊，并且早期疾病的常见症状例如疲劳、发烧或头痛是很非异性的以至不能被诊断。可使用多种血清学试验诊断具有症候的患者的莱姆疏螺旋体病，最常用的诊断试验是针对血清中的Lyme特异性抗体的间接ELISA试验。
抗微生物剂是治疗莱姆疏螺旋体病感染的基本方法。所使用的抗生素取决于疾病的阶段、症状和患者对药物治疗的变态反应(allergy)。抗生素疗程的长度还取决于疾病的分期和症状的严重度。早期莱姆疏螺旋体病通常使用口服四环素类例如多西霉素(doxycycline)和半合成的青霉素例如阿莫西林或青霉素V来进行治疗。关节炎和神经学病症使用高剂量的静脉注射的青霉素G或头孢三嗪来治疗。
预防
作为改变的生态条件的结果，莱姆疏螺旋体病的病例的数目稳定地增加。此外，预防的困难表明发病率将继续成为公共卫生忧虑。景观改造、防护服、蜱检验或个人防护措施是有帮助的但还不够，因此需要抗莱姆疏螺旋体病的疫苗。
疫苗可包含整个种类的不同抗原。抗原的实例是完全杀死的或减毒的生物体、这些生物体/组织的亚级分(subfraction)、蛋白质或以它们的最简单形式存在的肽。抗原还可以以糖基化的蛋白质或肽的形式被免疫系统识别，还可以是或包含多糖或脂质。还可使用短肽，因为例如细胞毒性T细胞(CTL)识别以与主要组织相容性复合物(MHC)结合的、短的通常8至11个氨基酸长度的肽的形式的抗原。B细胞可识别短的4-5个氨基酸的线性表位以及三维结构(构象表位)。为了获得持续的、抗原特异性免疫反应，需要佐剂以触发牵涉免疫系统的所有细胞的免疫级联反应。首先，佐剂对所谓的抗原递呈细胞(APC)起作用，但不受限于它们的作用模式。此类细胞通常首先遇到抗原，然后将经加工的或未修饰的抗原呈递至免疫效应细胞。还可涉及小细胞癌中间细胞型。只有具有合适的特异性的效应细胞在有效的免疫反应(productive immune response)中被激活。佐剂还可局部保留抗原和共注射的其他因子。此外，佐剂可用作其他免疫细胞的趋化因子或可局部和/或全身性地用作免疫系统的刺激剂。
存在对开发用于人的灭活的完整细胞疫苗的忧虑，因为其可诱导针对人抗原的交叉反应抗体的潜在危险。因此，认为亚单位疫苗在预防莱姆疏螺旋体病中具有最大的潜力。
最近，开发预防莱姆疏螺旋体病的亚单位疫苗主要集中在外表面蛋白A(OspA)上。来自狭义布氏疏螺旋体株系ZS7的OspA的脂质化形式与氢氧化铝一起由GlaxoSmithKline(GSK)商业开发为LYMErixTM以用于美国市场。OspA主要在蜱的消化道中表达，对疏螺旋体属的人免疫反应通常不包括针对OspA的体液或细胞适应性免疫。因此通过接种产生的此类OspA抗体不用于抗击体内的感染。相反，当蜱采食血液时，所述抗体进入其肠。在那里，它们中和螺旋体和阻断从中肠至允许广义布氏螺旋体进入脊椎动物宿主的唾液腺的迁移。因此，所述疫苗阻止螺旋体从蜱至人宿主的传播。在一年的时间内需要3剂LYMErixTM来获得最佳的保护作用，在前两剂后，抗莱姆疏螺旋体病的疫苗功效为49％，在第三剂后为76％。然而，在LYMErixTM可商购获得后很短的时间内，其在2002年退出市场。其中的一些原因是需要每年或每隔一年的加强注射，与早期感染的抗生素治疗相比该预防方法的成本相对较高。此外，存在理论和从未证明的担心，即LYMErixTM可在人群的亚群中引起自身免疫反应。
本发明的问题是提供用于开发药物例如抗引起莱姆疏螺旋体病的细菌病原体的疫苗的方法。更具体地，所述问题是提供有效的、相关的和全面的一组来自广义布氏螺旋体的可用于制备所述药物的核酸分子、蛋白质、超免疫反应抗原或抗原。另外的问题是提供用于产生蛋白质、超免疫反应抗原或抗原、或其片段的方法，用于鉴定能够减少或抑制此类蛋白质、超免疫反应抗原或抗原与其相互作用伴侣和优选与其针对其的抗体的相互作用活性的拮抗剂的方法，用于治疗感染的方法，用于免疫动物或人的方法。
本发明的问题在第一方面中通过编码蛋白质、优选超免疫血清反应性抗原或抗原、或其片段的分离的核酸分子来解决，所述核酸分子包括选自下列的核酸分子的核酸序列：
a)与具有选自Seq ID No 1-134的核苷酸序列的核酸分子具有至少70％的序列同一性的核酸分子，
b)与a)的核酸分子互补的核酸分子，
c)包含a)或b)的核酸分子的至少15个连续碱基的核酸分子，
d)在严格杂交条件下与a)、b)、或c)的核酸分子退火的核酸分子，
e)若非遗传密码的简并性的原因，则与a)、b)、c)或d)中定义的核酸分子杂交的核酸分子。
本发明的问题在第二方面中通过编码优选超免疫血清反应性抗原或抗原、或其片段的分离的核酸分子来解决，所述核酸分子包括选自下列的核酸分子的核酸序列：
a)与具有选自Seq ID No 269-387和507-628的核苷酸序列的核酸分子具有至少70％的序列同一性的核酸分子，
b)与a)的核酸分子互补的核酸分子，
c)包含a)或b)的核酸分子的至少15个连续碱基的核酸分子，
d)在严格杂交条件下与a)、b)、或c)的核酸分子退火的核酸分子，
e)若非遗传密码的简并性的原因，则与a)、b)、c)或d)中定义的核酸分子杂交的核酸分子。
在第一和第二方面的实施方案中，序列同一性至少是70％、至少85％、至少90％、至少95％或100％。
在第一和第二方面的实施方案中，核酸是DNA。
在第一和第二方面的备选实施方案中，核酸是RNA。
在第一和第二方面的实施方案中，从基因组DNA，优选来自选自狭义布氏疏螺旋体、嘎氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体、Borreliaandersonii、Borrelia bissettii、Borrelia valaisiana、Borrelialusitaniae、Borrelia spielmani、Borrelia japonica、Borreliatanukii、Borrelia turdae和Borrelia sinica的物种，和更优选来自狭义布氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体或嘎氏疏螺旋体基因组DNA分离核酸分子。
在第一和第二方面的实施方案中，片段是功能性或活性片段或其活性变体。
在第一和第二方面的实施方案中，蛋白质或超免疫血清反应性抗原、或其片段由来自狭义布氏疏螺旋体、嘎氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体、Borrelia andersonii、Borrelia bissettii、Borreliavalaisiana、Borrelia lusitaniae、Borrelia spielmani、Borreliajaponica、Borrelia tanukii、Borrelia turdae或Borrelia sinica，优选来自狭义布氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体或嘎氏疏螺旋体的抗原组成。
本发明的问题在第三方面中通过包含根据第一或第二方面的核酸分子的载体来解决。
在第三方面的实施方案中，载体适合用于蛋白质，优选由第一或第二方面中定义的核酸分子编码的蛋白质或超免疫血清反应性抗原、或其片段的重组表达。
本发明的问题在第四方面中通过包含第三方面中定义的载体的宿主细胞来解决。
本发明的问题在第五方面中通过来自狭义布氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体或嘎氏疏螺旋体的超免疫血清反应性抗原来解决，所述抗原与来自具有由广义布氏疏螺旋体属感染、阿氏疏螺旋体属感染或嘎氏疏螺旋体引起的感染的人或未感染的健康人的血清发生免疫反应，其中超免疫血清反应性抗原包含分离的来自狭义布氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体或嘎氏疏螺旋体的肽或其肽片段。
本发明的问题在第六方面中通过蛋白质、优选具有选自Seq IDNo 135-268的氨基酸序列的超免疫血清反应性抗原，或其活性片段或活性变体来解决。
本发明的问题在第七方面中通过具有选自Seq ID No 388-506和629-750的氨基酸序列的超免疫血清反应性抗原，或其活性片段或活性变体来解决。
在第六方面的实施方案中，蛋白质由第一方面中定义的核酸分子编码。
在第七方面的实施方案中，抗原由第二方面中定义的核酸分子编码。
在第六和第七方面的实施方案中，蛋白质或抗原是来自狭义布氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体或嘎氏疏螺旋体的抗原或由来自狭义布氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体或嘎氏疏螺旋体的抗原组成。
在第六和第七方面的实施方案中，活性片段由如第六和第七方面中定义的蛋白质或超免疫血清反应性抗原或抗原和更具体地Seq IDNo 135-268、388-506或629-750的任一个的蛋白质或超免疫血清反应性抗原的至少60％、优选至少70％、更优选至少80％、更优选至少90％、更优选至少95％、最优选99％组成。
在第六和第七方面的实施方案中，活性变体具有与或抗原血清反应性抗原或蛋白质至少50％的序列同一性，特别地与第六和第七方面中定义的所述超免疫血表反应性抗原或蛋白质和更具体地Seq IDNo 135-268、388-506或629-750的任一个的蛋白质或超免疫血清反应性抗原或抗原至少60％、优选至少70％、更优选至少80％、更优选至少90％、更优选至少95％、最优选99％的序列同一性。
本发明的问题在第八方面中通过抗原来解决，其中所述抗原包含表1的栏“预测的免疫原性aa”和“鉴定的免疫原性区域的定位”中显示的、表5的栏“aa(起始-终止)”中显示的、由表6的栏“从aa”和“至aa”显示的、或由表8的栏“氨基酸从-至”定义的核心氨基酸序列，其中更优选此类抗原包含如下核心氨基酸序列：
Seq ID No 135的氨基酸6-20，25-51，58-83，94-105，111-122，127-135，141-155，162-173，179-186，188-207，213-226，230-248，253-265，269-282，285-291，367-378，384-393，401-425，453-464，471-477，504-514，519-527，532-555，557-572，584-598，609-616，624-630，638-645，648-653，128-169，257-336，339-379和91-415；Seq ID No 136的氨基酸23-31，47-53，57-64，74-89，91-106，127-132，137-144，152-157，164-169，186-192，201-206，208-217，223-235和180-189；Seq ID No 137的氨基酸4-32，43-52，54-66，78-88，91-122，124-131，144-150，153-159，161-178，183-191，195-201，205-215，236-252，258-263，276-284，288-294，302-312和159-213；Seq ID No 138的氨基酸8-23，30-35，44-54，65-73，77-83，89-110，117-129，132-137，156-165，169-175，189-199，225-237和229-267；Seq ID No 139的氨基酸5-31，40-50，52-58，64-72，112-118，137-142，170-175，179-185，192-201，299-305和138-187；Seq ID No 140的氨基酸11-18，23-47，113-119，131-137，143-149，197-203，215-222，247-256，264-290，298-303，311-358，368-401，403-409和97-177；Seq ID No 141的氨基酸5-20，27-32，34-40，43-64，66-72，78-85，91-97，104-110，118-141和94-119；Seq ID No 142的氨基酸5-22，25-32，39-45，51-58，60-104，106-114，129-155，160-166，174-182，195-204，207-213，223-239，243-250，257-267，270-276，279-285，293-302，304-317，328-335，360-372，374-382，386-397，404-418，429-438，441-447，450-460，467-472，480-497，501-507，515-521，562-572和195-228；Seq ID No 143的氨基酸4-10，31-42，44-59，65-72，75-115，119-127，146-155，181-188，198-207，213-219，228-244，254-264，269-293，295-310，313-321，323-336，350-369，380-389和165-214；Seq ID No 144的氨基酸11-25，27-45，66-73，75-85，104-113，126-135，143-154，160-166，178-185，201-215，231-245，254-261，266-296，298-306，308-332，339-344，360-370，385-391，412-419，449-457，461-469，472-478，495-505，511-518和350-451；Seq ID No 145的氨基酸14-35，64-72，81-87，90-99，110-116，137-152，158-166，171-178，207-216，225-232，239-250，264-271，276-286，316-323，325-343，350-356，393-407，416-422，440-445，448-453，469-475，497-506，509-529，537-543，586-592，603-610，41-107和528-596；Seq IDNo 146的氨基酸56-62，83-96，161-167，170-179，184-197，205-214，235-243，285-296，302-308，324-333和18-315；Seq ID No 147的氨基酸4-11，35-41，57-65，82-88，99-115，118-124，126-134，146-151，159-167，174-180，187-192，195-206，216-222，237-247，261-269，295-304，327-334，341-347，363-374，382-388，398-404，410-424，430-436，441-448，451-461，473-484，493-507，509-522，528-536，544-550，566-573，588-604，608-614，22-75，110-148和344-404；Seq ID No 148的氨基酸4-14，21-28，32-38，59-71，84-106，110-120，127-140，146-167，184-190，197-203，223-232，249-278，280-292，309-324，342-355，367-374，377-384和264-328；Seq ID No 149的氨基酸13-18，47-55，65-75，132-138，140-146，149-155，157-168，218-227，241-248，275-281，283-289，306-315，329-336，352-360，372-378，388-394，396-404，411-416，424-429，445-455，479-491，494-500，571-578，583-588，600-621，6-65，68-112，261-352和449-507；Seq ID No 150的氨基酸10-34，36-42，46-55，58-64，79-86，99-122，125-135，165-184，200-209，215-226，232-238和79-89；Seq ID No 151的氨基酸4-34，38-62，64-78，87-99，101-109，113-125，128-156，166-184，186-193，196-203，205-215，220-226，236-260，262-269，271-288，296-302，325-333，339-350和111-138；Seq ID No 152的氨基酸8-23，25-33，57-68，102-113，194-199，236-241，269-296，326-333，339-348，352-360，364-369，378-393，422-430，434-447，476-484，488-501，530-538，542-555，585-592，596-609，638-646，650-663，692-699，706-716，726-745，765-771，792-798，809-815，825-835，862-868，878-885，893-902，911-922，927-937，947-953，962-970，978-985，1011-1017，1027-1034，1045-1052，102-177，285-364，937-983，27-246和701-1067；Seq ID No 153的氨基酸4-20，36-45，62-69，73-83，95-112，153-166，178-185，194-205，215-223，238-247和80-159；Seq ID No 154的氨基酸82-95，107-122，153-158，165-171，178-196，202-210，216-222，270-280，312-318，336-341，381-389和245-299；Seq ID No 155的氨基酸4-23，45-57，68-81，91-104，118-131，134-144，160-166，172-189，191-202，204-217，228-236，261-268，273-285，287-294，307-316，328-343，350-356，381-418，420-429，440-452，458-465，497-504，528-538，546-556，567-574，580-601，605-624，628-639，647-653和126-200；Seq ID No 156的氨基酸4-19，24-30，32-48，53-80，89-97，102-109，136-142，145-153，156-164，177-187，192-209，215-221，238-243，15-146和21-257；Seq ID No 157的氨基酸5-13，70-79，91-97，123-129，155-162，173-189，199-224，232-238，255-261，265-283，290-301，306-311，314-320，336-344，351-358，395-409，412-418，430-439，35-109和187-298；Seq ID No 158的氨基酸13-31，36-47，80-96，98-107，144-149，187-193，215-220，235-251，291-300，306-326，328-338，340-358，364-380，408-426，434-441和220-288；Seq IDNo 159的氨基酸4-24，36-43，70-81，89-100，109-120，127-132，141-158，165-178，183-191，193-202，208-215和31-89；Seq ID No160的氨基酸6-25，44-49，95-105，136-144，199-215，236-241，256-262，280-287，306-320，326-334，346-354，364-376，83-172和272-327；Seq ID No 161的氨基酸4-21，27-44，85-92，100-107，112-118，142-149，161-190，216-222，231-238，258-310，317-323，334-344，352-359，367-373，380-387，394-400，429-441，485-500，20-79和404-526；Seq ID No 162的氨基酸12-28，38-58，61-75，98-116，121-127，133-142，169-199，213-221，236-241，243-250，254-260，269-281，284-301，313-319，352-358，362-368，391-397，436-448，455-463，485-496，498-511，523-533，40-97，251-297和420-488；Seq ID No 163的氨基酸8-15，24-41，50-79，86-91，109-141，143-156，166-171，204-212，235-243，245-267，291-311，328-336，344-360，377-388，390-396和258-336；Seq ID No 164的氨基酸4-15，22-38，46-53，72-82，99-119，131-139，148-154，179-184，187-195，203-209，212-219，223-231，242-249，257-263，269-277，282-288，310-315，346-353，371-377，388-395，400-421，427-438，445-451和458-472；Seq ID No 165的氨基酸5-29，37-117，128-134，138-144，146-161，172-178，193-219，221-231，234-240，242-261，263-274，297-302，306-322，339-345，356-365，371-383，402-413，416-424，432-443，447-456，461-466，471-524，532-593和197-284；Seq ID No 166的氨基酸5-29，54-69，72-88，99-112，128-138，150-165，167-174，181-187，205-226，246-253，273-279，285-291，293-311，313-323，329-334，338-350，356-363，366-372，388-394，397-404，417-423，437-445，453-473和378-461；Seq IDNo 167的氨基酸38-45，67-82，90-96，101-108，113-120，128-143，160-173，190-200，206-218，226-237，244-252，256-271，276-285，298-309，319-325，332-350，355-363，379-388，395-404，412-419，427-433，442-455，82-127和212-253；Seq ID No 168的氨基酸10-28，37-50，58-66，72-91，101-119，124-131，133-149，152-170，177-186，198-204，225-244，249-256，260-266，269-286，298-303，306-312，329-338，342-348和26-73；Seq ID No 169的氨基酸10-18，45-51，58-87，95-139，175-182，184-194，228-237，239-245，255-261，269-282，289-295，301-308，310-319，333-374，376-383，394-447，455-464，485-503，519-526，532-542，551-557，571-604，608-614，616-623，654-660，682-687，717-724，729-736，759-775，800-806，817-823，829-838，840-864，877-887，900-906，943-951，959-978，981-994，996-1012，1016-1032，1035-1046，1049-1056，1078-1109，1117-1124，1137-1143，1158-1167，1179-1199，1201-1207，1215-1245，1250-1256，1262-1268，1270-1281，1298-1310，1314-1323，1326-1333，1347-1357，1364-1372和1053-1082；Seq ID No 170的氨基酸4-9，15-27，29-37，50-59，65-73，94-107，138-168，179-187，191-203，230-237，254-260，267-274，279-294，312-328，355-361，368-375，378-388，405-415，441-457，459-467，469-476，496-506，508-514，521-531，538-549，554-561，566-574，582-591，604-625，640-653，657-671，674-689，698-705，713-723，746-756，763-771，777-789，801-809，822-839，847-854，865-872，877-883，889-906，922-940，943-953，963-984，1004-1010，1021-1037，1045-1057，1070-1089，1096-1115，1117-1123，1127-1135和194-292；Seq ID No 171的氨基酸10-30，38-51，74-81，86-96，116-148，161-167，202-208，211-217，239-261，283-295，298-310，322-328，335-346和44-99；Seq ID No172的氨基酸9-23，31-42，50-60，68-74，85-92，98-106，108-117，135-142，144-150，155-172，174-191，193-206，208-215，223-233，237-245，252-267，274-296，308-316，324-341，375-385，394-402，419-440，446-452，493-499，514-520，537-546，570-579，582-588，591-603，609-618，620-628，640-687，700-706，714-742，765-774，794-805，809-825，827-838，847-857，860-867，875-888，897-907，917-926，937-942，950-971，975-981，989-999，1016-1052，1054-1071，1089-1105，1108-1130，1142-1160，1166-1178，1184-1197，1199-1207，1216-1222，1232-1247，1249-1254，1262-1283，1291-1300，1308-1332，1343-1356，1363-1368，1384-1398，1401-1410，1423-1434，1443-1464，1478-1484和1229-1275；Seq ID No 173的氨基酸5-15，21-35，42-51，55-60，73-80，87-94，103-110，134-146，157-168，174-188，190-201，209-223，250-257，110-131和179-236；Seq ID No 174的氨基酸10-24，30-48，52-66，90-100，111-137，153-162，166-175，184-190，193-206，226-232，238-248，250-260，267-273，322-333，349-382，402-413，421-428，443-451，470-480，487-498，508-518，526-539，544-549，568-574，607-623，631-636和372-434；Seq ID No 175的氨基酸20-28，33-38，45-77，91-110，124-130，137-162，164-170，175-183，185-205，207-217，235-240，254-269，291-296，319-326，342-354，374-381，397-403，424-434，442-455，469-484，494-501，513-522，529-534，546-556，558-564和439-464；Seq ID No 176的氨基酸4-13，15-21，24-32，40-45，47-65，75-110，114-123，133-142，144-159，164-171，187-215和12-77；Seq ID No 177的氨基酸4-9，25-44，49-60，72-82，87-105，125-138，142-155，171-179，183-197，205-225，232-244，256-270，278-285，287-293，310-333，339-345，350-366，368-378，381-392，397-404，408-418和281-316；Seq ID No 178的氨基酸28-35，95-116，138-146，150-158，174-203和33-78；Seq ID No 179的氨基酸4-23，31-43，58-64，68-83，93-103，121-135，143-156，181-187，227-238，251-264，292-298，309-317，326-333，351-357，359-365，387-395，400-407，431-437，451-460，462-471，496-508，519-526，534-540，568-573，608-618，620-627，650-657，673-679，690-702，705-714，728-734，738-745，758-764，776-782，795-810，830-839，882-904，911-926，938-944，962-969，975-984，999-1007，1019-1025，1072-1090，1099-1111，1172-1178，1232-1241，1245-1252，1257-1266，1283-1288，1305-1311，1370-1377，1392-1398，1412-1417，1422-1434，1448-1458，1479-1487，1529-1534，1570-1576，1582-1590，1615-1622，1630-1645，1659-1668，1700-1708，1730-1736，1756-1762，1765-1776，1798-1803，1805-1819，1831-1837，1872-1882，1926-1936，1946-1952，1955-1961，1968-1980，1995-2002，2035-2045，2048-2056，2076-2083，2099-2107，2122-2128，2146-2156，718-788和399-870；Seq ID No 180的氨基酸12-19，22-29，37-43，48-56，79-90，114-119，136-147，162-172，174-180，186-194，200-213，232-238，275-282，288-297，303-319，329-338，341-351，363-371，383-397，416-423，430-438，454-472，476-483，536-542，576-581，626-632，66-161和494-576；Seq IDNo 181的氨基酸29-35，48-56，82-89，106-112，118-126，144-149，157-173，175-184和1-52；Seq ID No 182的氨基酸14-36，48-54，79-85，149-159，171-182，189-205，211-217和171-240；Seq ID No183的氨基酸9-23，30-40，56-70，75-80，97-103，111-117，130-135，139-145，149-160，250-256，276-286，309-315，326-331，364-376，385-391，400-412，429-434，446-462，472-498和363-430；Seq IDNo 184的氨基酸4-28，44-60，73-81，88-94，102-108，119-127，145-170，201-208，220-227，229-239，291-297，306-323，327-335，342-369，372-394，414-420，427-445，456-462，471-478，494-503，505-510，536-542，549-567，585-594，614-627和215-283；Seq IDNo 185的氨基酸4-10，27-33，40-48，64-70，82-96，108-115，123-131，171-176，182-204和151-160；Seq ID No 186的氨基酸4-15，19-36，39-47，51-57，62-69，77-84，91-97，103-112，117-136，148-168，189-195，204-211，213-228，234-243，268-274，280-289，294-308，314-335，341-349，354-375，382-392，394-405，419-424，430-435，442-469，479-489，500-507，510-516，523-534，536-545，560-579，586-592，614-620，639-649，652-663，665-702，704-710，727-732，743-755，761-781，799-805，810-816，842-851，885-891，904-912，924-931，933-946，948-973，980-988，990-1007，1017-1023，1027-1035，1046-1055，1063-1074，1086-1091，1095-1102，1116-1122，1149-1158和458-497；Seq ID No 187的氨基酸4-23，26-32，50-56，72-85，87-104，106-113，116-151，159-174，176-184，187-194，199-206，211-232，242-261，91-170和22-264；Seq ID No 188的氨基酸4-24，53-58，65-72，84-96，106-113，115-125，149-154，176-191，215-222，239-244，267-275，278-304，323-340，345-351，416-424，449-455，473-483，523-537，540-556，564-583，605-616，36-119和343-394；Seq ID No 189的氨基酸11-27，45-52，60-74，96-102，123-136，140-155，167-189，194-201，209-230，254-261，264-284，289-294，297-305，319-325，338-343，349-361，363-377，381-388，396-409，413-422，435-441，455-469和342-386；Seq ID No 190的氨基酸9-45，47-54，72-78，81-96，111-118，123-130，133-143，148-154，157-182，202-215，241-255，290-311，316-334，340-346，349-356，366-385，387-400，403-411和156-286；Seq ID No 191的氨基酸26-45，62-70，84-121，129-138，146-168，182-188，197-207，213-220，222-229，246-257，277-283，304-314，328-336，348-371，375-385，388-396，409-421，429-438，451-459，465-485，501-528，530-536，555-581，589-594，607-614，620-626，628-634，637-643，650-658，665-671，680-691，703-709，721-742，746-758，761-767，772-777，784-790，796-810和747-795；Seq ID No 192的氨基酸4-11，15-37，52-66，79-90，96-106，110-118，124-137，152-160，162-171，174-182，200-209，215-222，227-242，248-264，284-308，325-340，362-369，390-418，420-426，440-454，463-471，478-485，490-512，517-532，539-545，570-583，591-605，621-630，643-652，655-665，684-694，75-223和285-348；Seq ID No 193的氨基酸8-18，25-57，93-107，121-128，135-141，159-176，183-191，202-223，229-236，298-304，332-340，359-368，384-393，410-426，434-439，444-449，476-491，502-508，511-523，525-533，548-554和390-409；Seq ID No 194的氨基酸13-31，35-41，50-58，70-81，91-100，120-128，143-149，185-191，196-203，213-239，241-251，256-277，289-303，305-316，364-388，394-403，406-412，417-426，440-446，462-469，494-502，504-522和6-100；Seq ID No 195的氨基酸7-14，30-36，43-52，54-65，71-85，95-101，113-119，121-127，153-170，179-188，191-200，204-210，214-222，227-233，244-250和168-223；Seq ID No 196的氨基酸14-21，25-39，54-64，74-99，102-129，139-153，159-166，188-206，214-220，236-243，245-255，262-269，276-295，300-309，315-321，324-331和12-84；Seq ID No 197的氨基酸4-13，26-33，35-49，55-68，74-82，96-114，116-148，150-161，229-235，237-254，257-266，280-286，305-312，320-337，343-356，373-382，384-427，433-439和50-64；Seq ID No 198的氨基酸4-46，53-78，103-113，117-122，144-149，168-174，176-183，193-200，207-238，252-259，271-277，279-307，315-326，330-391，412-423，425-464，472-478，508-526，531-542，551-560，562-576，584-593，602-608，616-637，658-666，714-719，721-730，28-73，292-344，531-608和391-753；Seq ID No199的氨基酸4-21，26-33，69-78，80-93，109-125，127-134，137-146，154-160，162-169，173-182，189-199，210-220，224-242，246-278，284-290，294-308和223-272；Seq ID No 200的氨基酸10-30，33-42，46-62，64-70，82-97，112-122，124-130，138-145，148-165，167-178，186-192，196-209，213-218，241-249，258-276，279-288，291-299，302-307，315-337，344-349，360-376，390-402，409-415，417-428，452-468，475-484，486-492和180-232；Seq IDNo 201的氨基酸17-24，32-43，49-55，62-69，78-92，97-118，132-139，148-154，173-179，181-189，191-210和117-131；Seq IDNo 202的氨基酸4-18，35-44，54-67，77-85，92-101，106-119，131-144，146-164，171-177，182-191，203-218，282-288，297-310，343-359，361-367，400-405，433-439，454-462，483-492，496-504，506-517，522-529，552-559，564-572，574-580，590-604，625-660和252-396；Seq ID No 203的氨基酸33-50，67-75，89-95，107-116，119-126，151-158，165-170，175-187，237-243，252-258，272-282，323-332和115-166；Seq ID No 204的氨基酸14-23，41-53，63-107，111-134，136-155，179-210，223-233，261-267，285-290，296-302和203-299；Seq ID No 205的氨基酸22-31，35-41，53-62，64-75，79-90和1-22；Seq ID No 206的氨基酸4-14，17-30，33-44，54-62，67-76，78-97，112-118，143-152，163-169，175-188，191-199，207-216，232-239，243-249，262-268，289-296，312-319，335-340，1-35和183-264；Seq ID No 207的氨基酸5-18，37-53，56-66，74-81，100-110，120-131，135-141，150-156，174-181，189-196，202-211，225-235，246-251，255-260，311-319，326-332和245-332；Seq IDNo 208的氨基酸4-25，28-34，41-49，71-78，101-120，125-156，167-173，190-199，207-213，218-230，256-267，269-275，286-304，312-320，341-349，363-371，375-384和318-384；Seq ID No 209的氨基酸23-39，48-58，60-82，85-104，106-112，117-142，181-191，205-213，219-236，242-251，263-276，295-302，308-315，320-330，335-343，363-372，387-392，413-419，430-457，462-470，477-492，499-505，531-540，542-548，568-600，607-614，620-630和36-419；Seq ID No 210的氨基酸9-50，60-68，70-78，84-100，105-113，125-133，141-153，186-202，204-209，212-219，236-253，287-301，310-317，319-327，332-342，353-358，364-396，422-430，437-459，484-508，510-520，535-543，573-583，591-598，610-621，629-640，648-653，675-685，691-708，728-735，738-745，750-763，765-773，790-797，799-820，842-854，857-864，880-885，903-909，923-933，939-951，980-986，991-998，1019-1024，1026-1033，1045-1051，1064-1075，1077-1094，1100-1115，1139-1157，1163-1181，1196-1202，1207-1213，1219-1225，1241-1250，1275-1290，1304-1310，1332-1347，1352-1365，1383-1405，1421-1429，1433-1442，1372-1419和979-1467；Seq ID No 211的氨基酸4-40，60-65，90-102，125-138，150-160，162-172和14-104；Seq ID No212的氨基酸4-31，37-53，59-80，87-93，173-183，185-195，219-233，239-247，265-275和72-146；Seq ID No 213的氨基酸5-22，38-46，53-58，69-78，80-88，92-99，117-124，142-151，154-165，189-196，206-213，220-226，288-309，15-106和137-201；Seq IDNo 214的氨基酸4-17，37-47，58-66，75-81，83-89，106-116，145-152，162-168和41-155；Seq ID No 215的氨基酸4-16，50-57，66-72，92-100，102-112，126-150，156-167，194-204，208-218，244-256和165-200；Seq ID No 216的氨基酸19-26，38-51，81-89，96-103，107-114，117-122，128-134，150-158，164-170和26-48；Seq ID No 217的氨基酸5-24，30-35，42-47，74-86，107-117，146-156和15-92；Seq ID No 218的氨基酸5-22，41-49，55-65，85-96，100-106，111-117，125-132，150-155，161-189，204-212，229-243，262-277，286-296，304-311，314-323，353-359，367-373，391-397，410-417，446-451，485-500，335-381，422-484和251-528；Seq IDNo 219的氨基酸4-28，37-43，65-72，109-127，140-148，155-166，188-198和50-215；Seq ID No 220的4-24，41-55，71-79，84-89，95-100，113-125，138-148，193-203，215-221，300-306，334-350，362-369，385-396和91-213；Seq ID No 221的氨基酸4-24，94-101，103-112，128-134，141-148，156-165，172-181，191-197，281-290和25-76；Seq ID No 222的氨基酸5-13，19-25，27-40，47-54，63-69，84-98，119-125，143-158，170-182，199-205，223-234，237-251，257-265，287-292，296-301，307-328，336-352和336-362；Seq IDNo 223的氨基酸4-25，29-36，41-47，54-66，88-95，97-110，115-121，127-135，164-193，203-220，232-244，269-275，278-284，289-316，320-327，336-342，344-353，355-363，370-378，436-442，449-454，460-466，478-489，492-505和311-377；Seq ID No 224的氨基酸12-34，40-48，84-90，131-138，140-151，157-175，177-187，193-201，207-261，267-281，306-312，334-340，343-349，352-357，369-377，380-394和331-386；Seq ID No 225的氨基酸6-20，54-73，97-116，129-135，138-149，173-191，194-208和116-212；Seq ID No 226的氨基酸11-34，41-48，58-72，82-88，90-99，101-109，137-145，161-168，172-188，193-211，215-221，260-269，271-278，304-310，317-327，336-351和208-230；Seq ID No 227的氨基酸4-13，20-30，73-83，90-107，117-137，226-236，244-260，268-275，286-293，310-317，324-330，340-367，370-379，390-422，427-442，497-505，507-513，549-557，569-576，585-593，611-617，630-638，647-657，659-666，670-675，689-699，726-736，769-774，779-802，866-873，886-894，934-940，956-973，986-992，1009-1017，1026-1041，1043-1050，1056-1068，3-48和576-739；Seq ID No 228的氨基酸10-19，32-40，42-48，50-58，75-85，88-97，112-139和32-72；Seq ID No 229的氨基酸4-13，20-27，67-80，92-98，101-107，114-123，153-169，174-181，200-206，213-219，226-242，248-254，256-289，299-307，310-316，320-326，329-346，382-392和324-391；Seq ID No 230的氨基酸32-38，40-47，49-54，79-89，95-101，110-117，122-129，132-140，151-157，178-197，200-206，216-227，249-257，104-143和148-195；Seq ID No 231的氨基酸10-16，35-47，52-77，81-89，104-109，115-123，132-149，151-160，163-184，197-213，215-245，252-266，294-304，310-337，342-348，362-372，393-398，408-430，452-466，468-476，485-491，497-506，514-520，530-537，539-557，592-606，627-632，636-653，674-688，693-731，748-753，760-766，783-797，805-814，819-825，833-840，843-851，91-135，282-299和445-477；Seq ID No 232的氨基酸11-22，25-31，55-65，83-107，111-129和130-137；Seq ID No 233的氨基酸15-21，24-43，60-68，86-95，157-185，188-197和3-75；Seq IDNo 234的氨基酸13-19，35-44，56-73，79-92，116-129，143-158，169-178，198-210，215-221，238-243，247-256，261-267，270-294，310-320，331-341，360-366，377-387，397-406，412-421，423-439，449-455，458-465，473-479，483-492，510-525，561-569，571-597，599-619，635-641，686-704，712-721，738-755，761-767，781-794，806-813，844-857，862-873，875-882，889-896，901-915，921-931，937-943，963-975，991-997，1001-1009，1025-1032，1040-1046，1051-1056，1073-1080，1096-1105，1112-1154，1163-1170，1173-1180，1186-1197，1203-1208，1224-1232，1237-1249，1254-1261，400-429和521-545；Seq ID No 235的氨基酸6-30，81-87，117-128，134-142，147-158，178-186，217-227，246-255和61-122；Seq ID No 236的氨基酸4-22，31-38，77-83，130-137，159-169，188-194，208-229，231-238，272-283，286-294，308-315，317-336，338-347，8-232和265-318；Seq ID No 237的氨基酸9-23，26-34，36-42，73-94，113-142，186-192，200-221，232-238，246-252，254-279，292-307，311-316，20-62和95-181；Seq ID No 238的氨基酸26-37，58-67，83-89，97-109，114-141和1-76；Seq ID No 239的氨基酸13-20，28-35，70-78，95-102，156-169，171-180和121-178；Seq ID No 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253的氨基酸4-23，32-39，45-53，67-75，83-89，97-112，133-139，189-194，200-205，241-247，254-259，275-282，287-308，311-316，329-339，344-352和157-246；Seq ID No 254的氨基酸4-21，24-30，52-77，81-88，97-102，110-115，125-137和70-113；Seq ID No 255的氨基酸4-20，33-38，44-56，73-81，123-135，159-166，169-181，199-204和13-91；Seq ID No 256的氨基酸12-18，23-31，39-52，54-60，63-74，89-97，99-111和1-66；Seq ID No 257的氨基酸4-19，55-62，76-94，96-104，109-126和154-166；Seq ID No 258的氨基酸4-11，26-39和11-19；Seq ID No 259的氨基酸4-21和15-24；Seq ID No 260的氨基酸12-25和23-45；Seq ID No 261的氨基酸4-23，33-55，59-64，76-93，107-125，129-138和54-78；Seq ID No262的氨基酸4-27，56-82和21-40；Seq ID No 263的氨基酸8-17，24-36，47-61，76-83和65-83；Seq ID No 264的氨基酸4-22，37-46，54-60，64-70和13-25；Seq ID No 265的氨基酸9-17，23-41，64-86，6-25和53-66；Seq ID No 266的氨基酸4-23，29-48和18-29；SeqID No 267的氨基酸9-20，26-40，44-51和40-60；Seq ID No 268的氨基酸4-9，11-18，20-31和4-21；Seq ID No 135的氨基酸257-278；Seq ID No 137的氨基酸159-188和184-213；Seq ID No 138的氨基酸230-251和247-267；Seq ID No 139的氨基酸138-164和160-187；Seq ID No 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140的氨基酸97-120，116-139，135-158和154-177；Seq ID No 142的氨基酸195-228；Seq ID No 143的氨基酸165-192和188-214；Seq ID No 149的氨基酸6-29，25-47，43-65，68-92，262-288，306-331，326-351，449-471，467-489和485-507；Seq ID No 153的氨基酸80-103，99-122，118-141和137-159；SeqID No 156的氨基酸15-40，36-61，57-82，78-103，99-124和120-146；Seq ID No 157的氨基酸35-63，59-86，187-213，209-235和252-277；Seq ID No 160的氨基酸83-108，104-129，125-150，146-172，272-302和298-327；Seq ID No 165的氨基酸197-222，218-243，239-264和260-284；Seq ID No 166的氨基酸378-402，398-422，418-442和438-461；Seq ID No 171的氨基酸44-65，61-82和78-99；Seq ID No 172的氨基酸1230-1254和150-1275；Seq ID No174的氨基酸372-395，391-414和410-434；Seq ID No 175的氨基酸439-464；Seq ID No 179的氨基酸718-744，740-766，762-788，906-931，927-951和947-971；Seq ID No 180的氨基酸66-93，135-161和494-518；Seq ID No 181的氨基酸40-61，57-79和75-97；Seq IDNo 186的氨基酸440-462，458-480和476-497；Seq ID No 187的氨基酸91-114，110-133，129-152和148-170；Seq ID No 190的氨基酸156-183，179-206，202-229，225-252和248-274；Seq ID No 191的氨基酸747-773和769-795；Seq ID No 194的氨基酸6-33，29-55，52-79和74-100；Seq 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202的氨基酸281-307和631-654；Seq ID No145的氨基酸41-66，62-86，82-106，102-126，417-444，440-466，528-554，550-575和571-596。
在第八方面的实施方案中，抗原进一步由下列氨基酸残基组成：
a)1至50个额外的氨基酸残基，优选1至40个，更优选1至30个，更优选至多1至25个，更优选至多1至10个，最优选1、2、3、4或5个额外的氨基酸残基；和/或
b)至少一个与所述核心氨基酸序列异源的氨基酸残基。
在第八方面的实施方案中，氨基酸残基再核心氨基酸序列的C末端、N末端或者C末端和N末端的侧翼。
在第八方面的实施方案中，抗原包含至少2个，优选至少3个第八方面中定义的核心氨基酸序列。
在另外的实施方案中，优选由本发明的所述核酸编码的抗原是所述抗原的功能性或活性片段和/或功能性或活性变体。在另外的优选实施方案中，功能性或活性片段和/或功能性或活性变体如本文中所定义。
本发明的问题在第九方面中通过用于产生第五、第六、第七或第八方面中定义的蛋白质、超免疫血清反应性抗原或抗原、或其片段的方法来解决，包括表达第一或第二方面中定义的核酸分子。
本发明的问题在第十方面中通过用于产生表达第五、第六、第七或第八方面中定义的蛋白质、超免疫反应性血清抗原或抗原、或其片段的方法来解决，该方法包括用第三方面中定义的载体转化或转染合适的宿主细胞。
在第九和第十方面的实施方案中，蛋白质、超免疫反应性血清抗原或抗原、或其片段是来自狭义布氏疏螺旋体、嘎氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体、Borrelia andersonii、Borrelia bissettii、Borreliavalaisiana、Borrelia lusitaniae、Borrelia spielmani、Borreliajaponica、Borrelia tanukii、Borrelia turdae或Borrelia sinica抗原，优选来自狭义布氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体或嘎氏疏螺旋体的蛋白质、超免疫反应性血清抗原或抗原、或其片段。
本发明的问题在第十一方面中通过药物组合物，优选疫苗来解决，所述组合物包括第五、第六、第七或第八方面中定义的蛋白质、超免疫反应性血清抗原或抗原、或其片段，或者第一或第二方面中定义的核酸分子，或者第三方面中定义的载体。
在优选实施方案中，本发明的药物组合物还包括优选选自聚阳离子聚合物，更优选聚阳离子肽，免疫刺激性脱氧核苷酸(ODN)，包含至少两个LysLeuLys基序优选KLKLLLLLKLK的肽，神经活性化合物，更优选人生长激素，明钒，弗氏完全或不完全佐剂，或其组合的免疫刺激性物质。
在本发明的药物组合物的更优选实施方案中，免疫刺激物质是聚阳离子聚合物和免疫刺激脱氧核苷酸的混合物或包含至少两个LysLeuLys基序的肽和免疫刺激性脱氧核苷酸的混合物。
在本发明的药物组合物的更优选实施方案中，聚阳离子是聚阳离子肽，特别是聚精氨酸。
本发明的问题在第十二方面中通过第一方面或第二方面中定义的核酸分子，或者第五、第六、第七或第八方面中定义的蛋白质、超免疫反应性血清抗原或抗原、或其片段用于制备药物制剂或药物、特别地用于制备抗狭义布氏疏螺旋体、嘎氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体、Borrelia andersonii、Borrelia bissettii、Borrelia valaisiana、Borrelia lusitaniae、Borrelia spielmani、Borrelia japonica、Borrelia tanukii、Borrelia turdae和Borrelia sinica的疫苗，优选抗狭义布氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体或嘎氏疏螺旋体的疫苗中的用途来解决。
本发明的问题在第十三方面中通过抗体或至少其有效部分来解决，所述抗体或其有效部分结合第五、第六、第七或第八方面中定义的蛋白质、超免疫反应性血清抗原或抗原、或其片段，优选其活性片段或其变体(优选其活性变体)的选择性部分。
在第十三方面的实施方案中，抗体是单克隆抗体。
在第十三方面的实施方案中，所述有效部分包括Fab片段、F(ab)片段、F(ab)N片段、F(ab)2片段或Fv片段。
在第十三方面的实施方案中，抗体是嵌合抗体。
在第十三方面的实施方案中，抗体是人源化抗体。
本发明的问题在第十四方面中通过产生第十三方面中定义的抗体的杂交瘤细胞系来解决。
本发明的问题在第十五方面中通过用于产生在第十三方面中定义的抗体的方法来解决，其特征在于下列步骤：
a)通过对非人动物施用第五、第六、第七或第八方面中定义的蛋白质、超免疫反应性血清抗原或抗原或、其片段来在所述动物中起始免疫反应，
b)从所述动物中取出包含抗体的体液，和
c)通过将包含抗体的体液经历进一步的纯化步骤来产生所述抗体。
本发明的问题在第十六方面中通过用于产生第十三方面中定义的抗体的方法来解决，所述方法的特征在于下列步骤：
a)通过对非人动物施用第五、第六、第七或第八方面中定义的蛋白质、超免疫反应性血清抗原或抗原、或其片段来在所述动物中起始免疫反应，
b)从所述动物取出脾或脾细胞，
c)产生所述脾或脾细胞的杂交瘤细胞，
d)选择和克隆对于所述蛋白质、超免疫反应性血清抗原或抗原、或其片段是特异性的杂交瘤细胞，
e)通过培养所述克隆的杂交瘤细胞和任选地进一步的纯化步骤来产生抗体。
本发明的问题在第十七方面中通过第三方面定义的抗体在制备药物中的用途来解决，所述药物用于治疗或预防疏螺旋体、优选病原性疏螺旋体，更优选狭义布氏疏螺旋体、嘎氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体、Borrelia andersonii、Borrelia bissettii、Borreliavalaisiana、Borrelia lusitaniae、Borrelia spielmani、Borreliajaponica、Borrelia tanukii、Borrelia turdae和Borrelia sinica，以及最优选狭义布氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体或嘎氏疏螺旋体引起的感染。
根据另一个方面，本发明提供了结合或能够结合本发明中公开的蛋白质、超免疫反应性抗原或抗原、或者其活性片段或活性变体的拮抗剂。根据另一方面，本发明的拮抗剂是这样的拮抗剂，其能够减少或抑制根据本发明的蛋白质、超免疫血清反应性抗原或抗原、或其活性片段、或者其变体与其相互作用伴侣的相互作用活性。此类相互作用伴侣在优选实施方案中是所述蛋白质、超免疫血清反应性抗原和/或抗原，或者其活性片段或其活性变体的抗体或受体，优选生理学受体。
本发明的问题在第十八方面中通过用于鉴定能够结合第五、第六、第七或第八方面中定义的蛋白质、超免疫反应性血清抗原或抗原、或其片段的拮抗剂的方法来解决，所述方法包括：
a)在能够对候选拮抗剂与所述蛋白质、超免疫反应性血清抗原或抗原、或其片段的结合响应而提供可检测信号的组分存在的情况下，将分离的或固定的第五、第六、第七或第八方面中定义的蛋白质、超免疫反应性血清抗原或抗原、或其片段在允许所述候选拮抗剂与所述蛋白质、超免疫反应性血清抗原或抗原、或其片段结合的条件下与所述候选拮抗剂接触；和
b)检测在对拮抗剂与所述蛋白质、超免疫反应性血清抗原或抗原、或其片段的结合的响应中产生的信号的存在或不存在。
本发明的问题在第十九方面中通过用于鉴定能够减少或抑制根据第五、第六、第七或第八方面的蛋白质、超免疫反应性血清抗原或抗原、或其片段与其相互作用伴侣的相互作用活性的拮抗剂的方法来解决，所述方法包括：
a)提供第五、第六、第七或第八方面中定义的蛋白质、超免疫反应性血清抗原或抗原、或其片段，
b)为所述蛋白质、超免疫反应性血清抗原或抗原、或其片段提供相互作用伴侣，特别是根据本发明的第十三方面的抗体，
c)使所述蛋白质、超免疫反应性血清抗原或抗原、或其片段与所述相互作用伴侣相互作用，从而形成相互作用复合物，
d)提供候选拮抗剂，
e)使候选拮抗剂和相互作用复合物之间发生竞争反应，
f)确定候选拮抗剂是否抑制或减少蛋白质、超免疫反应性血清抗原或抗原、或其片段与相互作用伴侣的相互作用活性。
本发明的问题在第二十方面中通过第五、第六、第七或第八方面中定义的任意蛋白质、超免疫反应性血清抗原或抗原、或其片段在用于分离和/或纯化和/或鉴定所述蛋白质、超免疫反应性血清抗原或抗原、或其片段的相互作用伴侣的用途来解决。
本发明的问题在第二十一方面中通过用于诊断疏螺旋体属生物体引起的感染的方法来解决，所述方法包括步骤：
a)将从受试者获得的样品与第五、第六、第七或第八方面中定义的蛋白质、超免疫血清反应性抗原或抗原、或其任何片段接触；和
b)检测抗所述疏螺旋体属生物体的抗体在所述样品中的存在。
本发明的问题在第二十二方面中通过用于诊断疏螺旋体属生物体引起的感染的方法来解决，所述方法包括步骤：
a)将从受试者获得的样品与对于第一或第二方面中定义的核酸分子或其片段是特异性的引物或探针接触；和
b)检测此类核酸分子或其片段在所述样品中的存在。
本发明还提供用于体外诊断与根据本发明的超免疫血清反应性抗原或其片段的表达相关的疾病的方法，所述方法包括确定编码根据本发明的所述超免疫血清反应性抗原或其片段的核酸序列的存在或根据本发明的超免疫血清反应性抗原或片段的存在。
本发明的问题在第二十三方面中通过用于诊断疏螺旋体属生物体引起的感染的方法来解决，所述方法包括步骤：
a)将从受试者获得的样品与根据第十三方面的抗体接触；和
b)检测所述疏螺旋体属生物体的抗原在所述样品中的存在。
在第二十三方面的实施方案中，所述疏螺旋体属生物体的抗原是第五、第六、第七或第八方面中定义的蛋白质、超免疫血清反应性抗原或抗原。
在第二十一、二十二和二十三方面的实施方案中，疏螺旋体属生物体是病原性疏螺旋体属生物体，更优选是选自狭义布氏疏螺旋体、嘎氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体、Borrelia andersonii、Borreliabissettii、Borrelia valaisiana、Borrelia lusitaniae、Borreliaspielmani、Borrelia japonica、Borrelia tanukii、Borrelia turdae和Borrelia sinica，和更优选选自狭义布氏疏螺旋体菌株、阿氏疏螺旋体和嘎氏疏螺旋体的疏螺旋体属生物体。
此外，本发明提供了本发明中定义的蛋白质、超免疫血清反应性抗原或抗原、或者其片段或其变体用于产生与所述蛋白质、超免疫血清反应性抗原或抗原、或者其片段或其片段结合的肽的用途，其中所述肽是抗促成素(anticaline)。
本发明的问题在第二十四方面中通过第五、第六、第七或第方面中定义的蛋白质、超免疫反应性血清抗原或抗原、或其片段在用于制备功能性核酸的用途来解决，其中所述功能性核酸选自适体和镜像异构体(spiegelmer)。
本发明的问题在第二十五方面中通过第一或第二方面中定义的核酸分子用于制备功能性核糖核酸的用途来解决，其中所述功能性核糖核酸选自核酶、反义核酸和siRNA。
本发明的问题在第二十六方面中通过用于治疗优选有此需要的动物或人中的疏螺旋体属感染的方法来解决，所述方法包括对所述动物或人施用治疗有效量的任意之前的方面中定义的药物组合物或药物或第十三方面中定义的抗体的步骤。
在第二十六方面的实施方案中，疏螺旋体属感染是狭义布氏疏螺旋体、嘎氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体、Borrelia andersonii、Borrelia bissettii、Borrelia valaisiana、Borrelia lusitaniae、Borrelia spielmani、Borrelia japonica、Borrelia tanukii、Borrelia turdae或Borrelia sinica、优选狭义布氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体或嘎氏疏螺旋体引起的感染。
本发明的问题在第二十七方面中通过用于免疫动物或人以抗疏螺旋体属生物体引起的感染的方法解决，所述方法包括对所述动物或人施用有效量的第五、第六、第七或第八方面中定义的蛋白质、超免疫反应性血清抗原或抗原、或其片段，或者第一或第二方面中定义的核酸分子，或者第三方面中定义的载体的步骤，其中所述治疗有效量适合用于在所述动物或人中引发免疫反应。
在第二十七方面的实施方案中，疏螺旋体属生物体选自狭义布氏疏螺旋体、嘎氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体、Borrelia andersonii、Borrelia bissettii、Borrelia valaisiana、Borrelia lusitaniae、Borrelia spielmani、Borrelia japonica、Borrelia tanukii、Borrelia turdae和Borrelia sinica、优选狭义布氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体或嘎氏疏螺旋体。
本发明的问题在第二十八方面中通过用于在动物或人中刺激抗疏螺旋体属生物体的免疫反应的方法来解决，所述方法包括对所述动物或人施用有效量的第五、第六、第七或第八方面中定义的蛋白质、超免疫反应性血清抗原或抗原、或其片段，或者第一或第二方面中定义的核酸分子，或者第三方面中定义的载体的步骤，其中所述有效量适合在动物或人中刺激免疫反应。
在第二十八方面的实施方案中，疏螺旋体属生物体选自狭义布氏疏螺旋体、嘎氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体、Borrelia andersonii、Borrelia bissettii、Borrelia valaisiana、Borrelia lusitaniae、Borrelia spielmani、Borrelia japonica、Borrelia tanukii、Borrelia turdae和Borrelia sinica、优选狭义布氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体或嘎氏疏螺旋体。
在本发明的范围内的是，其中使用本发明中定义的蛋白质、超免疫血清反应性抗原或抗原的多种方法和用途分别还可通过使用此类蛋白质、超免疫血清反应性抗原或抗原的片段(优选其活性片段)，或者此类蛋白质、超免疫血清反应性抗原或抗原的变体(优选其活性变体)(每一种优选如本文中描述)来进行或实施。在本发明的范围内的还有，此处公开为与根据本发明的蛋白质、超免疫血清反应性抗原和/或抗原相互作用的或靶向其的各种化合物可额外地或备选地与所述蛋白质、超免疫血清反应性抗原或抗原的活性片段或活性变体相互作用或靶向其。
也在本发明的范围内的是，当不使用抗体而使用本文中定义抗促成素或功能性核酸时，原则上可实施在其实施中使用抗体的每一种或任何方法，其中此类功能性核酸选自适体和镜像异构体。这可样可用于本发明的各种用途。
在优选实施方案中，蛋白质、超免疫血清反应性抗原或抗原的片段(每一种如本文中公开)是展示此类蛋白质、超免疫血清反应性抗原或抗原的至少一个特征的此类蛋白质、超免疫血清反应性抗原或抗原的一部分。优选，所述特征是选自感染的治疗、动物包括人的免疫和动物包括人中免疫反应的刺激的特征。
也在本发明的范围内的是，本文中公开的关于疏螺旋体属和更优选广义布氏螺旋体的任何公开内容同样地可用于疏螺旋体属物种，其中疏螺旋体属物种优选选自狭义布氏疏螺旋体、嘎氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体、Borrelia andersonii、Borrelia bissettii、Borreliavalaisiana、Borrelia lusitaniae、Borrelia spielmani、Borreliajaponica、Borrelia tanukii、Borrelia turdae和Borrelia sinica。
如优选在本文中所使用的，术语根据本发明的多肽在广义上是指根据本发明的蛋白质、超免疫血清反应性抗原或抗原，包括其每一种和任何一种变体、片段、类似物或衍生物(特别如本文中所描述的)。在每当本文中使用术语多肽且如果没有明确另外说明的情况下，各自的公开内容也倾向于指或与根据本发明的任何蛋白质、超免疫血清反应性抗原或抗原(包括每一种和任何一种其变体、片段、类似物或衍物，特别地如本文中所描述的)相关。也要理解，描述的与由根据本发明的术语多肽涵盖的任意上述化合物的任一种相关的任何用途或方面应当也可用于由根据本发明的术语多肽涵盖的上述化合物的每一种和任何其他化合物。
通过使用来自多个人血浆库和来源于广义布氏螺旋体的基因组的表面表达文库，本发明有利地提供了有效的、相关的和广泛的成套的分离的核酸分子和由它们编码的蛋白质、超免疫反应性抗原或抗原，包括其活性片段和活性变体。因此，本发明实现了对于用于制备抗体和用于鉴定有效地抗由病原性疏螺旋体属物种，优选本文表A中描述的疏螺旋体属物种，更优选狭义布氏疏螺旋体菌株、阿氏疏螺旋体或嘎氏疏螺旋体引起的感染的化合物的方法的广义布氏螺旋体抗原、疫苗、诊断剂和产品的广泛的迫切需要。
有效的疫苗应当由蛋白质或多肽组成，所述蛋白质或多肽由所有株系表达且能够诱导抗所述病原性疏螺旋体属物种(包括狭义布氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体或嘎氏疏螺旋体)的细胞表面组分的高亲和力、丰富的抗体。所述抗体应当是用于调理作用的IgG2和/或IgG3，以及用于中和附着和毒素作用的任何IgG亚型。化学上定义的疫苗与完整的细胞疫苗(减毒的或杀死的)相比必须是明确更优的，因为所述病原性疏螺旋体属物种(包括狭义布氏疏螺旋体菌株、阿氏疏螺旋体或嘎氏疏螺旋体)的与人组织交叉反应或抑制调理作用的组分可以被消除，并且可选择诱导保护性抗体和/或保护性免疫反应的单种蛋白质。
在本发明的优选实施方案中，核酸分子在它们的全长上显示与Seq ID No 1-134、269-387或507-628中所示的核苷酸序列70％的同一性。包含在它们的全长上与Seq ID No 1-134、269-387或507-628中所示的核酸分子至少80％或至少85％的相同的区域的核酸是更优选的。在这点上，在它们的全长上与所述核苷酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％或96％相同的核酸分子是特别优选的。此外，具有至少97％的同一性的核酸分子是高度优选的，具有至少98％和至少99％的同一性的核酸分子是特别高度优选的，具有至少99％或99.5％的同一性的核酸分子是更优选的，具有100％的同一性的核酸分子是特别优选的。此外，该方面中的优选实施方案是核酸，所述核酸编码蛋白质、超免疫血清反应性抗原或抗原、或其片段(多肽)，其基本上保持与由Seq ID No 135-268、388-506或629-750中所示的所述核酸编码的成熟多肽相同的生物学功能或活性。也在本发明的范围内的是，根据本发明的核酸分子编码蛋白质，所述蛋白质优选为超免疫血清反应性抗原或抗原。仍在本发明的范围内的是，由Seq ID No 135-268、388-506或629-750编码的分子是蛋白质，其优选为抗原或超免疫血清反应性抗原。
同一性，如本领域中所已知的和本文中所使用的，是两个或多个多肽序列或两个或多个多核苷酸序列之间的通过比较序列确定的关系。在本领域中，同一性也指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性的程度，视具体情况而定，如通过此类序列的字符串(string)之间的匹配所确定的。可容易地计算同一性。虽然存在许多测量两个多核苷酸或两个多肽序列之间的同一性的方法，但所述术语对于本领域技术人员来说是熟知的(例如Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987)。确定同一性的优选方法经设计以使受试序列之间产生最大的匹配。将确定同一性的方法编码在计算机程序中。确定两个序列之间的同一性的优选计算机程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux，J.等人，1984)，BLASTP，BLASTN，和FASTA(Altschul，S.等人，1990)。
根据本发明的核酸分子，作为通过参照Seq ID No的在本文中描述的核酸分子(其描述在本文中也称为第一备选)的第二备选，也可以是与根据本文的第一备选描述的核酸至少大体上互补的核酸分子。本领域技术人员知道，个体核酸分子与另一个个体核酸分子至少大体上互补。如本文中所使用的，互补是指核酸链通过Watson-Crick碱基配对与第二核酸链的碱基配对。本文中使用的大体上互补是指碱基配对不是对各自链的所有碱基发生，而是留下一定数目或百分数的未配对的或错配的碱基。正确配对的碱基的百分数优选至少是70％、更优选80％、更优选90％和最优选高于90％的任何百分数。此类更高的百分数包括91、92、93、94、95、96、97、98、99和100％，其中此类定义可用于其中使用该种命名法的本申请的各个方面。要指出的是，70％的配对碱基百分数被认为是同源的，具有该程度的匹配碱基对的杂交被认为是严格的。该类型的严格杂交的杂交条件可来自CurrentProtocols in Molecular Biology(John Wiley和Sons，Inc.，1987)。更具体地，杂交条件可以如下：
a)在68℃下在例如5xSSPE、5xDenhard t′s试剂、0.1％SDS、100g/mL剪切的DNA中进行的杂交
b)在42℃下在0.2xSSC，0.1％SDS中进行的中等严格清洗
c)在68℃下0.1xSSC，0.1％SDS中的高严格清洗
具有50％的GC含量的基因组DNA具有大约96℃的TM。对于1％的错配，TM减少大约1℃。
此外，原则上同样可使用本文中描述的任何其他杂交条件。
当然，编码与由本发明鉴定的多肽分子相同的多肽分子的所有核酸序列分子包括在给定的编码序列的任何公开内容中，因为遗传密码的简并性可直接用于明确确定编码给定的多肽分子的所有可能的核酸分子，即使此类简并核酸分子的数目可以很多。这也可用于给定的多肽、蛋白质、超免疫血清反应性抗原或抗原的活性片段或活性变体，只要所述片段或变体编码多肽、蛋白质、超免疫血清反应性抗原或抗原，使用所述肽、蛋白质、超免疫血清反应性抗原或抗原适合以使可获得与如下相同的效应，就好象使用全长多肽、蛋白质、超免疫血清反应性抗原或抗原一样，优选其可以例如作为主动或被动疫苗用于接种背景(vaccination connection)。
根据本发明的核酸分子，作为第三备选，也可以是包含根据上述本发明的核酸分子的第一或第二备选的核酸分子的至少15个碱基的片段(stretch)的核酸。优选，碱基形成碱基的连续片段。然而，也在本发明的范围内的是，片段由被许多碱基分开的两个或更多个部分组成。
根据本发明的核酸分子可优选由来自本文公开的序列的至少20个，更优选至少30个，特别地至少50个连续碱基组成。由于希望的使用的领域(例如作为(PCR)引物、探针、捕获分子(例如在(DNA)芯片上)等)的原因，可容易地最优化合适的长度。优选核酸分子包含表1、5和6中所列的一个或多个免疫原性氨基酸序列的至少连续15个碱基部分。特别优选的是如下核酸，所述核酸包含本申请的序列方案中包括的任何序列的DNA序列的连续部分，其与通过它们的NCBI目录号和质粒名称(可变质粒片段；VPS)在下面显示的狭义布氏疏螺旋体菌株和嘎氏疏螺旋体基因组和质粒相比，展示1个或多个，优选超过2个，特别地超过5个不相同的核酸残基：
狭义布氏疏螺旋体(B31)、NC_001318(线性染色体)、NC_000957(1p5)、NC_000956(1p56)、NC_000953(cp32-8)、NC_000952(cp32-7)、NC_000951(cp32-6)、NC_000950(cp32-4)、NC_000949(cp32-3)、NC_000948(cp32-1)、NC_000955(1p21)、NC_000954(cp32-9)、NC_001904(cp9)、NC-001903(cp26)、NC-001851(1p28-1)、NC_001857(Ip54)、NC_001856(Ip38)、NC_001855(1p36)、NC_001854(1p28-4)、NC_001853(1p28-3)、NC_001852(1p28-2)、NC_001850(1p25)、NC_001849(Ip17)；
嘎氏疏螺旋体(PBi)、NC_006156(线性染色体)、NC_006128(cp26)、NC_006129(1p54)、NT_108263(VPS G11a15f12.s1)、NT_108262(VPS G1M1b11b03.s1)、NT_108261(VPS G1M1b15c06.r1)、NT_108260(VPS G11a14d08.s1)、NT_108259(VPS PBi11a03e01.s1)、NT_108258(VPS G1a13d03.r1)、NT_108257(VPS G1Mb19g09.r1)、NT_108256(VPS G11a19d04.r1)、NT_108255(VPS G1a13d06.s1)、NT_108254(VPS G1a18e10.s1)、NT_108253(VPS G1a22b07.r1)、NT_108252(VPS G11a15h12.r1)、NT_108251(VPS G1a18d09.s1)、NT_108250(VPS G1a07g11.r1)、NT_108249(VPS G1Mb28a10.r1)、NT_108248(VPS G1a23g09.r1)、NT_108247(VPS PBi1M1b05c04.r1)、NT_108246(VPS G1M1b09a03.r1)、NT_108245(VPS G1a10e03.r1)、NT_108244(VPS G1Mb12b07.s1)、NT_108243(VPS G1a25a05.r1)、NT_108242(VPS G11a16g12.s1)、NT_108241(VPS G11a14a06.r1)、NT_108240(VPS G1a34d11.r1)、NT_108239(VPS G1a19c04.r1)、NT_108238(VPS G1Mb03b12.r1)、NT_108237(VPS G11a16d07.r1)、NT_108236(VPS G1a09h07.r1)、NT_108235(VPS G1a07d05.r1)、NT_108234(VPS G1M1b07c12.s1)、NT_108233(VPS G11a15e03.s1)、NT_108232(VPS G1M1b09g01.s1)、NT_108231(VPS G1a34h09.s1)、NT_108230(VPS G1a08d08.s1)、NT_108229(VPS G1M1b13a11.r1)、NT_108228(VPS G11a17h03.s1)、NT_108227(VPS G1a19d06.s1)。
特别优选不相同的核酸残基是导致不相同的氨基酸残基的残基。优选，核酸序列编码与上述的公布的或列出的广义布氏螺旋体对应物相比具有至少一个，优选至少2个，优选至少3个不同氨基酸的多肽、蛋白质、超免疫血清反应性抗原或抗原。优选，该类型的多肽、蛋白质、超免疫血清反应性抗原或抗原仍然具有本文中公开的具有相同氨基酸残基的分子的特征的至少一个特征。此外，作为本文中公开的例如序列表中公开的蛋白质(或完整蛋白质)、超免疫血清反应性抗原或抗原的具有至少6、7或8个氨基酸残基和由这些核酸编码的片段的分离的多肽也是优选的。
根据本发明的核酸分子，作为第四备选，也可以是在严格杂交条件下与根据本文中公开的第一、第二或第三备选的本发明的任意核酸退火的核酸分子。严格杂交条件通常是本文公开的严格杂交条件。
最后，根据本发明的核酸分子，作为第五备选，也可以是若非遗传密码的简并性的原因，则与本文中所述第一、第二、第三和第四备选的根据本发明的任意核酸分子杂交的核酸分子。该类型的核酸分子是指如下事实：即优选地根据本发明的核酸编码根据本发明的蛋白质、超免疫血清反应性抗原或抗原、或者其片段或其变体。该类型的核酸分子特别适合用于检测根据本发明的核酸分子，从而适合用于诊断各微生物，例如狭义布氏疏螺旋体或任何病原性疏螺旋体属物种，特别是本文中公开的那些病原性疏螺旋体属物种，以及其中牵涉此类微生物的任何疾病或病状，优选地，此类微生物直接或间接引起例如机会性微生物(opportunistic micro-organism)的此类疾病或病状。优选，可在关于本文中描述的第四备选所描述的严格条件下发生或进行杂交。
本文中所使用的核酸分子通常是指可以是未修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA的任何核糖核酸分子或脱氧核糖核酸分子。因此，例如，本文中所使用的核酸分子是指，除其他以外，单链和双链DNA、为单链和双链RNA的混合物的DNA和为单链和双链区域的混合物的RNA、包含可以为单链或更常见地双链或三链的或单链和双链区域的混合物的DNA和RNA的杂种分子。此外，本文中所使用的核酸分子是指包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区域。此类区域中的链可来自相同的分子或来自不同的分子。所述区域可包括所有一个或多个分子，但更常见地只包括一些分子的区域。三螺旋区域的分子中的一个通常是寡核苷酸。如本文中所使用的，术语核酸分子包括上述包含一个或多个修饰的碱基的DNA或RNA。因此，具有为稳定性或为其他原因修饰的主链的DNA或RNA是在本文中所指的术语“核酸分子”。此外，包含稀有碱基(仅举两例，例如肌苷或修饰的碱基例如三苯甲基化的碱基)的DNA或RNA是在本文中所使用的术语所指的核酸分子。应当理解，已对提供本领域技术人员已知的许多有用的目的的DNA和RNA进行了多种修饰。术语核酸分子，如其在本文中所使用的，包括核酸分子的此类化学、酶促或代谢上修饰的形式以及病毒和细胞(包括，除其他以外，简单和复杂细胞)的DNA和RNA特征的化学形式。术语核酸分子还包括通常称为寡核苷酸的短核酸分子。“多核苷酸”和“核酸”或“核酸分子”在本文中通常可互换使用。
本发明中提供的核酸分子还包括许多比本发明的序列表中所示的核酸分子序列更长和更短的独特片段，更特别地狭义布氏疏螺旋体编码区的片段，所述片段可通过标准克隆方法产生。为了具有独特性，片段必须具有足够的大小以使其与其他已知的核酸序列相区别，其最容易通过将任何选择的狭义布氏疏螺旋体片段与计算机数据库例如GenBank中的核苷酸序列相比较来确定。本领域技术人员将理解：本文中在关于广义布氏疏螺旋体的任何方面所述的内容同样可用于本文中描述的任何其他疏螺旋体属物种，更优选本文中描述的任何病原性疏螺旋体属物种。
此外，可对本发明包括的核酸分子和多肽进行修饰。例如，可进行不影响由核酸编码的多肽的核苷酸置换，从而编码超免疫血清反应性抗原或其片段的任何核酸分子包括在本发明内。
此外，通过使用标准技术例如标准克隆技术，可将任何由本发明提供的编码超免疫血清反应性抗原或其片段的核酸分子与任何希望的调控序列(无论广义布氏疏螺旋体的调控序列或异源调控序列、异源前导序列、异源标记序列还是异源编码序列)功能性连接，以产生融合蛋白。
本发明的核酸分子可以RNA的形式，例如rnRNA或cRNA，或DNA的形式，例如通过克隆获得的或通过化学合成技术产生的或通过其组合获得的cDNA和基因组DNA。DNA可以是三链、双链或单链的。单链DNA可以是编码链，也称为有义链，或其可以是非编码链，也称为反义链。
本发明还涉及本文中描述的编码具有序列表中所示的推导的广义布氏疏螺旋体氨基酸序列的超免疫血清反应性抗原和其片段的片段、类似物和衍生物的核酸分子的变体。核酸分子的变体可以是天然的变体例如天然的等位基因变体，或其可以是已知非天然的变体。可通过诱变技术包括用于核酸分子、细胞或生物的诱变技术产生核酸分子的此类非天然的变体。
在这一点上，变体当中的一些变体是通过核苷酸置换、缺失或添加而与上述核酸分子不同的变体。置换、缺失或添加可包涉及一个或多个核苷酸。可在编码或非编码区或两者对变体进行改变。编码区中的改变可产生保守或非保守氨基酸置换、缺失或添加。编码具有序列表中所示的广义布氏疏螺旋体的序列(其中几个、少数几个、5至10个、1至5个、1至3个、2个、1个或无氨基酸以任何组合被置换、缺失或添加)的变体、类似物、衍生物或片段或者片段的变体、类似物或衍生物的核酸分子是优选的。其中特别优选的是不改变序列表中所示的广义布氏疏螺旋体的多肽的性质和活性的沉默置换、添加和缺失。在这一点上，保守置换也是特别优选的。
本文中公开的在它们的不同实施方案中的任何抗原以及特别地在本文中由Seq ID No 135-268、388-506或629-750指定的抗原和肽的变体，通常也可通过生物信息学的方法来表征。各工具例如NCBIBasic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul，S.等人，1990)可从多个来源(包括国家生物技术信息中(NCBI，Bethesda，MD)和在互联网上)获得，以与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx结合使用。对于至少35个氨基酸的氨基酸序列的比较，通过使用设置成缺省参数(缺口blastp；缺口存在成本(gapexistence cost)为11和每残基缺口成本(gap cost)为1)的缺省BLOSUM62矩阵来使用NCBI Blast 2.0的Blast 2序列函数。当比对短肽(少于大约35个氨基酸)时，通过使用设置成缺省参数(开放缺口9，延伸缺口1罚分)的PAM30矩阵，使用Blast 2序列函数来进行比对。用于确定这样的短窗口例如15个氨基酸或更少氨基酸上的序列同一性的方法描述于由Bethesda，Maryland的国家生物技术信息中心的网站(http://www.ncbi.nlmn.nih.gov/BLAST)。
可通过蛋白质、超免疫血清反应性抗原或抗原(它们在本文中也统称为根据本发明的多肽，如果没有明确指出与之相反，包括包括其每一种和任何变体、片段、类似物或衍生物)的序列改变获得抗原的功能性活性片段(其在本文中也称为功能性变体或活性变体(它们因而可在本文中以可互换的形式使用))，其中根据本发明的具有序列改变的多肽保持根据本发明的无改变的多肽的功能，例如其特异性结合结合根据本发明的多肽的无改变形式的多肽特异性抗体。此类序列改变可包括但不限于保守置换、缺失、突变和插入。优选，活性变体展示与莱姆病患者的人血清的反应性，更优选介导血清转换和最优选显示杀细菌活性。可以如实施例中所述估计活性变体的这些特征。在本发明的上下文中，变体特异性结合特定抗体(优选为在动物例如小鼠、兔子中针对重组蛋白产生的多克隆抗体或在小鼠中产生的单克隆抗体)，展示与莱姆病患者的人血清的反应性，介导血清转换或显示杀细菌活性，如果变体的活性达到无序列变化的抗原的活性的至少10％、优选至少25％、更优选至少50％、更优选至少70％、更优选至少80％、特别地至少90％、特别地至少95％、最优选至少99％。
术语“功能性活性变体”或“活性变体”包括天然的等位基因变体以及突变体或任何其他非天然的变体。如本领域内已知的，等位基因变体是特征在于具有基本上不改变多肽的生物学功能的一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加的多肽的备选形式。“生物学功能”优选是指多肽在其天然所在的细胞或生物中的功能，即使所述功能分别不是细胞和生物的生长或存活所必需的。例如，孔蛋白的生物学功能允许存在于细胞外基质中的化合物进入细胞。生物学功能与抗原功能显著不同。根据本发明的多肽可具有多种生物学功能。
在生命界的任何种内，等位基因变异是规律。例如，任何细菌物种例如广义布氏疏螺旋体通常由多种相互之间相异于极小的等位基因变异的株系(特征在于无性系繁殖)代表。事实上，在不同株系中实现相同生物学功能的多肽可具有在各个株系中不相同的氨基酸序列。这样的等位基因变异同样地在多核苷酸水平上得到反映。
如关于ospC所描述的，等位基因变异在疏螺旋体属物种是非常普遍的(Livey，I.等人，1995)。
在优选实施方案中，通过氨基酸交换、缺失或插入，从根据本发明的多肽衍生的活性片段的活性变体也可以保持或更优选改进活性(本文中定义的反应性、血清转换和/或杀细菌活性)。此外，这些多肽还可包含触发相同的或优选改进的T细胞反应的表位。此类表位称为本文中进一步定义的“变态的(heteroclitic)”。它们具有对相似的或优选更大的对MHC/HLA分子的亲和力，和以相似或优选更强的方式刺激针对原始表位的T细胞受体(TCR)的能力。可通过合理设计即考虑单个残基对结合MHC/HLA的贡献(如例如由Rammensee等人(Rammensee，H.等人，1999，Immunogenetics.50：213-219)所描述的)，结合潜在地与TCR相互作用的残基的系统交换和用针对原始表位的T细胞检测所得的序列来获得变态表位。这样的设计对于本领域技术人员来说是可能的，无需过度的实验。
在本发明的更优选实施方案中，本发明的多肽的活性变体是本文中公开的任何多肽，更特别地由Seq ID No 135-268、388-506或629-750定义的任何多肽，其具有与任何所述Seq ID No的多肽至少50％的序列同一性，特别地与任何所述Seq ID No的多肽至少60％、优选至少70％、更优选至少80％、更优选至少90％、更优选至少95％、最优选99％的序列同一性和/或通过保守置换衍生自任何Seq ID No的序列的所述多肽。保守置换是在于它们的侧链和化学性质中相关的氨基酸的家族内发生的置换。此类家族的实例是具有碱性侧链的氨基酸、具有酸性侧链的氨基酸、具有非极性脂肪族侧链的氨基酸、具有非极性芳香族侧链的氨基酸、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸、具有小侧链的氨基酸、具有大侧链的氨基酸等。在一个实施方案中，肽中包含一个保守置换。在另一个实施方案中，在肽中包含2个保守置换或更少的保守置换。在另外的实施方案中，肽中包含3个保守置换或更少的保守置换。
保守氨基酸置换的实例包括但不限于下面所列的保守置换：
原始残基 保守置换
Ala Ser
Arg Lys
Asn Gln；His
Asp Glu
Cys Ser
Gln Asn
Glu Asp
His Asn；Gln
Ile Leu，Val
Leu Ile；Val
Lys Arg；Gln；Asn
Met Leu；Ile
Phe Met；Leu；Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp；Phe
VaI Ile；Leu
根据本发明的多肽和其片段和变体也包含或由修饰的表位以及编码此类修饰的表位的核酸序列组成，在所述修饰的表位中，优选按照例如Tourdot，S.等人，2000中公开的法则修饰或替代给定的表位的一个或两个氨基酸。由根据本发明的多肽提供的表位在本文中也称为本表位。
很清楚，通过氨基酸交换从而提高、保持或至少不显著削弱表位的T细胞激活能力而从本表位衍生的表位也包括在根据本发明的表位内。因此，本发明还包括不包含如从广义布氏疏螺旋体衍生的原始序列但触发相同的或优选改进的T细胞反应的表位。这些表位称为“变态的”，它们需要具有相似的的或优选更大的对MHC/HLA分子的亲和力，和需要以相似或优选更强的方式刺激针对原始表位的T细胞受体(TCR)的能力。
鉴定表位，更具体的变态表位的另一种可能性包括用针对一种或几种本表位的T细胞筛选肽文库。优选方法是合成肽文库的位置扫描法(positional scanning)。此类文献已经例如由Hemmer，B.等人，1999和其中给出的参考文献详细描述。
作为由本发明的衍生的氨基酸序列显示的表位或本文中公开的变态表位的备选，可以使用模拟这些表位、在本文中也称为“肽模拟物(peptidemimetica)”或“retro-inverse-peptides”的物质或化合物，从而其在本发明的范围内。
改进的表位的设计的另一个方面是用增加它们刺激T细胞的能力的物质对它们的配制或修饰。此类物质包括T辅助细胞表位、脂质或脂质体或WO 01/78767中描述的优选修饰。
增加表位的T细胞刺激能力的另一个方法是使用免疫刺激物质对它们的配制，所述免疫刺激物质例如细胞因子或趋化因子如白细胞介素-2、-7、-12、-18、I类和II类干扰素(IFN)特别是IFN-γ、GM-CSF、TNF-α、flt3-配体和其他物质。
本发明的核酸分子还可用作例如RNA、cDNA和基因组DNA的杂交探针以分离编码本发明的多肽的全长cDNA和基因组克隆以及分离具有与本发明的核酸分子高度序列相似性的其他基因的cDNA和基因组克隆。此类探针通常将包含至少15个碱基。优选此类探针将具有至少20、至少25或至少30个碱基，和可具有至少50个碱基。特别优选的探针将具有至少30个碱基，和将具有50个碱基或更少的碱基，例如30、35、40、45或50个碱基。
例如，本发明的核酸分子的编码区可通过使用已知的DNA序列合成寡核苷酸探针来筛选相关文库来进行分离。然后使用具有与本发明的基因的序列互补的序列的标记的寡核苷酸筛选cDNA、基因组DNA或mRNA的文库以确定所述探针与其杂交的文库的成员。
本发明的核酸分子和多肽可用作开发或制备用于本文中进一步描述的疾病特别是人疾病的药剂和/或诊断剂的试剂和材料。
作为寡核苷酸的本发明的核酸分子可用于本文中所述的方法，但优选用于PCR，以确定本文中限定的广义布氏疏螺旋体的基因是以整体还是以部分存在于被感染的组织例如皮肤、滑液或血液中和/或在其中转录。要承认，此类序列在已获得的病原体的感染的分期和感染的类型的诊断中也具有功用。为了该目的和其他目的，可使用在本领域中已知的、包含本文中所描述的根据本发明的核酸或多肽的至少一种的阵列。
根据本发明的核酸分子可用于检测核酸分子和包含这些核酸的生物体或样品。优选该检测用于诊断，更优选用于诊断与狭义布氏疏螺旋体或疏螺旋体属的任何其他病原体物种(优选阿氏疏螺旋体或嘎氏疏螺旋体)的存在或丰度相关或关联的疾病。
感染狭义布氏疏螺旋体或疏螺旋体属的任何其他病原体物种，优选阿氏疏螺旋体或嘎氏疏螺旋体的真核生物(本文中也为称为“个体”)，特别地哺乳动物，特别是人，可通过检测(通过多种技术在DNA水平上检测)任何根据本发明的核酸分子来进行鉴定。可获得用于区分狭义布氏疏螺旋体或所述病原性疏螺旋体属与其他生物体的优选核酸分子候选物。
本发明提供了用于诊断由狭义布氏疏螺旋体或疏螺旋体属的任何其他病原体物种，优选阿氏疏螺旋体或嘎氏疏螺旋体引起的感染所产生的疾病的方法，该方法包括在从个体分离或产生的样品中确定具有本文中公开的核酸分子的序列，更优选序列表中所示的序列的核酸分子的增加的表达水平。核酸分子的表达可使用本领域技术人员已知的用于定量核酸分子的任一方法，例如本文中描述的PCR、RT-PCR、RNA酶保护法、Northern印迹、其他杂交方法和阵列来测量。
本文中所使用的分离的是指“通过人工”从其天然状态分离，即，如果其天然发生，其已发生改变或从其天然环境取出或两者都发生。例如，以其天然状态天然存在于活生物体中的天然的核酸分子或多肽不是“分离的”，但从其天然状态的共存材料分离的相同核酸分子或多肽是“分离的”，和本文中使用的术语所指的意义一样。作为分离的部分或分离后，可以例如将此类核酸分子与其他核酸分子例如DNA连接以进行诱变，从而形成融合蛋白，和用于在宿主中扩增或表达。可将单独的或与其他核酸分子例如载体连接的分离的核酸分子导入培养中或完整生物体中的宿主细胞。在导入培养中的或完整生物体中的宿主细胞后，此类DNA仍然是分离的，与术语在本文中使用时所指的意义一样，因为它们将不以它们的天然的形式或环境存在。类似地，核酸分子和多肽可发生在例如为非天然的组合物的组合物中，例如发生在用于将核酸分子或多肽例如导入细胞的媒介制剂、溶液、用于化学或酶促反应的组合物或溶液中，从而使分离的核酸分子或多肽保持在该术语的意义(与其在在本文中使用的一样)内。
根据本发明的核酸可化学合成。备选地，核酸可通过本领域技术人员已知的方法从狭义布氏疏螺旋体或疏螺旋体属的其他病原体物种优选阿氏疏螺旋体或嘎氏疏螺旋体分离。同样适用于根据本发明的多肽。
根据本发明的另一个方面，提供了多组新型多肽。此类多肽，如本文中之前所提及的，是本文中公开的蛋白质、超免疫血清反应性抗原和抗原，以及其片段，优选其活性片段和其片段，优选其活性变体。优选，根据本发明的多肽是超免疫血清反应性抗原和其片段。在本发明的优选实施方案中，提供了包含优选由本文中描述的核酸分子和其片段中的任一个编码的氨基酸序列的超免疫血清反应性抗原。在本发明的另一个优选实施方案中，提供了包含选自Seq ID No 135-268、388-506或629-750的氨基酸序列的一组新型蛋白质、超免疫血清反应性抗原和抗原以及其活性片段和活性变体组。
根据本发明的特别优选多肽或其片段是表8和10中所列的多肽。
根据本发明的多肽即由本发明提供的蛋白质、超免疫血清反应性抗原和抗原优选包括序列表中所示的任何多肽或分子，以及具有与根据本发明的该多肽至少70％的同一性，优选具有与根据本发明的该多肽至少80％或85％的同一性，和更优选具有与根据本发明的该多肽和更优选序列表中所示的多肽至少90％的相似性(更优选至少90％的同一性)和更优选具有与根据本发明的该多肽至少95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的相似性(更优选至少95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的同一性)的多肽，其还包括此类多肽的部分，多肽的该部分通常包含至少4个氨基酸和更优选至少8个，更优选至少30个，更优选至少50个氨基酸，例如4、8、10、20、30、35、40、45或50个氨基酸。在优选实施方案中，此类部分是根据本发明的多肽的活性片段。
本发明还涉及根据本发明的多肽的片段、类似物和衍生物以及其片段和其变体。当提及其氨基酸序列优选示于序列表的根据本发明的此类多肽时，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”优选是指单独地或以任何组合的形式保持与该多肽大体上相同或相似的生物学功能或活性和/或相同或相似的结构属性的多肽。本领域技术人员将承认，本文中所使用的术语“相似的生物学功能或活性”的意义优选取决于所考虑的多肽，更具体来说是其功能。更优选，相似的生物学功能或活性在根据本发明的该多肽的一个或几个化学活性、生物学活性或其他活性方面与非片段或非衍生物的功能不同。更优选，生物学功能或活性通过活性、亲和力、抗原性的程度来确定，优选表示为抗原性指数、免疫原性、稳定性和/或特异性。在优选实施方案中，差异小于50％，小于75％或小于90％。特别优选片段、类似物和衍生物是包含赋予狭义布氏疏螺旋体或任何其他病原性疏螺旋体属物种的存活力所必需的功能、或在人中引起疾病的能力的受体或酶的结构域的片段、类似物和衍生物。进一步优选的根据本发明的片段、类似物和衍生物是包括或包含动物中特别是人中的抗原或免疫原决定簇的片段、类似物和衍生物。此类片段也分别称为抗原性片段、抗原性衍生物和抗原性类似物。也在本发明的实施方案内的是，此类相似的生物学功能或活性在不希望的活性方面得到减少。优选，这样的减少是由根据本发明的多肽展示的该活性的至少10％，优选至少20％和更优选至少50％。在特别优选实施方案中，这样的减少的不希望的活性是酶促功能和毒性功能和/或人交叉反应性抗体的产生。本领域技术人员也承认，本文中所使用的术语“相似的结构属性”的意义优选取决于所考虑的多肽和更具体是其功能和/或其结构。在优选实施方案中，此类结构属性是根据本发明的多肽的α螺旋和形成α螺旋的区域、β折叠片和形成β折叠片的区域、转角和形成转角的区域、卷曲(coil)和形成卷曲的区域、亲水区、疏水区、α两亲性区域、β两亲怀区域、柔韧区、形成表面的区域、底物结合区和高抗原性指数区和其任何组合。
在实施方案中，根据本发明的多肽的片段、衍生物、变体或类似物是1)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选保守氨基酸残基)置换并且该被置换的氨基酸残基可以由或可以不由遗传密码编码的多肽，或2)其中一个或多个氨基酸残基包含取代基的多肽，或3)其中根据本发明的多肽或其片段与另一种化合物例如增加其根据本发明的多肽的半衰期的化合物例如聚乙二醇融合的多肽，或4)其中额外的氨基酸融合至根据本发明的多肽或其片段的多肽，例如前导序列或分泌序列或用于纯化根据本发明的所述多肽或其片段或前蛋白序列的序列。根据本文中的教导，此类片段、衍生物、变体和类似物据认为在本领域技术人员的能力范围之内。
本发明还涉及不同狭义布氏疏螺旋体分离株和来自其他疏螺旋体属物种优选病原性疏螺旋体属物种(包括阿氏疏螺旋体和嘎氏疏螺旋体)的分离株的、优选为同源物的蛋白质、超免疫血清反应性抗原和抗原。此类同源物可容易地基于本文中公开的核酸和氨基酸序列进行分离。对于每一种病原体存在迄今为止明显不同的多个血清型或临床株系，分型基于血清型特异性抗血清或分子方法。因此对于每一种血清可确定任何抗原的存在。此外，如对于ospC(Livey，I.等人，1995)所描述的，可能确定特定抗原在不同广义布氏疏螺旋体基因型群和株系中的差异性(variability)。不血清型对不同疏螺旋体属感染的贡献随不同年龄组和特别是地理区域的变化而变化。重要的方面是，最有价值的保护性抗原需要在不同的临床株系中保守。
此外，本发明还包括包含此类超免疫血清反应性抗原、其变体、类似物、衍生物的融合多肽和所述片段的变体、类似物和衍生物也包括在本发明中。可使用包括用于产生和表达编码融合蛋白的重组多核苷酸的标准重组技术的标准技术来容易地制备此类融合多肽和蛋白质以及编码它们的核酸分子。
其中优选变体是通过保守氨基酸置换而与参照不同的变体。此类置换是用相似特征的另一种氨基酸置换根据本发明的多肽中的给定氨基酸的置换。通常看作保守置换的是在脂肪族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile之间用一种氨基酸取代另一种氨基酸的取代；羧基残基Ser和Thr的互换，酸性残基Asp和Glu的交换，酰胺残基Asn和Gln之间的置换，碱性残基Lys和Arg的交换以及芳香族残基Phe和Tyr间的取代。
在这点上特别优选的是，具有本文中公开的根据本发明的任何多肽的氨基酸序列和优选序列表中所示的氨基酸序列、其中以任何组合置换、缺失或添加几个、少数几个、5至10个、1至5个、1至3个、2个、1个氨基酸或无氨基酸的变体、类似物、衍生物和片段以及所述片段的变体、类似物和衍生物。其中特别优选的是不改变本发明的肽的性质和活性的沉默置换、添加和缺失。在这点上，保守置换也是特别优选的。最优选的是具有序列表中所示的氨基酸序列的、无置换的肽。
根据本发明的多肽优选以分离的形式提供，和优选纯化至均一。
抗原性片段优选定义为其本身抗原性或当以半抗原提供时可产生抗原性的片段。因此，本发明使得能够产生显示一个或特别地对于更长的片段只有少数氨基酸交换的抗原或抗原性片段，只要具有氨基酸交换的此类片段的抗原性或抗原能力(antigenic capacity)在交换后不被严重削弱，即适合用于在使用该抗原接种的个体引中发适当的免疫反应和通过来自个体血清的个体抗体制剂来鉴定。
根据本发明的多肽的此类片段的优选实例是这样的多肽，所述多肽也可获自表1、5、6、8和10和优选为在其不同的实施方案中相应于根据本发明的第八方面的抗原，更优选具有或包含与之一起显示的核心氨基酸序列。
所有此类片段单个地和各自独立地形成本发明的优选选择的方面。
要理解，本发明还涉及，除其他以外，编码上述片段、变体、活性变体和活性片段的核酸分子、与编码所述片段、变体、活性变体和活性片段的核酸分子杂交的核酸分子，特别地在严格条件下杂交的核酸分子以及用于扩增编码所述片段的核酸分子的核酸分子，例如PCR引物。在这几点上，优选核酸分子是相应于上述优选片段的核酸分子。
本发明还涉及包含本发明的核酸分子的载体、使用本发明的载体进行改造的宿主细胞和通过重组技术产生根据本发明的多肽的。
许多种表达载体可用于表达根据本发明的多肽。通常在这点上，适合用于保持、扩增或表达核酸以在宿主中表达多肽的任何载体可用于表达。根据本发明的该方面，载体可以是例如质粒载体、单链或双链噬菌体载体、单链或双链RNA或DNA病毒载体。本文中公开的起始质粒可商购获得、公开地获得，或可通过使用熟知的公布的常规方法从可获得的质粒构建。在某些方面，其中优选的载体是用于表达根据本发明的核酸分子和多肽的载体。宿主细胞中的核酸构建体可以以常规的方式用于产生由重组序列编码的基因产物。备选地，根据本发明的多肽可通过常规肽合成仪合成产生。成熟的蛋白质可在哺乳动物细胞、酵母、细菌或其他细胞中在适当的启动子控制下表达。无细胞翻译系统也可用于使用从本发明的DNA构建体产生的RNA来产生此类蛋白质。
宿主细胞可进行基因工程改造以整合核酸分子和表达本发明的核酸分子。合适的宿主的代表性实例包括细菌细胞例如链球菌(streptococci)、葡萄球菌(staphylococci)、大肠杆菌(E.coli)、链霉菌属(Streptomyces)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)细胞；真菌细胞，例如酵母细胞和曲霉属(Aspergillus)细胞；昆虫细胞例如果蝇S2和Spodoptera Sf9细胞；动物细胞例如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、293和Bowes黑色素瘤细胞；以及植物细胞。
根据本发明的多肽可以表达为修饰的形式例如融合蛋白的形式，和可以不仅包括分泌信号而且还包括额外的异源功能性区域。因此，例如，额外的氨基酸(特别地带电荷的氨基酸)的区域可添加至多肽的N或C末端以在纯化或随后的操作和贮存过程中提高在宿主细胞中的稳定性和持续性。此外，也可将区域加至多肽以帮助纯化。此类区域可在多肽的最终制备之前除去。将肽部分添加至多肽以造成分泌或外排，以提高稳定性或以帮助纯化等等，是本领域内熟知和常规技术。优选的融合蛋白包含来自免疫球蛋白的用于增溶或纯化多肽的异源区域。例如，EP 0 464 533(加拿大同族2045869)公开了包含免疫球蛋白分子的恒定区的不同部分连同另一种蛋白质或其部分的融合蛋白。在药物发现中，例如，为了进行高通量筛选测定以鉴定拮抗剂，将蛋白质与抗体的Fc部分融合。参见例如(Bennett，D.等人，1995)和(Johanson，K.等人，1995)。融合蛋白还可包括融合或偶联至除了氨基酸外的部分(包括脂质和糖类)的根据本发明的多肽。此外，本发明的抗原可以与由现有技术描述的其他疫苗试剂以及与从其他微生物产生的其他疫苗试剂类别一起使用。此类蛋白质用于预防、治疗和诊断由广谱疏螺旋体属分离株引起的疾病。在另外的实施方案中，将本发明的肽与提供抗标签物质可选择性结合的表位的表位标签融合。通常将表位标签置于肽的氨基或羧基端，但当生物学活性允许时，其也可以以内部插物或置换的方式进行整合。可使用物质例如抗标记的多肽的抗体检测肽的此类表位标记的形式的存在。此外，提供表位标签使得能够通过使用抗标签抗体或其他结合表位标签的亲和基质的亲和纯化来容易地纯化肽。不同的标签多肽和它们各自的抗体在本领域内是熟知的。实例包括多组氨酸(poly-his)、多组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标签、HA标签多肽、c-myc标签、Strep标签和FLAG标签。
根据本发明的多肽可以通过熟知的方法从重组细胞回收和纯化，所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀法、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、羟基磷酸灰石层析和凝集素层析。
根据本发明的多肽可通过化学合成以及通过生物技术方法产生。后者包括使用包含根据本发明的核酸的载体转染或转化宿主细胞，然后在本领域技术人员已知的条件下培养转染或转化的宿主细胞。生产方法还可包括纯化步骤以纯化或分离待制备的多肽。在优选实施方案中，载体是根据本发明的载体。
根据本发明的多肽可用于检测包含这些生物体或蛋白质、超免疫血清反应性抗原或抗原(包括其片段)的样品中的生物体。优选，这样的检测用于诊断，更优选用于诊断疾病，最优选用于诊断与革兰阴性细菌，特别地选自病原性疏螺旋体属物种(包括但不必限于阿氏疏螺旋体、狭义布氏疏螺旋体、嘎氏疏螺旋体、B.lusitaniae和B.valaisiana)，更优选选自狭义布氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体和嘎氏疏螺旋体的细菌的存在或丰度相关或关联的疾病。
根据本发明的核酸用还可用于诊断或检测样品中的生物体，其中所述生物体优选是分别与根据本发明的多肽和根据本发明的抗体的用途一起公开的生物体相同的生物体。在本公开内容的教导下，分别设计和实施此类诊断和检测测定以及方法基本上在本领域技术人员的能力之内。更优选此类诊断或检测使用引物或探针以与根据本发明的核酸分子特异性相互作用。此类引物和探针的长度和设计分别视实施的具体方法或诊断的变化而变化。在优选实施方案中，使用引物进行例如基于PCR的检测或诊断系统，即方法或测定，引物的长度将在大约10至大约30个核苷酸和更优选大约16至25个核苷酸的范围内变化。在基于探针的检测或诊断的情况下，探针的长度优选为大约与对于基于引物的系统所指定的相同。此外，在基于探针的系统的情况下，探针将包含允许其直接或间接检测的部分。用于直接检测的该部分可以是对于本领域技术人员来说是已知的放射性标记或荧光标记。用于间接检测的该部分可以是生物素或介导与另外的化合物相互作用(所述化合物从而可被标记，从而允许其检测)的任何其他部分。
本发明还涉及用于检测根据本发明的多肽，更优选本发明的超免疫血清反应性抗原和其片段在细胞和组织中的水平(包括确定正常和异常水平)的诊断测定法，例如定量和诊断测定法。因此，例如，用于检测与正常对照组织样品相比根据本发明的多肽的过度表达的、根据本发明的诊断测定法可用于检测感染的存在，例如，和鉴定感染性生物体。可用于确定此类多肽在来源于宿主的样品中的水平的测定技术对于本领域技术人员来说是熟知的。此类测定方法包括放射免疫测定法、竞争结合测定法、Western印迹分析和ELISA测定法。在这些方法中，ELISA和Western印迹分析通常是优选的。ELISA测定法一开始包括制备对于根据本发明的多肽的一种是特异性的抗体，优选单克隆抗体。此外，通常制备结合所述单克隆抗体的报告抗体。将报告抗体附着至可检测的试剂例如放射性试剂、荧光试剂或酶试剂，例如辣根过氧化物酶。可将一种或多种根据本发明的多肽，更优选根据本发明的超免疫血清反应性抗原和其片段固定在ELISA板上以用于待检测的患者或受试者的血清中的反应性抗体的检测。
Western印迹测定法最初单独地或与SDS聚丙烯酰胺电泳一起分离根据本发明的多肽，然后将所述多肽转移至并且固定在固体支持基质例如硝酸纤维素、尼龙或其组合上。与报告抗体一起，可检测反应性抗体。将报告抗体附着至可检测的试剂，例如放射性试剂、荧光试剂或酶试剂，例如辣根过氧化物酶。
本文中描述的根据本发明的多肽或根据本发明的核酸分子或针对其的引物或探针还可用于阵列的目的或与其结合。在根据本发明的核酸分子和针对其的引物和探针的情况下，探针和引物的长度也可以优选在大约25至大约75个核苷酸，更优选大约35至大约50个核苷酸的范围内。更特别地，可将根据本发明的多肽的至少一个多肽固定在支持物上。所述支持物通常包含多种根据本发明的多肽和/或超免疫血清反应性抗原其片段，其中可通过使用一种或几种根据本发明的超免疫血清反应性抗原和其片段和/或为不同的超免疫血清反应性抗原和其片段来产生多样性。表征此类阵列以及任何阵列的特征通常是这样的事实，即在所述支持物或其表面上的不同的或预先确定的区域或位置上，固定不同的多肽。因此，阵列的不同位置或区域上的任何活性可与特定的多肽相关。固定在支持物上的不同多肽，更优选不同超免疫血清反应性抗原和其片段的数目可分别在少至10种至数千种不同多肽和超免疫血清反应性抗原以及其片段的范围内变化。每cm2所述分子的密度在优选实施方案中少至每cm210个至每cm2至少400个不同的此类多肽，更特别地每cm2至少1,000个不同的此类多肽，更优选不同的超免疫血清反应性抗原和其片段。本文中所述关于根据本发明的多肽的固定和它们的用途的内容也可分别用于与针对其的核酸分子和引物以及探针，这将被本领域技术人员将承认。
此类阵列的制备对于本领域技术人员来说是熟知的和例如描述于美国专利5,744,309。阵列优选包括平面的、多孔的或无孔的具有至少第一表面的固体支持物。根据本发明的多肽固定在所述表面上。优选支持材料，除其他以外，是玻璃或纤维素。也在本发明的范围内的是，阵列用于本文中描述的任何诊断应用。除了根据本发明的多肽外，根据本发明的核酸分子也可用于产生上述阵列，所述阵列原则上可用于此处公开的对于包含多肽的阵列的任何目的。这同样可用于由本文中描述的抗体，优选单克隆抗体等等制备的阵列。
在另外的方面，本发明涉及针对任何根据本发明的多肽、根据本发明的其衍生物、片段、变体、活性片段和活性变体的抗体。本发明包括例如单克隆和多克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体和人源化抗体以及Fab片段或Fab表达文库的产物。在本发明的范围内的是，抗体可以是嵌合的，即其不同部分来自不同的物种或至少各自的序列获自不同的物种。
一般和特别地针对相应于本发明的序列的超免疫血清反应性抗原和其片段的此类抗体可通过将根据本发明的多肽直接注射入动物或通过将所述多肽对动物优选非人动物施用来获得。然后所获得的抗体将结合所述多肽本身。这样，即使序列只编码片段，所述多肽可用于产生结合根据本发明的完整天然多肽的抗体。然后可将此类抗体用于从表达那些超免疫血清反应性抗原和其片段的组织中分离本根据本发明的多肽。本领域技术人员将理解，该方法也可用于所述多肽的片段、变体、活性片段和活性变体。
为了制备单克隆抗体，可使用提供通过连续细胞系培养产生的抗体的本领域内已知的任何技术(如最初在(Kohler，G.等人，1975)中所描述的)。
所述用于产生单链抗体的技术(美国专利4,946,778)可适合在它们的根据本发明的实施方案中产生针对免疫原性超免疫血清反应性抗原和其他片段的单链抗体。同样，转基因小鼠或其他生物例如其他哺乳动物可用于表达针对根据本发明的多肽的人源化抗体。
备选地，噬菌体展示技术或核糖体展示可用于从PCR扩增的来自人的淋巴细胞的v-基因的库集(repertorie)(就具有各自的靶抗原筛选的)或从原始文库(naive library)中选择具有针对根据本发明的多肽的结合活性的抗体基因(McCafferty，J.等人，1990；Marks，J.等人，1992)。这些抗体的亲和力还可通过链替换来提高(Clackson，T.等人，1991)。
如果存在两个抗原结合结构域，那么各结构域可针对不同的表位-称为‘双特异性’抗体。
优选修饰抗体或其衍生物以使其在个体中的免疫原性减少。例如，如果个体是人，那么抗体可以最优选被“人源化”，其中杂交瘤产生的抗体的互补决定区已被移植入人单克隆抗体，例如如(Jones，P.等人，1986)或(Tempest，P.等人，1991)中所描述的。
上述抗体可用于通过将抗体附着至固体支持物以通过亲和层析进行分离和/或纯化来分离或鉴定表达根据本发明的多肽的克隆。
因此，除其他以外，针对根据本发明的多肽的抗体可用于抑制和/或治疗感染，具体地细菌感染，特别地由病原性疏螺旋体属物种，优选广义布氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体和嘎氏疏螺旋体引起的感染。
根据本发明的多肽，更特别地超免疫血清反应性抗原和其片段在它们的不同实施方案中包括形成本发明的特定方面的抗原性的、表位性的(epitopically)或免疫性的等同的衍生物。本文中所使用的术语“抗原性的等同的衍生物”包括将被某些抗体(所述抗体，当针对所述多肽产生时，干扰病原体和哺乳动物宿主之间的相互作用)特异性识别的根据本发明的此类多肽或其等同物。本文中使用的术语“免疫性的等同的衍生物”包括当在合适的制剂中用于在脊椎动物中产生抗体时，抗体发挥干扰病原体和哺乳动物宿主之间的相互作用的功能的肽或其等同物。
在它们的不同实施方案中的根据本发明的多肽，更特别地超免疫血清反应性抗原和其片段，例如抗原性的或免疫性的等同的衍生物或其融合蛋白可用作抗原来免疫小鼠或其他动物，例如大鼠或鸡。融合蛋白可为根据本发明的多肽提供稳定性。此类多肽可以例如通过缀合与免疫原性载体蛋白，例如牛血清白蛋白(BSA)或钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet haemocyanin，KLH)结合。备选地，包含多拷贝的根据本发明的多肽，更优选地超免疫血清反应性抗原和其片段或抗原性的或免疫性的等同的超免疫血清反应性抗原或其片段的抗原性肽可具有足够的抗原性来提高免疫原性以避免载体的使用。
根据本发明的核酸分子用于基因免疫的用途将优选使用合适的递送方法例如直接注射质粒DNA至肌肉、递送与特定蛋白质载体复合DNA的、用磷酸钙共沉淀DNA、将DNA封装在各种形式的脂质体中、粒子轰击(Tang，D.等人，1992)，(Eisenbraun，M.等人，1993)和使用克隆的逆转录病毒载体的体内感染(Seeger，C.等人，1984)。
在另外的方面，本发明涉及与任何根据本发明的多肽结合的肽，以及用于制备此类肽的方法，其中所述方法的特征在于所述多肽和基本步骤的用途对于本领域技术人员来说是已知的。
此类肽可通过使用根据现有技术的方法，例如噬菌体展示或核糖体展示来产生。在噬菌体展示的情况下，基本上以噬菌体的形式产生肽文库，然后将该类型的文库与靶分子接触，在本案中靶分子是根据本发明的多肽。然后从各自的反应物中取出(优选以与靶分子的复合物形式)此类结合靶分子的肽。本领域技术人员已知，结合特征至少在某种程度上，取决于具体实现的实验设定，例如盐浓度等。在将以更高的亲和力或更大的力结合靶分子的此类肽与文库的非结合成员分离后，和任选地也在从靶分子和肽的复合物中除去靶分子后，随后可表征各肽。在表征之前，任选地例如通过扩增编码肽的噬菌体来实现扩增步骤。表征优选包括结合靶的肽的测序。基本上，肽在它们的长度上不受限制，然而优选地具有大约8至20个氨基酸的长度的肽优选地在各自方法中获得。文库的大小可以是大约102至1018，优选108至1015个不同的肽，然而，不限于此。在优选实施方案中，此类肽是高亲和力结合肽。在更优选实施方案中，所述肽是肽适体。
上述结合靶的肽的特定形式是除其他以外描述于德国专利申请DE 197 42 706中的所谓的“抗促成素”。在这个范围内，本发明还涉及特异性结合根据本发明的多肽的肽和其用于本文中描述的任何治疗和诊断应用的用途(优选对于抗体)。
在另外的方面，本发明涉及与任何根据本发明的多肽相互作用的核酸，和用于制备此类功能性核酸的方法，其中所述方法的特征在于根据本发明的多肽和基本步骤的用途对于本领域技术人员来说是已知的。功能性核酸优选是适体和镜像异构体。在这个范围内，本发明还涉及特异性结合根据本发明的多肽的适体和镜像异构体，和其用于本文中描述的任何治疗和诊断应用的用途(优选对于抗体)。
适体是D核酸，其是单链或双链且特异性与靶分子相互作用。适体的制备或选择描述于例如欧洲专利EP 0 533 838。基本上实现下列步骤。首先，提供核酸即潜在的适体的混合物，其中各核酸通常包含几个，优选至少八个连续的随机核苷酸的片段。然后将该混合物与靶分子接触，其中核酸，例如基于与候选混合物相比，增加的对靶的亲和力或具有更大的对其的力，结合该靶分子。随后将结合核酸与混合物中其他物质分离。任选地，使用例如聚合酶链式反应扩增所获得的核酸。可重复这些步骤数次，从而在结束时产生具有增加的比例的特异性结合靶的核酸的混合物，其中随后任选地从该靶选择最终的结合核酸。这些特异性结合核酸称为适体。很明显，在用于产生或鉴定适体的方法的任何阶段，可采集个体核酸的混合物的样品以通过使用标准技术来确定其序列。在本发明的范围内的是，可以例如通过导入产生适体的领域内技术人员已知的确定的化学基团来稳定适体。此类修饰可以例如存在于在核苷酸的糖部分的2′-位置上导入氨基。适体目前用作治疗剂。然而，也在本发明的范围内的是，所选择或产生的适体可用于靶标确认和/或作为用于开发药剂，优选基于小分子的药剂的前导物质。这事实上可通过竞争测定法来进行，在所述竞争测定法中，靶分子和适体之间的特异性相互作用被候选药物抑制，由此基于适体从靶和适体的复合物中的取代，可推测各药物候选物允许靶和适体之间的相互作用的特异性抑制，并且如果相互作用是特异性的，所述候选药物将，至少在原理上，适合用于阻断靶，从而减少其在包含此类靶的各系统中的生物利用度或活性。然后将所获得的小分子经历进一步的衍生化和修饰，从而最优化其物理、化学、生物学和/或医学特征例如毒性、特异性、生物可降解性和生物利用度。
镜像异构体和它们的产生或制备基于相似的原理。镜像异构体的制备描述于国际专利申请WO 98/08856。镜像异构体是L氨基酸，其表示它们由L核苷酸组成而非如适体那样由D核苷酸组成。镜像异构体的特征在于事实，即它们在生物系统中具有非常高的稳定性和可与适体相比的，特异性与它们所针对的靶分子相互作用。在产生镜像异构体的方法中，产生不均一的D核酸群体，将该群体与靶分子的旋光对映体(在本案中例如与根据本发明的超免疫血清反应性抗原和其片段的天然的L对映体的D对映体)接触。随后，分离不与靶分子的旋光对映体相互作用的那些D核酸。但与靶分子的旋光对映体相互作用的那些D核酸也进行分离，任选地进行鉴定和/或测序，然后基于从D核酸获得的核酸序列信息合成相应的L核酸。在序列上与上述与靶分子的旋光对映体相互作用的D核酸相同的这些L核酸将特异性地与天然的靶分子而非与其旋光对映体相互作用。与用于产生适体的方法相似，也可能重复各种步骤数次，从而富集特异性地与靶分子的旋光对映体相互作用的那些核酸。
在另外的方面，本发明涉及与任何根据本发明的核酸分子相互作用的功能性核酸以及用于制备此类功能性核酸的方法，其中所述方法的特征在于根据本发明的核酸分子和它们各自的序列和基本步骤的用途对于本领域技术人员来说是已知的。功能性核酸优选为核酶、反义寡核苷酸和siRNA。在这个范围内，本发明还涉及特异性结合根据本发明的多肽的该类型的功能性核酸和其用于本文中描述的任何治疗和诊断应用的用途(优选对于抗体)。
核酶是优选由RNA组成的的催化活性核酸，其基本上包括两个部分。第一部分显示催化活性而第二部分负责与靶核酸(在本案中是编码根据本发明的多肽的核酸)特异性相互作用。一旦靶核酸和核酶的第二部分之间的相互作用(所述相互作用通常通过杂交和两个杂交链上的大体上互补的碱基序列片段的Watson-Crick碱基配对产生)，催化活性部分可变得有活性，这意味着，其在分子内或分子间催化靶核酸，如果核酶的催化活性是磷酸二酯酶活性。然后，可存在靶核酸的进一步降解，这在最后导致靶核酸以及从所述靶核酸产生的蛋白质的降解。核酶、它们的用途和设计原理对于本领域技术人员来说是已知的，且例如描述于(Doherty，E.等人，2001)和(Lewin，A.等人，2001)。
用于制备药剂和作为诊断剂的反义寡核苷酸的活性和设计分别基于相似的作用模式。基本上，反义寡机核苷酸基于碱基互补而与靶RNA，优选与mRNA杂交，从而激活RNA酶H。RNA酶H被磷酸二酯和磷硫酰偶联的DNA激活。然而磷酸二酯偶联的DNA被细胞核酸酶快速降解，而磷硫酰偶联的DNA例外。这些具有抗性的、非天然的DNA衍生物在与RNA杂交时不抑制RNA酶H。换句话说，反义多核苷酸只有作为DNA RNA杂种复合物才有效。关于该类型的反义寡核苷酸的实例，除其他以外，描述于美国专利US 5,849,902和US 5,989,912。换句话说，基于在本案中为根据本发明的超免疫血清反应性抗原和其片段的核酸序列和其片段的核酸分子的靶分子的核酸序列(所述序列来自各核酸序列可原则上从其推导的靶蛋白或通过同样地知道的核酸序列，特别是mRNA)，可基于碱基互补性的原理设计适合的反义寡核苷酸。
特别优选的是具有磷硫酰DNA的短片段(3至9个碱基)的反义寡核苷酸。最少3个DNA碱基是细菌RNA酶H的激活所必需的，最少5个碱基是哺乳动物RNA酶H激活所必需的。在这些嵌合寡核苷酸中，存在形成RNA酶H的底物、侧翼连接由不形成RNA酶H的底物的修饰的核苷酸组成的杂交“臂”的中心区域。嵌合寡核苷酸的杂交臂可以例如通过2′-O-甲基或2′-氟来修饰。备选的方法在所述臂中使用甲基膦酸酯或氨基磷酸酯键。用于本发明的实施的反义寡核苷酸的另外的实施例是P-甲氧基寡核苷酸、部分P-甲氧基寡氧核糖核苷酸或P-甲氧基寡核苷酸。
对于本发明特别相关和有用的是上述两个美国专利中更详细描述的那些反义寡核苷酸。此类寡核苷酸不包含天然的5′至3′连接的核苷酸。相反，所述寡核苷酸具有两种类型的核苷酸：激活RNA酶H的2′-脱氧磷硫酰和不激活RNA酶H的2′-修饰的核苷酸。2′-修饰的核苷酸之间的键可以是磷酸二酯键、磷硫酰键或P-乙氧基磷酸二酯键。RNA酶H的激活通过连续的RNA酶H激活区来完成，所述区域包含3至5个2′-脱氧磷硫酰核苷酸以激活细菌RNA酶H和5至10个2’-脱氧磷硫酰核苷酸以激活真核生物，特别地哺乳动物RNA酶H。免受降解的保护作用通过使产生5′和3′末端碱基高度核酸酶抗性和任选地通过设置3′末端封闭基团来完成。
更特别地，反义寡核苷酸包含5′末端和3′末端；和独立地选自2′-修饰的磷酸二酯核苷酸和2′-修饰的P-烷氧基磷酸三酯核苷酸的从位点11至59的5′至3’连接的核苷酸；以及其中将5′-末端核苷附着至3至10个连续磷硫酰连接的脱氧核糖核苷酸的RNA酶H激活区，和其中所述寡核苷酸的3′-端选自反向脱氧核糖核苷酸、1至3个磷硫酰2′-修饰的核糖核苷酸的连续片段、生物素基团和P-烷氧基磷酸三酯核苷酸。
也可使用反义寡核苷酸，其中如上所述，将3′末端核苷而非5′末端核苷附着至RNA酶H激活区。同样，还从特定的基团选择所述寡核苷酸的5′末端而非3′末端。
在它们的不同的实施方案中，根据本发明的核酸和多肽可用作或用于制备药物组合物，特别地疫苗。优选此类药物组合物，优选疫苗，用于预防或治疗由疏螺旋体属物种优选病原性疏螺旋体基因型群，更优选狭义布氏疏螺旋体，阿氏疏螺旋体和嘎氏疏螺旋体引起的疾病或与其相关或关联的疾病。在这个范围内，本发明的另一个方面涉及用于在个体，特别地哺乳动物中诱导免疫反应的方法，所述方法包括用足以产生抗体从而保护所述个体免受由上述微生物引起的感染的、在它们的不同实施方案中的根据本发明的肽或其片段、或变体接种个体。
本发明的另一个方面涉及在个体中诱导免疫反应的方法，该方法包括，通过基因疗法或其他方法，递送根据本发明的核酸分子，优选在它们的不同实施方案中的、功能性编码超免疫血清反应性抗原和其片段的核酸分子，用于在体内表达根据本发明的多肽，以诱导免疫反应，从而产生抗体或细胞介导的T细胞反应(产生细胞因子的T细胞或细胞毒性T细胞)以保护所述个体免受疾病的侵害，无论该疾病是否已在个体内确立。施用基因的一个方法是通过将其作为颗粒上的包衣或其他形式加速进入目的细胞。
本发明的另外的方面涉及免疫组合物，所述免疫组合物当被导入能够在其内诱导免疫反应的宿主时，在该宿主内诱导免疫反应，其中所述组合物包含编码和表达至少一种在它们的不同实施方案中的根据本发明的多肽的重组DNA。免疫反应可进行治疗性或预防性使用，其可采取抗体免疫或细胞免疫例如由CTL或CD4+T细胞产生的细胞免疫的形式。
在它们的不同实施方案中，根据本发明的多肽可以与辅蛋白融合，所述辅蛋白本身不产生抗体但能够稳定第一蛋白质和产生具有免疫原性和保护性特性的融合蛋白。该融合重组蛋白优选还包括抗原性辅蛋白，例如谷光甘肽-S-转移酶(GST)或β-半乳糖苷酶，增溶蛋白质和促进其产生和纯化的相对较大的辅蛋白。此外，辅蛋白在提供免疫系统的广泛刺激的意义上可用作佐剂。可将辅蛋白附着至第一蛋白质的氨基或羧基末端。
本发明还提供了方法，所述方法在本文中描述的任何疏螺旋体属物种(最优选狭义布氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体和嘎氏疏螺旋体)引起的感染的动物模型中，在此类基因免疫实验中使用在它们的不同实施方案中的根据本发明的核酸分子。这些分子特别适用于鉴定能够引起预防性或治疗性免疫反应的蛋白表位。该方法可允许随后从成功地抵抗或清除感染的动物的需要的器官中制备特定值的单克隆抗体，以用于开发本文中描述的疏螺旋体属物种(最优选狭义布氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体和嘎氏疏螺旋体)在哺乳动物具体地人中引起的感染的预防药剂或治疗性处理。
在它们的不同实施方案中的、根据本发明的多肽可用作用于接种宿主的抗原来产生特异性抗体，所述抗体例如通过阻止细菌对损伤的组织的附着来保护免受细菌的入侵。组织损伤和因此损伤的组织的实例包括例如通过病毒感染(特别地呼吸器官的，例如流感)、机械、化学或热损伤引起的或通过内置装置的植入引起的皮肤或结缔组织以及粘膜组织中的伤口，或粘膜中的伤口，例如口、乳腺、尿道或阴道粘膜中的伤口。
本发明还包括疫苗制剂，所述疫苗制剂包含与合适的载体一起的一种或几种在它们的不同实施方案中的根据本发明的多肽。因为所述根据本发明的多肽在胃中被分解，因此它们优选通过胃肠外途施用，包括例如为皮下、肌内、静脉内、皮内、鼻内或经皮途径的施用。适合用于胃肠外施用的制剂包括水性和非水性无菌注射液，其可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与个体的体液(优选血液)等渗的溶质；和水性和非水性无菌混悬剂，其可包括悬浮剂或增稠剂。制剂可以以单位剂量或多剂量容器例如密闭的安瓿和小瓶提供，和可以以冷冻干燥的条件下贮存，在即将使用前只需要加入无菌液体载体即可。疫苗制剂还可包含用于增强制剂的免疫原性的佐剂系统，例如水包油系统和本领域内已知的其他系统。剂量将取决于疫苗的特异性活性且可通过常规实验容易地确定。
根据另一个方面，本发明涉及用于本文中描述的各种疏螺旋体属物种和最优选广义布氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体和嘎氏疏螺旋体的药物组合物，所述药物组合物包含一种或多种在它们的不同实施方案中的根据本发明的多肽。此类药物组合物可包含一种，优选至少两种或更多种针对所述疏螺旋体属物种的所述多肽。任选地，此类多肽还可以与针对另外的病原体的抗原一起组合在组合药物组合物中。优选，所述药物组合物是用于预防或治疗由疏螺旋体属物种，更优选病原性疏螺旋体属物种例如狭义布氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体和嘎氏疏螺旋体和/或其他病原体(针对所述病原体的抗原包括在所述疫苗中)引起的感染。
根据另外的方面，本发明涉及包含根据本发明的核酸分子的药物组合物。此类药物组合物可包含一种或多种编码根据本发明的多肽的根据本发明的核酸分子。任选地，将编码根据本发明的多肽的此类核酸分子与编码针对其他病原体的抗原的核酸分子一起组合在组合药物组合物中。优选，所述药物组合物是用于预防或治疗由疏螺旋体属物种，更优选本文中公开的病原性疏螺旋体属物种，更优选包括狭义布氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体和嘎氏疏螺旋体和/或其他病原体(针对所述病原体的抗原已包括在所述疫苗中)引起的感染。
药物组合物可以包含任何合适的辅助物质，例如缓冲物质、稳定剂或其他活性成分，特别地已知与药物组合物和/或疫苗生产相关的成分。
对于在它们的不同实施方案中的、根据本发明的多肽或根据本发明的核酸分子，优选的载体和/或赋形剂是用于进一步刺激对根据本发明的多肽或其编码核酸分子的免疫反应的免疫刺激性化合物。优选，根据本发明的药物制剂中的免疫刺激性化合物选自聚阳离子物质，特别地肽，免疫刺激性核酸分子，优选免疫刺激性脱氧核苷酸，明矾，弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂，神经活性化合物，特别地人生长激素或其组合。
也在本发明的范围内的是，药物组合物，特别地疫苗，除了包含一种或几种在它们不同的实施方案中的根据本发明的多肽和/或也根据本发明的编码其的核酸分子外，还包含在生物学或药学上具有活性的其他化合物。优选，疫苗组合物包含至少一种聚阳离子肽。根据本发明使用的聚阳离子化合物可以是显示根据WO 97/30721的特征效应的任何聚阳离子化合物。优选的聚阳离子化合物选自碱性多肽、有机聚阳离子、碱性聚氨基酸或其混合物。这些聚氨基酸应当具有至少4个氨基酸残基的链长度(WO 97/30721)。特别优选的是物质如多聚赖氨酸、多聚精氨酸和在超过8个，特别地超过20个氨基酸残基的范围内包含超过20％，特别超过50％的碱性氨基酸的多肽或其混合物。其他优选聚阳离子和它们的药物组合物描述于WO 97/30721(例如聚乙烯亚胺)和WO 99/38528。优选这些聚肽包含20至500个氨基酸残基，特别地30至200个残基。
这些聚阳离子化合物可通过化学或重组产生或可从天然来源产生。
阳离子(多)肽还可以是具有(Ganz，T.，1999)中综述的特性的抗微生物剂。这些(多)肽可以是原核生物或动物或植物来源或者可通过化学或重组产生(WO 02/13857)。肽也可属于防御素类型(WO02/13857)。此类肽的序列可以例如见于下列国际互联网址：http://www.bbcm.univ.trieste.it/～tossi/pag2.html下的抗微生物序列数据库。
此类宿主防御肽或防御素也是根据本发明的聚阳离子聚合物的优选形式。通常，允许作为适应性免疫系统(优选由APC(包括树突状细胞)介导的)的终产物激活(或下调)的化合物用作聚阳离子聚合物。
对于在本发明中用作聚阳离子物质特别优选的是的导管素(cathelicidin)衍生的抗微生物肽或其衍生物(国际专利申请WO02/13857，通过引用合并入本文)，特别地从哺乳动物优选从人、牛或小鼠的导管素衍生的抗微生物肽。
从天然来源产生的聚阳离子化合物包括HIV-REV或HIV-TAT(衍生的阳离子肽、触角足肽(antennapedia peptide)、壳聚糖)或壳多糖的其他衍生物)或通过生化或重组生产从这些肽或蛋白质衍生的其他肽。其他优选聚阳离子化合物是抗微生物肽前体或相关的或从其衍生的物质。例如，小鼠抗微生物肽前体是具有氨基酸序列NH2-RLAGLLRKGGEKIGEKLKKIGOKIKNFFQKLVPQPE-COOH的肽。相关的或衍生的抗微生物肽前体物质包含完整的抗微生物肽前体或具有至少15至20个氨基酸残基的抗微生物肽前体的部分：衍生化可包括由不在20个标准氨基酸中的氨基酸对天然氨基酸的置换或修饰。此外，可将另外的阳离子残基导入此类抗微生物肽前体分子。优选将这些抗微生物肽前体分子与抗原组合。这些抗微生物肽前体令人惊讶地也与用于抗原的佐剂一样有效而无需加入另外的佐剂。因此可能在其他免疫激活物质存在或不存在的情况下，在疫苗中使用此类抗微生物肽前体分子作为有效佐剂。
根据本发明使用的另一种优选聚阳离子物质是包含通过3至7个疏水氨基酸的连接体分隔的2个KLK基序的合成肽(国际专利申请WO02/32451，通过引用合并入本文)。
本发明的药物组合物还可包括免疫刺激性核酸。免疫刺激性核酸是例如包含天然或人造CpG的核酸、从无脊椎动物衍生的核酸的短片段或是在某些碱基背景中包含非甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)的短寡核苷酸(ODN)的形式(例如描述于WO 96/02555)。备选地，例如描述于WO 01/93903中的基于肌苷和胞嘧啶核苷的核酸或包含脱氧肌苷和/或脱氧尿苷残基的脱氧核酸(描述于WO 01/93905和WO02/095027，通过引用合并入本文)也可优选用作与本发明相关的免疫刺激性核酸。优选，可根据本发明使用不同的免疫刺激性核酸的混合物。
也在本发明的范围内的是，将任何上述聚阳离子化合物与任何上述免疫刺激性核酸组合。优选，这些组合根据WO 01/93905、WOO2/32451、WO 01/54720、WO 01/93903、WO 02/13857和WO 02/095027以及WO 03/047602(通过引用全并入本文)中描述的组合。
此外或备选地，此类疫苗组合物，除了根据本发明的多肽和根据本发明的核酸分子外，优选还包括根据本发明的编码核酸分子、神经活性化合物。优选，神经活性化合物是人生长因子(例如WO 01/24822中所描述的)。也是优选地，将神经活性化合物与任何上述聚阳离子化合物和/或免疫刺激性核酸组合。
此外，根据本发明的药物组合物是包含至少任何下列化合物或其组合的药物化合物：根据本发明的核酸分子、在它们的不同实施方案中的根据本发明的多肽、根据本发明的载体、根据本发明的细胞、根据本发明的抗体、根据本发明的功能性核酸和分别根据本发明的结合肽例如抗促成素和高亲和力结合肽以及肽适体、优选如本文中所述筛选的根据本发明的任何激动剂和拮抗剂。任何这些化合物和与细胞、组织或生物体一起使用的非灭菌或灭菌载体例如适合用于对受试者施用的药物载体混合在一起使用。此类组合物包括，例如，媒介添加剂(media additive)或治疗有效量的本发明的超免疫血清反应性抗原和其片段和药学上可接受的载体或赋形剂。此类载体可包括但不限于盐溶液、缓冲盐溶液、葡萄糖、水、甘油、乙醇和其组合。制剂应当适合施用模式。
本发明的药物组合物可以以任何有效的、方便的方式施用，包括例如，通过局部、口服、肛门、阴道、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内、气管内或皮内等等途径的施用。
治疗中或作为预防剂，可以以可注射的组合物例如作为无菌水混悬剂(优选等渗的)将本发明的药物组合物的活性剂对个体施用。
备选地，组合物，优选药物组合物可经配制用于局部应用，例如以软膏、乳膏、洗剂、眼膏、滴眼液、滴耳液、漱口剂、浸透敷料(impregnated dressings)和缝线和气溶剂的形式使用，并且可在软膏和乳膏中包含适当的常规添加剂，其包括例如，防腐剂、帮助药物渗透的溶剂和软化剂。此类局部制剂还可包含相容性常规载体，例如乳膏或软膏基质，以及用于洗剂的乙醇或油醇。此类载体可按重量计算组成制剂的大约1％至大约98％；更常见地它们将按重量计算组成达到制剂的大约80％。
除了上述疗法外，本发明的组合物通常可以用作伤口处理剂以阻止细菌对伤口组织中暴露的基质蛋白的附着和作为对抗生素预防的备选或与抗生素预防一起预防性地用于在牙科处理。
在优选实施方案中，药物组合物是疫苗组合物。优选，此类疫苗组合物是常规的可注射形式。常规佐剂可用于增强免疫反应。对于成人用于使用蛋白质抗原的接种的合适的单位剂量在0.02-3μg抗原/千克体重之间以及对于儿童在0.2-10μg抗原/每千克体重之间，这样的剂量优选施用1至3次，间隔2至24周。
对于指定的剂量范围，对于本发明的化合物预期没有不利的毒理学效应，所述不利的毒理学效应将妨碍对它们对合适的个体的施用。
在另外的实施方案中，本发明涉及包括一个或多个装有一种或多种本发明的上述组合物的成分的容器的诊断和药物包以及试剂盒。成分可以以有用量、剂量、制剂或组合物的形式提供。与此类容器相随的可以是以由管理药物或生物学产品的生产、使用或销售的政府机构规定的形式存在的注意事项，其反映了被用于人施用的产品的生产、使用或销售的机构的许可。
根据本发明，与本文中公开的用途例如药物组合物或疫苗的用途相关的任何疾病特别地是由疏螺旋体属，更优选任何病原性疏螺旋体属物种，更优选选自狭义布氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体或嘎氏疏螺旋体的任何疏螺旋体属物种引起的，与之相联系的或与之相关的疾病或病状。连同要指出的是，包括广义布氏疏螺旋体的各种疏螺旋体属物种包括几个基因型群和株系，其中包括本文中公开的基因型群和株系。有待根据本发明预防和/或治疗的与细菌感染相关、由其引起或与其关联的疾病包括莱姆疏螺旋体病(莱姆病)。其他方面，莱姆疏螺旋体病的症状、分期和亚群以及遭受如本文，包括导言部分中公开的疾病的患者的特定组群，通过引用合并入本文。更具体而言，莱姆疏螺旋体病通常分期发生，在每一期对于不同的临床表现都存在减轻和恶化(Steere，1989)。早期感染1期由皮肤的局部感染组成，在数天或数周内发展为第2期，播散感染，和在数月至数年后发展为3期，持续感染。然而，感染是可变的；一些患者只具有皮肤的局部感染，而其他患者只展示疾病的更后期表现，例如关节炎。莱姆疏螺旋体病的不同临床综合征还由不同的广义布氏疏螺旋体物种引起的感染引起。狭义布氏疏螺旋体更常见地引起关节表现(关节炎)和心脏问题，阿氏疏螺旋体主要引起皮肤症状(EM和ACA)，以及嘎氏疏螺旋体是产生神经疏螺旋体病的主要原因。
局部感染-感染的1期的最常见症状是发生在70-80％的被感染的人中的游走性红斑。该皮肤病损通常伴随流行性感冒样症状，例如肌痛、关节痛、头痛和发烧。这些非特异性症状发生在50％的患有游走性红斑的患者中。
播散感染-在2期中，细菌从感染的部位迁移入血流中和迁移至更远的组织和器官。发生在该期的神经学、心血管和关节炎症状包括脑膜炎、颅神经病(cranial neuropathy)和间歇性炎性关节炎。
持续感染-感染的3期是慢性的，在蜱叮咬后数月至数年发生。北美最常见的病症是由狭义布氏疏螺旋体的感染引起的类风湿性关节炎。嘎氏疏螺旋体对中枢神经系统的持续感染在3期引起更严重的神经学症状，阿氏疏螺旋体对皮肤的持续感染导致慢性萎缩性肢皮炎。
在本发明的范围内的是，本文中公开的直接或间接与生物体例如任何动物或人和疏螺旋体属物种，更优选病原性疏螺旋体属物种，最优选狭义布氏疏螺旋体、嘎氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体、Borreliaandersonii、Borrelia bissettii、Borrelia valaisiana、Borrelialusitaniae、Borrelia spielmani、Borrelia japonica、Borreliatanukii、Borrelia turdae和Borrelia sinica的接触相关或由此产生的每一种和任何症状、疾病、病症或综合征在本发明的意义上是分别的和独立的适应症、疾病或病症。因此并正好通过举例说明，本申请的意义上的疾病是莱姆疏螺旋体病以及游走性红斑、神经型疏螺旋体症和莱姆关节炎。
在本发明范围内的是，可对其使用本文中公开的各种化合物的疾病也是其中表达根据本发明的多肽的疾病或其中本文中描述的化合物例如根据本发明的多肽、疫苗、抗体和任何适体和镜像异构体分别适合用于其治疗和/或诊断的任何疾病。此类潜在的用途可分别产生于交叉反应性和同源性。本领域技术人员理解，所述与根据本发明的药物组合物相关的任何疾病可接受本文中描述的药剂的使用，反之亦然。
在另外的实施方案中，本发明涉及使用根据本发明的任何多肽或根据本发明的任何核酸的筛选方法。这样的筛选方法对于本领域技术人员来说是已知的，其可经设计使得能够筛选出激动剂或拮抗剂。根据此类筛选方法，优选筛选出在本案中抑制或阻止任何根据本发明的超免疫血清反应性抗原或其片段与相互作用伴侣结合的拮抗剂。此类相互作用伴侣可以是天然的相互作用伴侣或非天然的相互作用伴侣。
本发明还提供了用于筛选化合物以鉴定增强(激动剂)或阻止(拮抗剂)根据本发明的多肽或根据本发明的核酸分子的功能的方法，所述功能例如其与结合分子相互作用。筛选方法可涉及高通量。
例如，为了筛选激动剂或拮抗剂，根据本发明的核酸分子和核酸的相互作用伴侣分别可能是合成的反应混合物，细胞区室，例如膜、细胞外被膜(cell envelope)或细胞壁、或任何其的制备物，其从表达与根据本发明的多肽结合的分子的细胞制备。在可以是激动剂或拮抗剂的候选分子存在或不存在的情况下，将制备物与此类多肽的标记形式一起温育。候选分子与结合分子结合的能力反映在减少的被标记的配体的结合。无理由(gratuitously)结合，即不诱导所述多肽的功能效应的分子最可能是良好的拮抗剂。充分结合且引起与根据本发明的多肽相同或接近的功能效应的分子是良好的激动剂。
潜在的激动剂和拮抗剂的功能效应可以如下进行测量，例如通过在候选分子与细胞或合适的细胞制剂相互作用后确定报告系统的活性，然后将效应与根据本发明的多肽或引起与所述多肽相同的效应的分子的效应相比较。可用于这点上的报告系统包括但不限于转化成产物的比色标记底物、感应根据本发明的多肽的功能活性的改变的报告基因和本领域内已知的结合测定法。
用于拮抗剂的测定法的另一个实例是竞争测定法，所述竞争测定法在对于竞争测定法的适合条件下，将根据本发明的多肽和潜在拮抗剂与膜结合的结合分子、重组结合分子、天然底物或配体、或者底物或配体模拟物组合在一起。根据本发明的多肽可以例如用放射性或比色化合物标记，这样可精确地确定与结合分子结合或转化成产物的根据本发明的多肽的分子数目，从而估计潜在拮抗剂的功效。
潜在拮抗剂包括结合根据本发明的多肽并从而抑制或消除其活性的小有机分子、多肽和抗体。潜在拮抗剂还可以是结合至结合分子上的相同位置而不诱导根据本发明的多肽的功能活性的小有机分子、肽、多肽例如密切相关的蛋白质或抗体。
潜在拮抗剂包括这样的小分子，其结合并占据根据本发明的多肽的结合位置，从而阻止与细胞结合分子的结合，这样正常的生物学功能被阻止。小分子的实例包括但不限于小有机分子、肽或肽样分子。
其他潜在拮抗剂包括反义分子(参见Okano，H.等人，1991；或OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENEEXPRESSION；CRC Press，Boca Raton，FL(1988)，关于此类分子的描述)。
优选的潜在拮抗剂包括本发明的超免疫血清反应性抗原和其片段的衍生物。
如此处所使用的，根据本发明的多肽的活性是其与任何其相互作用伴侣结合的能力或与其任何相互作用伴侣结合的该能力的程度。
在特定的方面，本发明提供了根据本发明的多肽、本发明的超免疫血清反应性抗原和其片段、核酸分子或抑制剂用于干扰造成感染后遗症的病原体与哺乳动物宿主之间的初始物理相互作用的用途。特别地，本发明的分子可用于：i)阻止本文中公开的疏螺旋体属物种，更优选其病原性物种，例如狭义布氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体和嘎氏疏螺旋体至哺乳动物细胞外基质蛋白的附着；ii)阻断哺乳动物细胞外基质蛋白与介导组织反应的细菌蛋白之间的细菌附着；iii)或导致免疫防御的逃脱；iv)在除了由内置装置的植入或由其他外科技术，例如通过抑制营养物的获得外引起的感染中阻断发病的正常进程。
本文中提供的每一种DNA编码序列可用于抗菌化合物的发现、开发和/或制备。表达后，编码的蛋白质可用作用于筛选抗菌药物的靶。此外，编码被编码的蛋白质的氨基末端区域的DNA序列或各mRNA的Shine-Delgarno或其他促进翻译的序列可用于构建反义序列以控制目的编码序列的表达。
拮抗剂和激动剂可以用于例如抑制由疏螺旋体属物种包括狭义布氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体和嘎氏疏螺旋体引起的感染所造成的疾病，例如莱姆疏螺旋体病(莱姆病)。
在另外的方面，本发明涉及亲和装置，此类亲和装置包括至少支持材料和被附着至支持材料的任何根据本发明的多肽。因为所述多肽对于它们的靶细胞或靶分子或它们的相互作用伴侣的特异性，所以所述多肽允许从用于支持材料的任何类型的样品中选择性除去它们的相互作用伴侣，只要满足用于结合的条件。所述样品可以是生物学或医学样品，包括但不限于发酵液、细胞碎片、细胞制备物、组织制备物、器官制备物、血液、尿液、淋巴液、水溶液等。
根据本发明的多肽可以以共价或非共价的方式附着至基质。合适的支持材料对于本领域技术人员来说是已知的且可选自纤维素、二氧化硅、玻璃、铝、磁珠、淀粉和葡聚糖。
本发明还可通过可从其中获得特征、实施方案和有利方面的下列图、表、实施例和序列表来进一步举例说明。要理解，本实施例通过举例说明的方式而不是通过对公开内容的限制的方式给出。
根据本发明
图1显示作为病原体特异性抗体的来源的人血清的表征。
图2显示文库的表征。
图3显示使用生物素化的人IgG通过MACS对细菌细胞的选择。
图4显示确定选择的抗原在各细菌病原体的临床分离株中的基因分布的PCR分析。
图5显示通过使用大肠杆菌裂解物的免疫在小鼠中诱导表位特异性抗体的实例。
图6显示通过Western印迹分析确定的小鼠中的血清转换。
表1显示使用基因组阿氏疏螺旋体文库和人血清进行的所有筛选的概述。
表2显示与狭义布氏疏螺旋体和嘎氏疏螺旋体具有同源性的、从阿氏疏螺旋体鉴定为抗原的所有基因。
表3显示用于基因分布分析的株系。
表4显示就各细菌种类的不同株系中对选择的抗原的数目进行的基因分布分析的概述。
表5显示小鼠免疫原性实验的概述。
表6显示使用人血清进行的肽ELISA的概述。
表7使用小鼠中产生的表位血清进行的FACS分析。
表8在动物中试验的表达的和纯化的蛋白质。
表9细胞的最可能数目(来自Norman，R.L.和Kempe，L.L.，1960)。
表10小鼠中的保护作用。
本说明书中可能参考的图和表在下面进行更详细的描述。
图1显示通过使用免疫测定法测量对于狭义布氏疏螺旋体和阿氏疏螺旋体是特异性的抗体来对人血清进行的表征。(A)使用从狭义布氏疏螺旋体制备的总细菌裂解物，通过标准ELISA测量总IgG抗体水平。在2种不同的血清稀释度上分析来自具有不同症状的莱姆疏螺旋体病患者的血清样品。显示了关于25个血清的代表性实验的结果，所述25个血清包括在具有来自具有莱姆疏螺旋体病的不同症状(游走性红斑(EM)、神经型疏螺旋体症(NB)、莱姆关节炎(LA)和慢性萎缩性肢皮炎(ACA))的人的血清的4个不同的血清库和具有来自具有混合症状(LBI和LBII)的患者的血清的两个库中。数据表示为位于检测的线性范围内的血清稀释度下、在405nm处的吸光率计算的ELISA单位。(B，C)对血清库进行免疫印迹分析以确保使用蛋白质抗原的多个免疫反应性。显示使用从狭义布氏疏螺旋体(B)或从阿氏疏螺旋体(C)制备的总细菌裂解物与以5,000稀释的人血清反应的代表性实验的结果。通过抗人IgG特异性第二试剂检测IgG抗体。-：不使用一抗(血清库)的温育，kDa：分子量标记。
图2(A)显示阿氏疏螺旋体小片段基因组文库K78-LamB的片段大小分布。在对随机选择的克隆测序后，修剪序列(428)以除去载体残基，将具有不同基因组片段大小的克隆的数目作图。(B)显示阿氏疏螺旋体大片段基因组文库K78-FhuA的片段大小分布。在对随机选择的克隆测序后，修剪序列(466)以除去载体残基，将具有不同基因组片段大小的克隆的数目作图。
图3(A)显示用使用来自患有游走性红斑的患者的血清产生的生物素化的人IgG库(EM-IgG)进行的MACS选择。使用10-20μg生物素化的IgG筛选pHIE11中的K78-FhuA文库。作为阴性对照，不向用于筛选的文库细胞加入血清。显示在洗脱后选择的细胞的数目。(B)显示通过细菌表面展示选择的特异性克隆(1-20)和通过免疫印迹分析(使用以1∶3,000的稀释的用于通过MACS进行的选择的人血清IgG库(EM-IgG))分析的Wt(无插入的pHIE11)的反应性。箭头标示检测为阳性的克隆。作为载量对照，也使用以1∶5,000稀释的抗平台蛋白FhuA的抗体分析相同的印迹。(C)显示用使用来自患有莱姆关节炎的患者的血清产生的生物素化的人IgG库(LA-IgG)和PHIE11中的K78-FhuA文库进行的MACS选择。(D)显示通过细菌表面展示选择的特异性克隆(1-20)和通过免疫印迹分析(使用以1∶3,000的稀释的用于通过MACS进行的选择的人血清IgG库(LA-IgG))分析的Wt(无插入的pHIE11)的反应性。箭头标示检测为阳性的克隆。
图4显示使用各寡核苷酸和30个广义布氏疏螺旋体株系对一个基因的基因分布的PCR分析的实例。从来自广义布氏疏螺旋体的抗原BAP004衍生的PCR片段的预测大小是420bp。1-30，表3中显示的株系或临床分离株；-，未加入基因组DNA。
图5显示使用阿氏疏螺旋体衍生的表位进行的，由表达Lamb或FhuA的大肠杆菌克隆的总细菌裂解物诱导的表位特异性小鼠血清IgG抗体水平的测量。该图显示使用三组小鼠血清(每一组5只小鼠的混合物)的代表性肽ELISA实验，所述三组血清分别通过由细菌克隆Baf2(BA0210)、Baf12(BA0149)和Baf36(BA0181)表达的表位产生。血清在2种不同稀释度(200x和1000x)上经检测抗覆盖所述表位的交叠肽。黑色条，200X；白色条，1000X。相应于各个受试表位的生物素标记的合成肽的名称显示在稀释度下面。
图6显示通过Western印迹分析确定的血清转交换。作为通过Western印迹分析确定小鼠的感染状况的实例，显示了来自用PBS缓冲液(PBS)中的疏螺旋体属抗原BbuA0034-1或佐剂免疫的小鼠的血清。将与来自各组的个体小鼠血清(1-10)一起温育的、具有总的疏螺旋体属细胞裂解物的硝酸纤维素膜切成条带。用+(正号)标示血清转换(感染)和用-(负号)标示未感染的。kDa：千道尔顿。
表1：通过细菌表面展示从阿氏疏螺旋体鉴定的免疫原性蛋白。
A：具有包含P1755、P1766、P1772、P1806和P1811血清的LBI-IgG库的fhuA中的阿氏疏螺旋体的300bp文库(358)，B：具有包含P3055、P3144、P3186和P3219血清的EM-IgG库的fhuA中的阿氏疏螺旋体的300bp文库(336)，C：具有包含P3077、P3084、P3286、P3288和P3337血清的NB-IgG库的fhuA中的阿氏疏螺旋体的300bp文库(597)，D：具有包含P3016、P3150、P3301、P3344和P3394血清的LBII-IgG库的fhuA中的阿氏疏螺旋体的300bp文库(634)，E：具有包含P3183、P3209和P3336血清的ACA-IgG库的fhuA中的阿氏疏螺旋体的300bp文库(665)，F：具有包含P3120、P3239和P3251血清的LA-IgG库的fhuA中的阿氏疏螺旋体的300bp文库(616)，G：具有LBI-IgG库的1amB中的阿氏疏螺旋体的50bp文库(412)，H：具有EM-IgG库的1amB中的阿氏疏螺旋体的50bp文库(300)，I：具有NB-IgG库的1amB中的阿氏疏螺旋体的50bp文库(467)，J：具有LBII-IgG库的1amB中的阿氏疏螺旋体的50bp文库(435)，K：具有ACA-IgG库的1amB中的阿氏疏螺旋体的50bp文库(357)，L：具有LA-IgG库的1amB中的阿氏疏螺旋体的50bp文库(349)；*，使用程序ANTIGENIC(Kolaskar，A.等人，1990)进行长于5个氨基酸的抗原性序列的预测。列出的是通过对针对阿氏疏螺旋体、狭义布氏疏螺旋体和嘎氏疏螺旋体的基因组序列的确定的表位序列BLAST而鉴定的来自阿氏疏螺旋体的基因。
表1：
阿氏疏螺旋体 的抗原性蛋白 推定功能(通 过同源性) 预测的免疫原性aa* 选择的克 隆数目 筛选中 的标志 鉴定的免 疫原性区 域(aa) 的定位 Seq ID (DNA，蛋 白)
BA0056 假定的蛋白 质 6-20，25-51，58-83， 94-105，111-122， 127-135，141-155， 162-173，179-186， 188-207，213-226， 230-248，253-265， 269-282，285-291， 367-378，384-393， 401-425，453-464， 471-477，504-514， 519-527，532-555， 557-572，584-598， 609-616，624-630， 638-645，648-653 9 C，D， E，F 128-169， 257-336， 339-379 1，135
BA0060 假定的蛋白 质 23-31，47-53，57-64， 74-89，91-106， 9 I 180-189 2，136
127-132，137-144， 152-157，164-169， 186-192，201-206， 208-217，223-235
BA0062 甲基化-tRNA 转甲酰酶 (fmt) 4-32，43-52，54-66， 78-88，91-122， 124-131，144-150， 153-159，161-178， 183-191，195-201， 205-215，236-252， 258-263，276-284， 288-294，302-312 2 A，C，I 159-213 3，137
BA0072 肽链释放因 子2(prfB) 8-23，30-35，44-54， 65-73，77-83， 89-110，117-129， 132-137，156-165， 169-175，189-199， 225-237 5 B，C， E，F 229-267 4，138
BA0075 预测的编码 区域 5-31，40-50，52-58， 64-72，112-118， 137-142，170-175， 179-185，192-201， 299-305 4 A，B，E 138-187 5，139
BA0078 保守的假定 的蛋白质 11-18，23-47， 113-119，131-137， 143-149，197-203， 215-222，247-256， 264-290，298-303， 311-358，368-401， 403-409 5 A，C 97-177 6，140
BA0087 V-type ATPase，亚 单位K，推定 的 5-20，27-32，34-40， 43-64，66-72，78-85， 91-97，104-110， 118-141 4 L 94-119 7，141
BA0091 V-type ATPase，亚 单位A (atpA) 5-22，25-32，39-45， 51-58，60-104， 106-114，129-155， 160-166，174-182， 195-204，207-213， 223-239，243-250， 257-267，270-276， 3 D 195-228 8，142
279-285，293-302， 304-317，328-335， 360-372，374-382， 386-397，404-418， 429-438，441-447， 450-460，467-472， 480-497，501-507， 515-521，562-572
BA0106 乙酰-CoA C- 乙酰转移酶 (fadA) 4-10，31-42，44-59， 65-72，75-115， 119-127，146-155， 181-188，198-207， 213-219，228-244， 254-264，269-293， 295-310，313-321， 323-336，350-369， 380-389 3 A，E 165-214 9，143
BA0126 核糖体蛋白 S1(rpsA) 11-25，27-45， 66-73，75-85， 104-113，126-135， 143-154，160-166， 178-185，201-215， 231-245，254-261， 266-296，298-306， 308-332，339-344， 360-370，385-391， 412-419，449-457， 461-469，472-478， 495-505，511-518 4 C，E 350-451 10，144
BA0135 青霉素-结合 蛋白(pbp-1) 14-35，64-72， 81-87，90-99， 110-116，137-152， 158-166，171-178， 207-216，225-232， 239-250，264-271， 276-286，316-323， 325-343，350-356， 393-407，416-422， 440-445，448-453， 469-475，497-506， 509-529，537-543， 10 B，C，E 41-107， 528-596 11，145
586-592，603-610
BA0149 鞭毛纤维41 kDa核心蛋白 (flaB) 56-62，83-96， 161-167，170-179， 184-197，205-214， 235-243，285-296， 302-308，324-333 71 A，B， C，D， E，F， G，H， I，K 18-315 12，146
BA0150 鞭毛钩-相关 蛋白2 (flagellar hook-associ ated protein 2(fliD)) 4-11，35-41，57-65， 82-88，99-115， 118-124，126-134， 146-151，159-167， 174-180，187-192， 195-206，216-222， 237-247，261-269， 295-304，327-334， 341-347，363-374， 382-388，398-404， 410-424，430-436， 441-448，451-461， 473-484，493-507， 509-522，528-536， 544-550，566-573， 588-604，608-614 11 A，C，E 22-75， 110-148， 344-404 13，147
BA0152 N-乙酰葡萄 糖胺-6-磷酸 脱乙酰酶 (nagA) 4-14，21-28，32-38， 59-71，84-106， 110-120，127-140， 146-167，184-190， 197-203，223-232， 249-278，280-292， 309-324，342-355， 367-374，377-384 6 E 264-328 14，148
BA0181 鞭毛钩-相关 蛋白(flgK) 13-18，47-55， 65-75，132-138， 140-146，149-155， 157-168，218-227， 241-248，275-281， 283-289，306-315， 329-336，352-360， 372-378，388-394， 396-404，411-416， 424-429，445-455， 479-491，494-500， 6 A，B， C，F 6-65， 68-112， 261-352， 449-507 15，149
571-578，583-588， 600-621
BA0192 假定的蛋白 质 10-34，36-42， 46-55，58-64，79-86， 99-122，125-135， 165-184，200-209， 215-226，232-238 9 J 79-89 16，150
BA0200 D-丙氨酸 --D-丙氨酸 连接酶 (dd1A) 4-34，38-62，64-78， 87-99，101-109， 113-125，128-156， 166-184，186-193， 196-203，205-215， 220-226，236-260， 262-269，271-288， 296-302，325-333， 339-350 3 K 111-138 17，151
BA0210 表面定位膜 蛋白1 (surface-l ocated membrane protein1 (1mp1)) 8-23，25-33，57-68， 102-113，194-199， 236-241，269-296， 326-333，339-348， 352-360，364-369， 378-393，422-430， 434-447，476-484， 488-501，530-538， 542-555，585-592， 596-609，638-646， 650-663，692-699， 706-716，726-745， 765-771，792-798， 809-815，825-835， 862-868，878-885， 893-902，911-922， 927-937，947-953， 962-970，978-985， 1011-1017， 1027-1034， 1045-1052 39 A，B， C，D， E，F 102-177， 285-364， 937-983 18，152
BA0215 磷酸ABC转 运蛋白，外 周质膜结合 蛋白(pstS) 4-20，36-45，62-69， 73-83，95-112， 153-166，178-185， 194-205，215-223， 7 A，C， D，E 80-159 19，153
238-247
BA0221 鞭毛驱动转 换蛋白 (flagellar motor switch protein (fliG-1)) 82-95，107-122， 153-158，165-171， 178-196，202-210， 216-222，270-280， 312-318，336-341， 381-389 11 A，C， D，E 245-299 20，154
BA0235 假定的蛋白 质 4-23，45-57，68-81， 91-104，118-131， 134-144，160-166， 172-189，191-202， 204-217，228-236， 261-268，273-285， 287-294，307-316， 328-343，350-356， 381-418，420-429， 440-452，458-465， 497-504，528-538， 546-556，567-574， 580-601，605-624， 628-639，647-653 5 D，E 126-200 21，155
BA0237 假定的蛋白 质 4-19，24-30，32-48， 53-80，89-97， 102-109，136-142， 145-153，156-164， 177-187，192-209， 215-221，238-243 17 B，D， E，F，K 15-146 22，156
BA0283 鞭毛钩蛋白 (flgE) 5-13，70-79，91-97， 123-129，155-162， 173-189，199-224， 232-238，255-261， 265-283，290-301， 306-311，314-320， 336-344，351-358， 395-409，412-418， 430-439 6 B，C，D 35-109， 187-298 23，157
BA0295 热休克蛋白 (hslU) 13-31，36-47， 80-96，98-107， 144-149，187-193， 215-220，235-251， 291-300，306-326， 6 B，C，D 220-288 24，158
328-338，340-358， 364-380，408-426， 434-441
BA0314 假定的蛋白 质 4-24，36-43，70-81， 89-100，109-120， 127-132，141-158， 165-178，183-191， 193-202，208-215 4 C，D 31-89 25，159
BA0321 假定的蛋白 质 6-25，44-49， 95-105，136-144， 199-215，236-241， 256-262，280-287， 306-320，326-334， 346-354，364-376 7 A，B， D，F 83-172， 272-327 26，160
BA0327 寡肽ABC转 运蛋白，外 周质寡肽结 合蛋白 (oppA-2) 4-21，27-44，85-92， 100-107，112-118， 142-149，161-190， 216-222，231-238， 258-310，317-323， 334-344，352-359， 367-373，380-387， 394-400，429-441， 485-500 40 A，B， C，D， E，F 20-79， 404-526 27，161
BA0329 寡肽ABC转 运蛋白，外 周质寡肽结 合蛋白 (oppA-3) 12-28，38-58， 61-75，98-116， 121-127，133-142， 169-199，213-221， 236-241，243-250， 254-260，269-281， 284-301，313-319， 352-358，362-368， 391-397，436-448， 455-463，485-496， 498-511，523-533 9 C，D，E 40-97， 251-297， 420-488 28，162
BA0343 假定的蛋白 质 8-15，24-41，50-79， 86-91，109-141， 143-156，166-171， 204-212，235-243， 245-267，291-311， 328-336，344-360， 377-388，390-396 3 D 258-336 29，163
BA0345 纤连蛋白/凝 血因子结合 蛋白，推定的 4-15，22-38，46-53， 72-82，99-119， 131-139，148-154， 179-184，187-195， 203-209，212-219， 223-231，242-249， 257-263，269-277， 282-288，310-315， 346-353，371-377， 388-395，400-421， 427-438，445-451 7 H，I，J 458-472 30,164
BA0351 假定的蛋白 质 5-29，37-117， 128-134，138-144， 146-161，172-178， 193-219，221-231， 234-240，242-261， 263-274，297-302， 306-322，339-345， 356-365，371-383， 402-413，416-424， 432-443，447-456， 461-466，471-524， 532-593 7 A，B， C，D 197-284 31，165
BA0356 羧基末端蛋 白酶(ctp) 5-29，54-69，72-88， 99-112，128-138， 150-165，167-174， 181-187，205-226， 246-253，273-279， 285-291，293-311， 313-323，329-334， 338-350，356-363， 366-372，388-394， 397-404，417-423， 437-445，453-473 9 A，B， E，F 378-461 32，166
BA0364 氨肽酶I (yscI) 38-45，67-82， 90-96，101-108， 113-120，128-143， 160-173，190-200， 206-218，226-237， 244-252，256-271， 276-285，298-309， 7 A，B，C 82-127， 212-253 33，167
319-325，332-350， 355-363，379-388， 395-404，412-419， 427-433，442-455
BA0380 碱性膜蛋白B (bmpB) 10-28，37-50， 58-66，72-91， 101-119，124-131， 133-149，152-170， 177-186，198-204， 225-244，249-256， 260-266，269-286， 298-303，306-312， 329-338，342-348 6 B，D 26-73 34，168
BA0388 DNA指导的 RNA聚合酶 (rpoC) 10-18，45-51， 58-87，95-139， 175-182，184-194， 228-237，239-245， 255-261，269-282， 289-295，301-308， 310-319，333-374， 376-383，394-447， 455-464，485-503， 519-526，532-542， 551-557，571-604， 608-614，616-623， 654-660，682-687， 717-724，729-736， 759-775，800-806， 817-823，829-838， 840-864，877-887， 900-906，943-951， 959-978，981-994， 996-1012， 1016-1032， 1035-1046， 1049-1056， 1078-1109， 1117-1124， 1137-1143， 1158-1167， 1179-1199， 5 A，E 1053-108 2 35，169
1201-1207， 1215-1245， 1250-1256， 1262-1268， 1270-1281， 1298-1310， 1314-1323， 1326-1333， 1347-1357， 1364-1372
BA0389 DNA-指导的 RNA聚合酶 (rpoB) 4-9，15-27，29-37， 50-59，65-73， 94-107，138-168， 179-187，191-203， 230-237，254-260， 267-274，279-294， 312-328，355-361， 368-375，378-388， 405-415，441-457， 459-467，469-476， 496-506，508-514， 521-531，538-549， 554-561，566-574， 582-591，604-625， 640-653，657-671， 674-689，698-705， 713-723，746-756， 763-771，777-789， 801-809，822-839， 847-854，865-872， 877-883，889-906， 922-940，943-953， 963-984，1004-1010， 1021-1037， 1045-1057， 1070-1089， 1096-1115， 1117-1123， 1127-1135 6 C，D，E 194-292 36，170
BA0417 预测的编码 区域 10-30，38-51， 74-81，86-96， 5 B，C， E，F 44-99 37，171
116-148，161-167， 202-208，211-217， 239-261，283-295， 298-310，322-328， 335-346
BA0419 感觉换能组 氨酸激酶， 推定的 9-23，31-42，50-60， 68-74，85-92， 98-106，108-117， 135-142，144-150， 155-172，174-191， 193-206，208-215， 223-233，237-245， 252-267，274-296， 308-316，324-341， 375-385，394-402， 419-440，446-452， 493-499，514-520， 537-546，570-579， 582-588，591-603， 609-618，620-628， 640-687，700-706， 714-742，765-774， 794-805，809-825， 827-838，847-857， 860-867，875-888， 897-907，917-926， 937-942，950-971， 975-981，989-999， 1016-1052， 1054-1071， 1089-1105， 1108-1130， 1142-1160， 1166-1178， 1184-1197， 1199-1207， 1216-1222， 1232-1247， 1249-1254， 1262-1283， 1291-1300， 7 B，E，F 1229-127 5 38，172
1308-1332， 1343-1356， 1363-1368， 1384-1398， 1401-1410， 1423-1434， 1443-1464， 1478-1484
BA0429 0期孢子形 成蛋白J (spo0J) 5-15，21-35，42-51， 55-60，73-80，87-94， 103-110，134-146， 157-168，174-188， 190-201，209-223， 250-257 9 C，I，J 儿0-131， 179-236 39，173
BA0431 DNA促旋酶， 亚单位B (gyrB) 10-24，30-48， 52-66，90-100， 111-137，153-162， 166-175，184-190， 193-206，226-232， 238-248，250-260， 267-273，322-333， 349-382，402-413， 421-428，443-451， 470-480，487-498， 508-518，526-539， 544-549，568-574， 607-623，631-636 3 B，C 372-434 40，174
BA0442 天冬氨酰 -tRNA合成 酶(a spS) 20-28，33-38， 45-77，91-110， 124-130，137-162， 164-170，175-183， 185-205，207-217， 235-240，254-269， 291-296，319-326， 342-354，374-381， 397-403，424-434， 442-455，469-484， 494-501，513-522， 529-534，546-556， 558-564 3 C，E 439-464 41，175
BA0464 假定的蛋白 4-13，15-21，24-32， 2 A，E 12-77 42，176
质 40-45，47-65， 75-110，114-123， 133-142，144-159， 164-171，187-215
BA0469 UDP-N-乙酰 葡萄糖胺1- 羧乙烯基转 移酶(murA) 4-9，25-44，49-60， 72-82，87-105， 125-138，142-155， 171-179，183-197， 205-225，232-244， 256-270，278-285， 287-293，310-333， 339-345，350-366， 368-378，381-392， 397-404，408-418 3 D，E 281-316 43，177
BA0475 核糖体蛋白 L4(rplD) 28-35，95-116， 138-146，150-158， 174-203 3 D，E 33-78 44，178
BA0507 假定的蛋白 质 4-23，31-43，58-64， 68-83，93-103， 121-135，143-156， 181-187，227-238， 251-264，292-298， 309-317，326-333， 351-357，359-365， 387-395，400-407， 431-437，451-460， 462-471，496-508， 519-526，534-540， 568-573，608-618， 620-627，650-657， 673-679，690-702， 705-714，728-734， 738-745，758-764， 776-782，795-810， 830-839，882-904， 911-926，938-944， 962-969，975-984， 999-1007， 1019-1025， 1072-1090， 1099-1111， 8 B，C， E，F 718-788 45，179
1172-1178， 1232-1241， 1245-1252， 1257-1266， 1283-1288， 1305-1311， 1370-1377， 1392-1398， 1412-1417， 1422-1434， 1448-1458， 1479-1487， 1529-1534， 1570-1576， 1582-1590， 1615-1622， 1630-1645， 1659-1668， 1700-1708， 1730-1736， 1756-1762， 1765-1776， 1798-1803， 1805-1819， 1831-1837， 1872-1882， 1926-1936， 1946-1952， 1955-1961， 1968-1980， 1995-2002， 2035-2045， 2048-2056， 2076-2083， 2099-2107， 2122-2128， 2146-2156
BA0513 热休克蛋白 70(dnaK-2) 12-19，22-29， 37-43，48-56，79-90， 114-119，136-147， 162-172，174-180， 23 A，C， D，E， F，J，K 66-161， 494-576 46，180
186-194，200-213， 232-238，275-282， 288-297，303-319， 329-338，341-351， 363-371，383-397， 416-423，430-438， 454-472，476-483， 536-542，576-581， 626-632
BA0514 GrpE 蛋白 (grpE) 29-35，48-56， 82-89，106-112， 118-126，144-149， 157-173，175-184 8 D，E 1-52 47，181
BA0539 假定的蛋白 质 14-36，48-54， 79-85，149-159， 171-182，189-205， 211-217 4 C，F 171-240 48，182
BA0546 假定的蛋白 质 9-23，30-40，56-70， 75-80，97-103， 111-117，130-135， 139-145，149-160， 250-256，276-286， 309-315，326-331， 364-376，385-391， 400-412，429-434， 446-462，472-498 4 C，D 363-430 49，183
BA0553 热休克蛋白 90(htpG) 4-28，44-60，73-81， 88-94，102-108， 119-127，145-170， 201-208，220-227， 229-239，291-297， 306-323，327-335， 342-369，372-394， 414-420，427-445， 456-462，471-478， 494-503，505-510， 536-542，549-567， 585-594，614-627 12 D，E，F 215-283 50，184
BA0564 尿苷酸激酶 (smbA) 4-10，27-33，40-48， 64-70，82-96， 108-115，123-131， 4 I 151-160 51，185
171-176，182-204
BA0572 DNA聚合酶 III，α亚单 位(dnaE) 4-15，19-36，39-47， 51-57，62-69，77-84， 91-97，103-112， 117-136，148-168， 189-195，204-211， 213-228，234-243， 268-274，280-289， 294-308，314-335， 341-349，354-375， 382-392，394-405， 419-424，430-435， 442-469，479-489， 500-507，510-516， 523-534，536-545， 560-579，586-592， 614-620，639-649， 652-663，665-702， 704-710，727-732， 743-755，761-781， 799-805，810-816， 842-851，885-891， 904-912，924-931， 933-946，948-973， 980-988，990-1007， 1017-1023， 1027-1035， 1046-1055， 1063-1074， 1086-1091， 1095-1102， 1116-1122， 1149-1158 5 B，C，F 458-497 52，186
BA0581 Pfs 蛋白 (pfs-2) 4-23，26-32，50-56， 72-85，87-104， 106-113，116-151， 159-174，176-184， 187-194，199-206， 211-232，242-261 4 B，E 91-170 53，187
BA0596 膜相关蛋白 p66 4-24，53-58，65-72， 84-96，106-113， 8 B，C， D，E，F 36-119， 343-394 54，188
115-125，149-154， 176-191，215-222， 239-244，267-275， 278-304，323-340， 345-351，416-424， 449-455，473-483， 523-537，540-556， 564-583，605-616
BA0601 氨酰基-组氨 酸二肽酶 (pepD) 11-27，45-52， 60-74，96-102， 123-136，140-155， 167-189，194-201， 209-230，254-261， 264-284，289-294， 297-305，319-325， 338-343，349-361， 363-377，381-388， 396-409，413-422， 435-441，455-469 3 B，C 342-386 55，189
BA0605 ATP-依赖的 C1p蛋白酶， X 亚单位 (clpX) 9-45，47-54，72-78， 81-96，111-118， 123-130，133-143， 148-154，157-182， 202-215，241-255， 290-311，316-334， 340-346，349-356， 366-385，387-400， 403-411 8 D，E 156-286 56，190
BA0606 ATP-依赖的 蛋白酶LA (lon-2) 26-45，62-70， 84-121，129-138， 146-168，182-188， 197-207，213-220， 222-229，246-257， 277-283，304-314， 328-336，348-371， 375-385，388-396， 409-421，429-438， 451-459，465-485， 501-528，530-536， 555-581，589-594， 607-614，620-626， 6 A，B， C，E 747-795 57，191
628-634，637-643， 650-658，665-671， 680-691，703-709， 721-742，746-758， 761-767，772-777， 784-790，796-810
BA0619 N-乙酰胞壁 酰-L-丙氨酸 酰胺酶， putat ive 4-11，15-37，52-66， 79-90，96-106， 110-118，124-137， 152-160，162-171， 174-182，200-209， 215-222，227-242， 248-264，284-308， 325-340，362-369， 390-418，420-426， 440-454，463-471， 478-485，490-512， 517-532，539-545， 570-583，591-605， 621-630，643-652， 655-665，684-694 9 A，B， C，D， E，F 75-223， 285-348 58，192
BA0643 丝氨酸/苏氨 酸激酶，推 定的 8-18，25-57， 93-107，121-128， 135-141，159-176， 183-191，202-223， 229-236，298-304， 332-340，359-368， 384-393，410-426， 434-439，444-449， 476-491，502-508， 511-523，525-533， 548-554 7 J 390-409 59，193
BA0644 热休克蛋白 (groEL) 13-31，35-41， 50-58，70-81， 91-100，120-128， 143-149，185-191， 196-203，213-239， 241-251，256-277， 289-303，305-316， 364-388，394-403， 406-412，417-426， 7 E 6-100 60，194
440-446，462-469， 494-502，504-522
BA0653 磷酸甘油酸 酯变位酶 (gpmA) 7-14，30-36，43-52， 54-65，71-85， 95-101，113-119， 121-127，153-170， 179-188，191-200， 204-210，214-222， 227-233，244-250 6 A，E，F 168-223 61，195
BA0663 鞭毛纤维外 层蛋白 (flaA) 14-21，25-39， 54-64，74-99， 102-129，139-153， 159-166，188-206， 214-220，236-243， 245-255，262-269， 276-295，300-309， 315-321，324-331 7 C，D 12-84 62，196
BA0665 嘌呤结合趋 化蛋白 (cheW-3) 4-13，26-33，35-49， 55-68，74-82， 96-114，116-148， 150-161，229-235， 237-254，257-266， 280-286，305-312， 320-337，343-356， 373-382，384-427， 433-439 4 H，I 50-64 63，197
BA0675 甲基接受趋 化蛋白 (methyl-ac cepting chemotaxis protein (mcp-4)) 4-46，53-78， 103-113，117-122， 144-149，168-174， 176-183，193-200， 207-238，252-259， 271-277，279-307， 315-326，330-391， 412-423，425-464， 472-478，508-526， 531-542，551-560， 562-576，584-593， 602-608，616-637， 658-666，714-719， 721-730 12 B，C， D，F， G，H， I，J 28-73， 292-344， 531-608 64，198
BA0682 磷酸甲羟戊 4-21，26-33，69-78， 2 E 223-272 65，199
酸激酶，推 定的 80-93，109-125， 127-134，137-146， 154-160，162-169， 173-182，189-199， 210-220，224-242， 246-278，284-290， 294-308
BA0703 DNA引物酶 (dnaG) 10-30，33-42， 46-62，64-70，82-97， 112-122，124-130， 138-145，148-165， 167-178，186-192， 196-209，213-218， 241-249，258-276， 279-288，291-299， 302-307，315-337， 344-349，360-376， 390-402，409-415， 417-428，452-468， 475-484，486-492 2 B 180-232 66，200
BA0733 保守的假定 的蛋白质 17-24，32-43， 49-55，62-69，78-92， 97-118，132-139， 148-154，173-179， 181-189，191-210 9 J 117-131 67，201
BA0737 抗原， p83/100 4-18，35-44，54-67， 77-85，92-101， 106-119，131-144， 146-164，171-177， 182-191，203-218， 282-288，297-310， 343-359，361-367， 400-405，433-439， 454-462，483-492， 496-504，506-517， 522-529，552-559， 564-572，574-580， 590-604，625-660 54 A，B， C，D， E，F， G，I， J，K，L 252-396 68，202
BA0745 假定的蛋白 质 33-50，67-75， 89-95，107-116， 119-126，151-158， 5 A，E，K 115-166 69，203
165-170，175-187， 237-243，252-258， 272-282，323-332
BA0748 ABC转运蛋 白， ATP-binding protein 14-23，41-53， 63-107，111-134， 136-155，179-210， 223-233，261-267， 285-290，296-302 4 C，F 203-299 70，204
BA0754 假定的蛋白 质 22-31，35-41， 53-62，64-75，79-90 2 I，K 1-22 71，205
BA0759 假定的蛋白 质 4-14，17-30，33-44， 54-62，67-76，78-97， 112-118，143-152， 163-169，175-188， 191-199，207-216， 232-239，243-249， 262-268，289-296， 312-319，335-340 12 B，C， D，E， F，G，L 1-35， 183-264 72，206
BA0767 鞭毛P-环蛋 白(flgI) 5-18，37-53，56-66， 74-81，100-110， 120-131，135-141， 150-156，174-181， 189-196，202-211， 225-235，246-251， 255-260，311-319， 326-332 3 C，D，E 245-332 73，207
BA0778 假定的蛋白 质 4-25，28-34，41-49， 71-78，101-120， 125-156，167-173， 190-199，207-213， 218-230，256-267， 269-275，286-304， 312-320，341-349， 363-371，375-384 6 C，D，F 318-384 74，208
BA0784 细胞分裂蛋 白(ftsH) 23-39，48-58， 60-82，85-104， 106-112，117-142， 181-191，205-213， 219-236，242-251， 263-276，295-302， 308-315，320-330， 4 B，D，F 36-419 75，209
335-343，363-372， 387-392，413-419， 430-457，462-470， 477-492，499-505， 531-540，542-548， 568-600，607-614， 620-630
BA0790 假定的蛋白 质 9-50，60-68，70-78， 84-100，105-113， 125-133，141-153， 186-202，204-209， 212-219，236-253， 287-301，310-317， 319-327，332-342， 353-358，364-396， 422-430，437-459， 484-508，510-520， 535-543，573-583， 591-598，610-621， 629-640，648-653， 675-685，691-708， 728-735，738-745， 750-763，765-773， 790-797，799-820， 842-854，857-864， 880-885，903-909， 923-933，939-951， 980-986，991-998， 1019-1024， 1026-1033， 1045-1051， 1064-1075， 1077-1094， 1100-1115， 1139-1157， 1163-1181， 1196-1202， 1207-1213， 1219-1225， 1241-1250， 1275-1290， 8 A，B， D，E，F 1372-141 9 76，210
1304-1310， 1332-1347， 1352-1365， 1383-1405， 1421-1429， 1433-1442
BA0792 假定的蛋白 质 4-40，60-65， 90-102，125-138， 150-160，162-172 6 B，D，E 14-104 77，211
BA0829 假定的蛋白 质 4-31，37-53，59-80， 87-93，173-183， 185-195，219-233， 239-247，265-275 3 B，E 72-146 78，212
BAP001 假定的蛋白 质 5-22，38-46，53-58， 69-78，80-88，92-99， 117-124，142-151， 154-165，189-196， 206-213，220-226， 288-309 313 A，B， C，D， E，F， G，H， I，J， K，L 15-106， 137-201 79，213
BAP002 外膜蛋白 4-17，37-47，58-66， 75-81，83-89， 106-116，145-152， 162-168 10 A，D，F 41-155 80，214
BAP003 抗原，S2 4-16，50-57，66-72， 92-100，102-112， 126-150，156-167， 194-204，208-218， 244-256 4 A，B，D 165-200 81，215
BAP004 假定的蛋白 质 19-26，38-51， 81-89，96-103， 107-114，117-122， 128-134，150-158， 164-170 3 G 26-48 82，216
BAP005 核心蛋白多 糖结合蛋白A (dbpA) 5-24，30-35，42-47， 74-86，107-117， 146-156 16 A，F 15-92 83，217
BAP006 寡肽ABC转 运蛋白，外 周质寡肽结 合蛋白 (oppAV) 5-22，41-49，55-65， 85-96，100-106， 111-117，125-132， 150-155，161-189， 204-212，229-243， 10 A，B， D，E，F 335-381， 422-484 84，218
262-277，286-296， 304-311，314-323， 353-359，367-373， 391-397，410-417， 446-451，485-500
BAP007 脂蛋白 4-28，37-43，65-72， 109-127，140-148， 155-166，188-198 26 A，B， C，D， E，F， G，H 50-215 85，219
BAP008 假定的蛋白 质 4-24，41-55，71-79， 84-89，95-100， 113-125，138-148， 193-203，215-221， 300-306，334-350， 362-369，385-396 36 A，B， C，D， E，F 91-213 86，220
BAP009 抗原，P35， 推定的 4-24，94-101， 103-112，128-134， 141-148，156-165， 172-181，191-197， 281-290 6 B，D，E 25-76 87，221
BAP010 外表面蛋白， 推定的 5-13，19-25，27-40， 47-54，63-69，84-98， 119-125，143-158， 170-182，199-205， 223-234，237-251， 257-265，287-292， 296-301，307-328， 336-352 6 C，D， E，F 336-362 88，222
BAP011 寡肽ABC转 运蛋白，外 周质寡肽结 合蛋白 (oppAIV) 4-25，29-36，41-47， 54-66，88-95， 97-110，115-121， 127-135，164-193， 203-220，232-244， 269-275，278-284， 289-316，320-327， 336-342，344-353， 355-363，370-378， 436-442，449-454， 460-466，478-489， 492-505 6 C，D， E，F 311-377 89，223
BAP012 IMP脱氢酶 12-34，40-48， 4 A，C， 331-386 90，224
(guaB) 84-90，131-138， 140-151，157-175， 177-187，193-201， 207-261，267-281， 306-312，334-340， 343-349，352-357， 369-377，380-394 E，F
BAP013 外表面蛋白C (ospC) 6-20，54-73， 97-116，129-135， 138-149，173-191， 194-208 12 C，D， E，F 116-212 91，225
BAP014 假定的蛋白 质 11-34，41-48， 58-72，82-88，90-99， 101-109，137-145， 161-168，172-188， 193-211，215-221， 260-269，271-278， 304-310，317-327， 336-351 4 K 208-230 92，226
BAP015 假定的蛋白 质 4-13，20-30，73-83， 90-107，117-137， 226-236，244-260， 268-275，286-293， 310-317，324-330， 340-367，370-379， 390-422，427-442， 497-505，507-513， 549-557，569-576， 585-593，611-617， 630-638，647-657， 659-666，670-675， 689-699，726-736， 769-774，779-802， 866-873，886-894， 934-940，956-973， 986-992，1009-1017， 1026-1041， 1043-1050， 1056-1068 61 A，B， C，D， E，F， G，H， I，J， K，L 3-48， 576-739 93，227
BAP016 假定的蛋白 质 10-19，32-40， 42-48，50-58，75-85， 2 F 32-72 94，228
88-97，112-139
BAP017 假定的蛋白 质 4-13，20-27，67-80， 92-98，101-107， 114-123，153-169， 174-181，200-206， 213-219，226-242， 248-254，256-289， 299-307，310-316， 320-326，329-346， 382-392 25 A，C， D，E， G，I， J，K，L 324-391 95，229
BAP018 假定的蛋白 质 32-38，40-47， 49-54，79-89， 95-101，110-117， 122-129，132-140， 151-157，178-197， 200-206，216-227， 249-257 12 A，C， D，E，F 104-143， 148-195 96，230
BAP019 假定的蛋白 质 10-16，35-47， 52-77，81-89， 104-109，115-123， 132-149，151-160， 163-184，197-213， 215-245，252-266， 294-304，310-337， 342-348，362-372， 393-398，408-430， 452-466，468-476， 485-491，497-506， 514-520，530-537， 539-557，592-606， 627-632，636-653， 674-688，693-731， 748-753，760-766， 783-797，805-814， 819-825，833-840， 843-851 18 A，B， C，D， E，F， I，K，L 91-135， 282-299， 445-477 97，231
BAP020 假定的蛋白 质 11-22，25-31， 55-65，83-107， 111-129 17 A，C， D，E， F，G， H，I 130-137 98，232
BAP021 假定的蛋白 15-21，24-43， 18 C，D， 3-75 99，233
质 60-68，86-95， 157-185，188-197 E，F
BAP022 假定的蛋白 质 13-19，35-44， 56-73，79-92， 116-129，143-158， 169-178，198-210， 215-221，238-243， 247-256，261-267， 270-294，310-320， 331-341，360-366， 377-387，397-406， 412-421，423-439， 449-455，458-465， 473-479，483-492， 510-525，561-569， 571-597，599-619， 635-641，686-704， 712-721，738-755， 761-767，781-794， 806-813，844-857， 862-873，875-882， 889-896，901-915， 921-931，937-943， 963-975，991-997， 1001-1009， 1025-1032， 1040-1046， 1051-1056， 1073-1080， 1096-1105， 1112-1154， 1163-1170， 1173-1180， 1186-1197， 1203-1208， 1224-1232， 1237-1249， 1254-1261 9 A，C， D，E，F 400-429， 521-545 100，234
BAP023 抗原，P35， 推定的 6-30，81-87， 117-128，134-142， 147-158，178-186， 5 D，E，F 61-122 101，235
217-227，246-255
BAP024 抗原性蛋白 P35 4-22，31-38，77-83， 130-137，159-169， 188-194，208-229， 231-238，272-283， 286-294，308-315， 317-336，338-347 147 A，B， C，D， E，F， G，H， I，J， K，L 8-232， 265-318 102，236
BAP025 假定的蛋白 质 9-23，26-34，36-42， 73-94，113-142， 186-192，200-221， 232-238，246-252， 254-279，292-307， 311-316 14 A，C， D，E 20-62， 95-181 103，237
BAP026 假定的蛋白 质 26-37，58-67， 83-89，97-109， 114-141 3 A，C，D 1-76 104，238
BAP027 假定的蛋白 质 13-20，28-35， 70-78，95-102， 156-169，171-180 3 B，C， D，F 121-178 105，239
BAP028 假定的蛋白 质 7-20，32-41， 131-147，156-166， 219-226，240-251， 259-270，275-282， 299-305，309-315， 336-342，344-350 29 A，B， C，D， F，G 195-259 106，240
BAP029 ErpB2蛋白 7-23，37-44，48-63， 93-102，108-120， 138-145，219-228， 237-246，251-270， 277-283，292-300， 317-323，336-351， 361-367 28 GA，B， C，D， F，H， I，J， K，L 19-124， 160-232 107，241
BAP030 假定的蛋白 质 28-35，40-47， 93-100，102-110， 158-182 5 C，D，F 4-77 108，242
BAP031 Erp蛋白 8-32，39-44， 104-110，157-169， 183-196，212-217 56 A，B， C，E， G，I 42-199 109，243
BAP032 脂蛋白 4-18，49-56，72-81， 90-107，127-133， 146-151 5 A，B， D，E 48-114 110，244
BAP033 外膜蛋白， 推定的 4-22，24-30，42-53， 57-62，66-80，83-90， 99-104，112-118， 132-148，168-175， 179-186 8 A，B，F 97-173 111，245
BAP034 假定的蛋白 质 7-19，33-43，58-77， 85-91 9 A，B， C，D， E，F， G，J 14-63 112，246
BAP035 假定的蛋白 质 15-21，24-35， 75-80，123-128， 133-139，148-172 56 A，B， C，D， E，F， G，J 7-136 113，247
BAP036 假定的蛋白 质 29-35，51-56， 64-74，82-88， 100-106，134-153 10 A，C， D，F 1-44 114，248
BAP037 假定的蛋白 质 32-44，65-72， 75-103，136-144， 159-166 5 A，D， E，F 136-185 115，249
BAP038 假定的蛋白 质 16-28，40-53， 74-89，108-114， 130-140，152-160， 168-177 13 A，D， E，F， I，J，K 3-151 116，250
BAP039 假定的蛋白 质 5-27，39-45，57-65， 72-83，130-135 11 B，C， D，G，K 27-91 117，251
BAP040 假定的蛋白 质 16-22，31-44， 52-67，79-84， 95-106，119-127 8 A，E 22-78 118，252
BAP041 假定的蛋白 质 4-23，32-39，45-53， 67-75，83-89， 97-112，133-139， 189-194，200-205， 241-247，254-259， 275-282，287-308， 311-316，329-339， 344-352 45 A，B， C，D， E，F 157-246 119，253
BAP042 假定的蛋白 质 4-21，24-30，52-77， 81-88，97-102， 110-115，125-137 7 D，F 70-113 120，254
BAP043 假定的蛋白 质 4-20，33-38，44-56， 73-81，123-135， 23 B，F 13-91 121，255
159-166，169-181， 199-204
BAP044 假定的蛋白 质 12-18，23-31， 39-52，54-60，63-74， 89-97，99-111 7 A，D，F 1-66 122，256
BAP045/ BBS42 相关蛋白A 4-19，55-62，76-94， 96-104，109-126， 154-166 4 E 123，257
CRFA006 4-11，26-39 4 H，K，L 11-19 124，258
CRFA514 4-21 2 G 15-24 125，259
CRFA554 12-25 24 H，I 23-45 126，260
CRFA657 4-23，33-55，59-64， 76-93，107-125， 129-138 6 K 54-78 127，261
CRFA744 4-27，56-82 3 K 21-40 128，262
CRFA762 8-17，24-36，47-61， 76-83 2 J 65-83 129，263
CRFA780 4-22，37-46，54-60， 64-70 2 J 13-25 130，264
CRFBD21 9-17，23-41，64-86 4 G 6-25， 53-66 131，265
CRFBI14 4-23，29-48 3 I 18-29 132，266
CRFBO17 9-20，26-40，44-51 3 J 40-60 133，267
CRFP316 4-9，11-18，20-31 2 J 4-21 134，268
表2：通过细菌表面展示和它们的来自狭义布氏疏螺旋体和嘎氏疏螺旋体的直系同源物从阿氏疏螺旋体鉴定的免疫原性蛋白。
表2显示具有序列标志号的来自阿氏疏螺旋体的鉴定的基因。Blast分析中来自狭义布氏疏螺旋体(http://www.tigr.org/tigr-scripts/CMR2/GenomePage3.sp1？database＝gbb)和嘎氏疏螺旋体(http://sgb.imb-jena.de/cgi/index.p1)的最佳匹配通过它们各自的序列标志号一起列出。
表2：
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表3：用于基因分布分析的株系的列表
表3显示对基因分布研究进行分析的广义布氏疏螺旋体分离株的不同株系的代表。给出了基因型群、OspA和ospC型(Wilske等人，1988；Livey等人，1995)和分离的来源(CSF；脑脊液)。此外，给出了与相应的ospC型相关的疾病类型，H；无侵袭性疾病，HInv；侵袭性疾病，-；与人中的疾病无关
表3：
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表4：广义布氏疏螺旋体株系的不同株系中选择数目的抗原的基因分布分析。
使用对于编码相关抗原的基因是特异性的寡核苷酸通过PCR检测表3中显示的30个广义布氏疏螺旋体株系。基因分布表列出了来自前20个株系或所有30个株系的阳性PCR结果的数目和显示了基因在广义布氏疏螺旋体基因型群的不同分离株中的存在和保守性。
表4：
Ba ORF Seq ID (DNA) 基因分布
BA0056 1 26/30
BA0060 2 30/30
BA0062 3 19/20
BA0072 4 20/20
BA0075 5 6/20
BA0078 6 30/30
BA0087 7 30/30
BA0091 8 30/30
BA0106 9 30/30
BA0126 10 20/20
BA0135 11 30/30
BA0149 12 20/20
BA0150 13 20/20
BA0152 14 20/20
BA0181 15 20/20
BA0192 16 24/30
BA0200 17 27/30
BA0210 18 28/30
BA0215 19 29/30
BA0221 20 20/20
BA0235 21 30/30
BA0237 22 10/20
BA0283 23 20/20
BA0295 24 20/20
BA0314 25 8/20
BA0321 26 30/30
BA0327 27 13/20
BA0329 28 30/30
BA0343 29 19/20
BA0345 30 19/30
BA0351 31 12/20
BA0356 32 28/30
BA0364 33 30/30
BA0380 34 29/30
BA0388 35 17/20
BA0389 36 20/20
BA0417 37 30/30
BA0419 38 0/20
BA0429 39 9/20
BA0431 40 20/20
BA0442 41 30/30
BA0464 42 30/30
BA0469 43 28/30
BA0475 44 16/20
BA0507 45 30/30
BA0513 46 16/20
BA0514 47 4/20
BA0539 48 20/20
BA0546 49 11/20
BA0553 50 19/20
BA0564 51 30/30
BA0572 52 20/20
BA0581 53 30/30
BA0596 54 30/30
BA 0601 55 16/20
BA0605 56 28/30
BA0606 57 13/20
BA0619 58 13/20
BA0643 59 30/30
BA0644 60 19/20
BA0653 61 30/30
BA0663 62 20/20
BA0665 63 30/30
BA0675 64 30/30
BA0682 65 30/30
BA0703 66 19/20
BA0733 67 29/30
BA0737 68 26/30
BA0745 69 30/30
BA0748 70 30/30
BA0754 71 30/30
BA0759 72 30/30
BA0767 73 19/20
BA0778 74 1/20
BA0784 75 30/30
BA0790 76 26/30
BA0792 77 30/30
BA0829 78 28/30
BAP001 79 5/20
BAP002 80 8/20
BAP003 81 22/30
BAP004 82 30/30
BAP005 83 0/20
BAP006 84 29/30
BAP007 85 30/30
BAP008 86 8/20
BAP009 87 11/20
BAP011 89 4/20
BAP012 90 20/20
BAP013 91 30/30
BAP014 92 12/30
BAP015 93 11/20
BAP016 94 13/20
BAP017 95 12/20
BAP018 96 2/20
BAP019 97 11/20
BAP020 98 0/30
BAP021 99 22/30
BAP022 100 26/30
BAP023 101 26/30
BAP024 102 18/30
BAP025 103 30/30
BAP026 104 8/20
BAP027 105 26/30
BAP028 106 8/20
BAP029 107 6/30
BAP030 108 11/20
BAP031 109 8/20
BAP032 110 0/20
BAP033 111 12/20
BAP034 112 10/20
BAP035 113 9/20
BAP036 114 10/20
BAP037/ BAP038 115 116 4/20
BAP039 117 0/20
BAP040 118 0/20
BAP041 119 0/20
BAP042 120 3/20
BAP043 121 28/30
BAP044 122 1/20
BAP045/ BBS42 123 9/20
表5：表位在小鼠中的免疫原性
通过使用具有编码与广义布氏疏螺旋体肽融合的平台蛋白FhuA或LamB的质粒的大肠杆菌克隆的免疫就免疫原性检测广义布氏疏螺旋体抗原。通过肽ELISA检测和测量表位特异性抗体的存在。结果表示为-至++++，和计算为基于OD 405nm的个体小鼠血清的反应性的和(-；0-0.1，+0.1-0.2，++；0.2-0.4，+++；0.4-0.8，++++；＞0.8)。
表5：
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表6：使用来源于广义布氏疏螺旋体的肽进行的肽ELISA。
“和”代表对于其OD 405nm测量值高出无包衣的对照至少0.05OD单位的血清的数目。“从aa”和“至aa”是指肽相对于在各序列标志号(Seq ID)下所列的全长蛋白质的位置。使用来源于广义布氏疏螺旋体的肽和22个人血清(P1755、P1766、P1772、P1806、P1811、P3055、P3144、P3186、P3219、P3017、P3084、P3288、P3150、P3301、P3344、P3394、P3183、P3336、P1789、P1796、P1938、P1941)进行的ELISA实验。
表6：
肽 Ba ORF Seq ID 和 从aa 到aa
BAOamds.02 BA0619 192 2 98 125
BAOamds.04 BA0619 192 7 144 170
BAOamds.05 BA0619 192 4 165 187
BAOamds.07 BA0619 192 14 201 223
BAOamds.08 BA0619 192 15 285 309
BAOamds.09 BA0619 192 9 305 329
BAOamds.10 BA0619 192 7 325 348
BAOamds.11 BA0619 192 19 400 425
BAOamds.12 BA0619 192 8 513 541
BAOamds.13 BA0619 192 2 537 564
BAOamds.14 BA0619 192 2 560 587
BAOamds.15 BA0619 192 3 583 610
BAOba0077.01 BA0075 139 20 138 164
BAOba0077.02 BA0075 139 14 160 187
BAOba0089.01 BA0087 141 12 160 187
BAOba0128.01 BA0126 144 15 350 378
BAOba0128.02 BA0126 144 18 374 402
BAOba0128.03 BA0126 144 9 398 426
BAOba0128.04 BA0126 144 17 422 451
BAOba0155.01 BA0152 148 3 264 288
BAOba0155.02 BA0152 148 11 284 308
BAOba0155.03 BA0152 148 10 304 328
BAOba0198.01 BA0192 150 8 77 91
BAOba0207.01 BA0200 151 10 111 134
BAOba0242.01 BA0235 155 6 126 153
BAOba0242.02 BA0235 155 11 149 176
BAOba0242.03 BA0235 155 17 172 200
BAOba0303.01 BA0295 158 12 220 245
BAOba0303.02 BA0295 158 10 241 266
BAOba0303.03 BA0295 158 4 262 288
BAOba0323.01 BA0314 159 1 31 53
BAOba0323.02 BA0314 159 13 49 71
BAOba0323.03 BA0314 159 20 67 89
BAOba0356.01 BA0343 163 13 258 280
BAOba0356.02 BA0343 163 10 276 298
BAOba0356.03 BA0343 163 12 294 317
BAOba0356.04 BA0343 163 11 313 336
BAOba0358.01 BA0345 164 13 458 472
BAOba0378.01 BA0364 167 8 82 107
BAOba0378.02 BA0364 167 14 103 127
BAOba0378.02 BA0364 167 7 103 127
BAOba0378.03 BA0364 167 13 212 235
BAOba0378.03 BA0364 167 2 212 235
BAOba0378.04 BA0364 167 18 231 253
BAOba0378.04 BA0364 167 4 231 253
BAOba0394.01 BA0380 168 12 26 51
BAOba0394.02 BA0380 168 10 47 73
BAOba0402.01 BA0388 169 6 1053 1082
BAOba0403.01 BA0389 170 5 194 217
BAOba0403.02 BA0389 170 17 213 236
BAOba0403.03 BA0389 170 15 232 255
BAOba0403.04 BA0389 170 5 251 274
BAOba0403.05 BA0389 170 15 270 292
BAOba0444.01 BA0429 173 10 110 131
BAOba0444.02 BA0429 173 4 179 201
BAOba0444.03 BA0429 173 11 197 219
BAOba0444.04 BA0429 173 2 215 236
BAOba0480.01 BA0464 176 5 12 36
BAOba0480.02 BA0464 176 3 32 56
BAOba0480.03 BA0464 176 11 52 77
BAOba0485.01 BA0469 177 12 281 300
BAOba0485.02 BA 0469 177 16 296 316
BAOba0491.01 BA0475 178 12 33 57
BAOba0491.02 BA0475 178 4 53 78
BAOba0557.01 BA0539 182 9 171 197
BAOba0557.02 BA0539 182 7 193 219
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BAObgp027.13 BAP015 227 5 594 615
BAObgp027.14 BAP015 227 7 611 632
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BAOflaB.03 BA0149 146 2 58 82
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BAOflaB.06 BA0149 146 4 118 142
BAOflaB.07 BA0149 146 5 138 165
BAOflaB.08 BA0149 146 1 256 279
BAOflaB.09 BA0149 146 6 275 297
BAOflaB.10 BA0149 146 1 293 315
BAOflaB.11 BA0149 146 9 163 189
BAOflaB.12 BA0149 146 12 185 211
BAOflaB.13 BA0149 146 14 207 233
BAOflaB.14 BA0149 146 1 229 255
BAOfliD.02 BA0150 147 3 46 75
BAOfliD.03 BA0150 147 2 110 131
BAOfliD.04 BA0150 147 4 127 148
BAOfliD.05 BA0150 147 7 188 216
BAOfliD.06 BA0150 147 1 212 240
BAOfliD.07 BA0150 147 1 344 367
BAOfliD.08 BA0150 147 5 361 384
BAOfliD.09 BA0150 147 3 382 405
BAOfliD.10 BA0150 147 1 401 424
BAOfliG-1.01 BA0221 154 9 151 180
BAOfliG-1.02 BA0221 154 7 176 205
BAOfliG-1.03 BA0221 154 10 245 274
BAOfliG-1.04 BA0221 154 16 270 299
BAOlmp1.01 BA0210 152 6 937 962
BAOlmp1.02 BA0210 152 4 958 983
BAOlmp1.03 BA0210 152 2 102 130
BAOlmp1.04 BA0210 152 1 126 154
BAO1mp1.05 BA0210 152 2 150 177
BAOlmp1.06 BA0210 152 2 823 849
BAOlmp1.07 BA0210 152 2 845 872
BAOlmp1.08 BA0210 152 3 867 892
BAOlmp1.09 BA0210 152 2 285 314
BAOlmp1.10 BA0210 152 5 310 339
BAOlmp1.11 BA0210 152 3 335 364
BAOomp.01 BAP033 245 3 97 119
BAOomp.02 BAP033 245 4 115 137
BAOomp.03 BAP033 245 1 133 155
BAOomp.04 BAP033 245 5 151 173
BAOoppA-2.01 BA0327 161 2 20 43
BAOoppA-2.02 BA0327 161 1 39 62
BAOoppA-2.03 BA0327 161 1 58 79
BAOoppA-2.04 BA0327 161 9 69 94
BAOoppA-2.05 BA0327 161 3 90 115
BAOoppA-2.06 BA0327 161 4 167 189
BAOoppA-2.07 BA0327 161 11 185 207
BAOoppA-2.08 BA0327 161 14 203 224
BAOoppA-2.09 BA0327 161 9 296 320
BAOoppA-2.10 BA0327 161 9 316 339
BAOoppA-2.11 BA0327 161 10 335 358
BAOoppA-2.12 BA0327 161 9 354 377
BAOoppA-2.13 BA0327 161 10 404 431
BAOoppA-2.14 BA0327 161 8 427 453
BAOoppA-2.15 BA0327 161 15 449 475
BAOoppA-2.16 BA0327 161 16 471 498
BAOoppA-2.17 BA0327 161 9 494 521
BAOoppA-3.01 BA0329 162 1 40 62
BAOoppA-3.03 BA0329 162 1 76 97
BAOoppA-3.04 BA0329 162 1 251 276
BAOoppA-3.05 BA0329 162 15 272 297
BAOoppA-3.06 BA0329 162 17 291 316
BAOoppA-3.08 BA0329 162 1 333 358
BAOoppA-4.01 BAP006 218 16 335 360
BAOoppA-4.02 BAP006 218 6 356 381
BAOoppA-4.03 BAP006 218 2 422 446
BAOoppA-4.04 BAP006 218 6 442 465
BAOoppA-4.05 BAP006 218 1 461 484
BAOp35.03 BAP024 236 1 46 69
BAOp35.04 BAP024 236 11 65 88
BAOp35.05 BAP024 236 11 84 107
BAOp35.07 BAP024 236 1 124 149
BAOp35.10 BAP024 236 4 186 211
BAOp35.11 BAP024 236 13 207 232
BAOp35.12 BAP024 236 12 265 294
BAOp35.13 BAP024 236 1 290 318
BAOp66.02 BA0596 188 2 56 80
BAOp66.03 BA0596 188 1 76 100
BAOp66.04 BA0596 188 16 96 119
BAOp66.05 BA0596 188 3 343 371
BAOp66.06 BA0596 188 4 367 394
BAOp66.07 BA0596 188 3 410 436
BAOp66.08 BA0596 188 1 432 457
BAOp83.03 BA0737 202 2 281 307
BAOp83.13 BA0737 202 1 631 654
BAOpbp-1.01 BA0135 145 10 41 66
BAOpbp-1.02 BA0135 145 9 62 86
BAOpbp-1.03 BA0135 145 2 82 106
BAOpbp-1.04 BA0135 145 3 102 126
BAOpbp-1.05 BA0135 145 2 417 444
BAOpbp-1.06 BA0135 145 2 440 466
BAOpbp-1.07 BA0135 145 6 528 554
BAOpbp-1.08 BA0135 145 18 550 575
BAOpbp-1.09 BA0135 145 3 571 596
表7：使用小鼠中产生的表位血清进行的FACS分析。
就与阿氏疏螺旋体株系K78细胞的表面的结合在FACS分析中检测小鼠血清中的表位特异性抗体。列出了显示在FACS分析中显著转换的血清。百分数表示与不用免疫血清清温育的细胞相比，在FACS分析中显示转换的细胞的数目。
表7：
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表8：在动物中测试的表达的和纯化的蛋白质。
该表列出了在疏螺旋体动物模型中进行测试的表达的和纯化的蛋白。Ba：阿氏疏螺旋体，ORF：开放阅读框架，BB：β圆桶(betabarrel)，SP：信号肽，LP：用于脂质化的信号肽，Mw：分子量，kDa：千道尔顿。
表8：
Ba ORF 氨基 酸SEQ ID NO： 常用名称 基 序 Mw (kDa) 蛋白 结构 氨基酸 从-到 纯化 状态
BA0056 BA0210 BA0210 BA0221 BA0237 BA0507 BA0581 BA0605 BA0675 BA0790 BAP006 135 152 152 154 156 179 187 190 198 210 218 假定的蛋白 表面定位膜蛋白1 (1mp1) 表面定位膜蛋白1 (1mp1) 鞭毛驱动转换蛋白 (fliG-1) 假定的蛋白 假定的蛋白 Pfs蛋白(pfs-2) ATP-依赖性Clp蛋 白激酶，X亚单位 (clpX) 甲基接受趋化蛋白 (mcp-4) 假定的蛋白 寡肽ABC转运蛋 白，外周质寡肽结合 蛋白(oppAV) BB SP SP SP SP SP BB， SP LP 76.5 128.2 128.2 47.9 30.5 254.2 29.2 47.7 84.7 168.9 61.1 BB0058- 1 Bbu0210 -1 Bbu0210 -2 Baf0221 Baf0237 Baf0512 -2 Baf0581 Baf0627 Bbu0680 -2 BB0794- 3 BbuA003 4-1 91-415 27-246 701-10 67 1-408 21-257 399-87 0 22-264 1-430 391-75 979-14 67 251-52 8 不可溶 可溶 不可溶 不可溶 不可溶 不可溶 不可溶 不可溶 不可溶 不可溶 不可溶
表9：细胞的最可能数目(来自Norman，R.L.和Kempe，L.L.，1960)。
该表显示具有95％的置信限(95％CL)的细胞的最可能数目(MPN#)。细菌的最可能数目通过将对于不同稀释度的具有活细菌(阳性)的孔的数目与表中的实体相比较来从表中读出。MPN是在最低稀释度(10个细胞/孔)下的细胞数目。
表9：
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表10：小鼠中的保护作用
该表显示在用抗使用狭义布氏疏螺旋体株系N40的攻击的疏螺旋体属抗原的免疫后获得的保护的水平。用攻击后的血清和来自耳和膀胱的疏螺旋体属的培养物(C)的Western印迹(WB)来确定小鼠的疏螺旋体属感染。就各动物实验中的测试抗原和对照组将未感染的小鼠的百分数列于表中。nd：未确定的。
表10：
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实施例
实施例1：用于鉴定根据本发明的肽的一般筛选方法。
已用于本发明的方法基于由广义布氏疏螺旋体编码的蛋白质或肽与存在于人血清中的抗体的相互作用。由人免疫系统产生的和存在于人血清中的抗广义布氏疏螺旋体的抗体指示了抗原性蛋白和它们的免疫原性的体内表达。此外，使用单个选择或产生的血清在第二和第三轮的筛选中，处理通过细菌表面展示表达文库使用预选择的血清鉴定的抗原性蛋白。因此本发明以预防由广义布氏疏螺旋体引起的感染的药物组合物，特别是疫苗的形式提供了有效的、相关的、完全的成套抗原。
在用于鉴定完全的根据本发明的成套抗原的抗原鉴定程序中，使用几个血清库或血浆级分或其他汇合的包含抗体的体液(抗体库)筛选至少两个不同的来自广义布氏疏螺旋体的细菌表面表达文库。从经检测抗广义布氏疏螺旋体的抗原性化合物，例如完整细胞、总提取物的血清收集物产生抗体库。优选使用6个血清库(具有25个个体样品)。经确定具有高ELISA滴度的血清在免疫印迹中应当与多种蛋白反应以在用于本发明的筛选方法中被认为是超免疫的并且从而是相关的。
本发明中使用的表达文库应当允许所有潜在抗原(例如从布氏疏螺旋体的所有分泌的和表面的蛋白产生的)表达。将由在细菌宿主膜上的两个选择的外膜蛋白(LamB和FhuA)上展示广义布氏疏螺旋体的(总的)成套的表达的肽序列的细菌宿主的重组文库来代表细菌表面展示文库(Georgiou，G.，1997；Etz，H.等人，2001)。使用重组表达文库的一个有利方面是：经鉴定的超免疫血清反应抗原可以通过表达筛选的和选择的表达该超免疫血清反应性抗原的克隆的编码序列来立即产生而无需另外的重组DNA技术或克隆步骤。
通过一个或多个额外轮次的筛选进一步分析通过所述的根据本发明的程序鉴定的完全的成套抗原。因此使用产生的抗选择的肽的个体抗体制备物或抗体，所述肽经鉴定为免疫原。根据优选实施方案，用于第二轮筛选的个体抗体制备物来源于健康成人和/或显示高于某最低水平的抗体滴度例如比80％，优选比90％，特别优选比95％的受试人(患者或健康个体)血清更高的抗体滴度的被攻击的成人。在第二轮筛选中使用这样的高滴度个体抗体制备物允许对来自广义布氏疏螺旋体的超免疫血清反应性抗原和其片段进行充分选择性鉴定。
在完全筛选方法后，万一其不能在原核表达系统中表达，将选择的抗原性蛋白表达为重组蛋白或体外翻译的产物，或通过系列ELISA和Western印迹测定法使用大的人血清收集物(最少大约20个健康者和患者的血清)的在第二轮筛选中测试鉴定的抗原性肽(合成产生的)以估计它们的免疫原性。
重要的是：个体抗体制备物(其也可以是选择的血清)允许从来自第一轮的所有有希望的候选物中选择性地鉴定所有超免疫血清反应性抗原中最有希望的候选者。因此，应当使用优选至少10个个体抗体制备物(即来自至少10个患有对选择的病原体的感染的不同的个体的抗体制备物(例如血清))在第二轮筛选中鉴定这些抗原。当然，也可能使用少于10个个体制剂，然而，对于数量少的个体抗体制备物，步骤的选择性可能不是最佳的。在另一方面，如果给定的超免疫血清反应性抗原(或其抗原性片段)被至少10个个体抗体制备物、优选至少30个，特别地至少50个个体抗体制备物识别，那么超免疫血清反应性抗原的鉴定的选择性也足以进行正确的鉴定。超免疫血清反应性当然可以使用尽可能多(例如使用超过100个或甚至使用超过1,000个)的个体制备物来测试。
因此，根据本发明的方法的超免疫血清反应性抗体制备物的相关部分优选应当为至少10个，更优选至少30个，特别地至少50个个体抗体制备物。备选地(或以组合的方式)超免疫血清反应性抗原优选也可使用至少20％，优选至少30％，特别地至少40％的第二轮筛选中使用的所有个体抗体制备物来鉴定。
根据本发明的优选实施方案，从其中制备用于第二轮筛选的个体抗体制备物的(或用作抗体制备物的)血清通过它们抗广义布氏疏螺旋体(例如抗这些病原体的制备物，例如裂解物、细胞壁组分和重组蛋白)的滴度来选择。优选，当完整的生物体(总裂解物或完整的细胞)在ELISA中用作抗原时，一些血清用高于1,000U，特别地高于5,000U(U＝单位，根据在给定的稀释度下的OD405nm读数计算的)的IgG滴度来选择。
通过人免疫系统产生的且存在于人血清中的抗广义布氏疏螺旋体的抗体指示了抗原性蛋白的体内表达和它们的免疫原性。由血清抗体识别的线性表位的识别可基于短至4至5个氨基酸的序列。当然，这不一定意味着这些短肽能够在体内诱导给定的抗体。因此，将就它们在体内诱导抗选择的蛋白的能力在动物中(主要在小鼠中)进一步测试确定的表位、多肽和蛋白质。
优选的抗原位于细胞表达或被分泌，从而可在细胞外接触。抗细胞壁蛋白的抗体预期用于多个目的：抑制附着、干扰营养物的获得、抑制免疫逃脱和促进吞噬(Hornef，M.等人，2002)。抗分泌蛋白的抗体在中和它们作为毒素或毒性组分的功能中是有益的。也已知：细菌通过分泌的蛋白相互交流。抗这些蛋白的中和抗体将破坏引起感染的病原体物种之间或之内的促进生长的串扰(cross-talk)。证明生物信息学分析(信号序列、细胞壁定位信号、跨膜结构域)在估计细胞表面定位或分泌中是非常有用的。实验方法包括从人血清中分离针对相应的表位和蛋白质的抗体、以及在小鼠中产生抗通过细菌表面展示筛选选择的(多)肽的免疫血清。然后将这些血清在至少一个下列测定法中作为试剂用于第三轮筛选：在不同条件下生长的广义布氏疏螺旋体的细胞表面染色(FACS或显微镜检查法)、中和能力(毒素、附着)的确定、和调理作用和吞噬作用的提高(体外吞噬测定法)。
为此目的，将细菌大肠杆菌克隆直接注射入小鼠，然后收集免疫血清，就功能性调理素或中和抗体在相关性体外测定法中对其进行测试。备选地，可通过使用肽或蛋白质作为底物从人或小鼠血清纯化特异性抗体。
根据本文中使用的抗原鉴定方法，本发明可令人惊讶地提供了，如本文中所描述的广义布氏疏螺旋体的成套完全的新型核酸和新型蛋白质、抗原，更特别地超免疫血清反应性抗原和其片段等等。编码超免疫血清反应性抗原的根据本发明的核苷酸序列具有单个地示于SeqID No 1-134、269-387和507-628的核苷酸序列，其中相应的编码的氨基酸序列具有Seq ID No 135-268、388-506和629-750中所示的氨基酸序列。
特定抗原的所有线性超免疫血清反应性片段可通过用成组的通过1个氨基酸交叠的具有至少10个氨基酸的长度的肽分析蛋白质抗原的整个序列来鉴定。随后，非线性表位可通过使用表达的全长蛋白质或其结构域多肽进行的使用超免疫血清清的蛋白质抗原的分析来鉴定。假定蛋白质的不同结构域足以形成不依赖于天然蛋白质的3D结构，使用超免疫血清进行的各重组或合成产生的结构域多肽的分析将允许在多结构域蛋白的单个结构域内鉴定构象表位。对于其中结构域具有线性和构象表位的这些抗原，使用相应于线性表位的肽进行的竞争实验可用于确认构象表位的存在。
实施例2：基于抗广义布氏疏螺旋体抗体的人血清来源的表征和选择，抗体筛选试剂的制备
实验方法
酶联免疫吸附测定法(ELISA)。
用5-10μg/ml在包衣缓冲液(0.1M碳酸钠pH 9.2)中稀释的总蛋白包被ELISA板(Maxisorb，Millipore)。对于完整细胞ELISA，将106个生物素标记的和固定的细菌加入链霉抗生物素蛋白包被的ELISA板。在PBS-BSA中制备两个稀释度的血清(10,000X，50,000X)。按照厂商的推荐(稀释度：1,000x)使用高特异性辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗人IgG第二抗体(Southern Biotech)。通过基于通过自动ELISA酶标仪(TECAN SUNRISE)读出的OD405nm读数测量底物(ABTS)至有色产物的转化来定量抗原-抗体复合物。
细菌抗原提取物的制备
总细菌裂解物：将狭义布氏疏螺旋体株系B31和阿氏疏螺旋体株系VS461在BSK-II培养基(37℃，5％ CO2)培养一周，然后通过离心(3,000rpm，10分钟，4℃)收集。用PBS洗涤细胞两次，在重悬浮后超声处理2分钟，在冰上在100％功率下脉冲5次。通过离心(3,500rpm，15分钟，4℃)收集上清液。使用蛋白质测定染色剂浓缩剂(Bio-RadLaboratories，Austria)通过Bradford测定法测量蛋白质浓度。
免疫印迹
从体外培养的狭义布氏疏螺旋体株系B31和阿氏疏螺旋体株系VS461制备总细菌裂解物。使用BioRad Mini-Protean Cell电泳系统通过SDS-PAGE分离10-25μg总蛋白/泳道，将蛋白质转移至硝酸纤维素膜(ECL，Amersham Pharmacia)。在5％牛奶中封闭过夜后，以2，000x稀释度加入人血清，使用HRP标记的抗人IgG进行检测。
用于基因组筛选的抗体的纯化
基于用于筛选方法的血清的总的抗细菌滴度选择每抗体库5种血清。通过将热灭活的血清与完整的细胞大肠杆菌DH5α细胞(用pHIE11转化的，在与用于细菌表面展示的条件相同的条件下培养)一起温育来除去抗大肠杆菌大肠杆菌DH5α蛋白的抗体。按照厂商说明书(UltraLink Immobilized Protein G，Pierce)通过G蛋白亲和层析产生来自汇合的、耗竭的血清的高度富集的IgG制剂。通过ELISA测量法检查耗竭和纯化的功效。
结果
由人免疫系统产生的且存在于人血清中的抗广义布氏疏螺旋体的抗体表明抗原性蛋白的体内表达和它们的免疫原性。这些分子对于在本发明中描述的方法中鉴定个体抗原是必需的，所述方法基于特异性抗细菌抗体与相应的广义布氏疏螺旋体肽或蛋白质的相互作用。为获得相关抗体库，从具有不同莱姆疏螺旋体病症状的个体和显示健康的人收集人血清。重要地是使用来自具有不同疾病表现的莱姆疏螺旋体病患者的抗体进行筛选，因为不同广义布氏疏螺旋体基因型群引起的莱姆疏螺旋体病产生不同的疾病症状。从奥地利和捷克的莱姆疏螺旋体病患者收集1325份样品的不同血清组。
通过系列免疫测定法就抗广义布氏疏螺旋体抗体收集和表征1325份血清样品。使用狭义广义布氏疏螺旋体和嘎氏疏螺旋体的总细菌裂解物通过ELISA进行初步表征。测量抗体滴度，根据反应的线性范围内的血清稀释度计算ELISA单位。基于抗体反应性对血清分级，选择最高级的血清进行进一步的通过免疫印迹进行的检测。该分析确认预选择的血清抗多种广义布氏疏螺旋体蛋白的高抗体反应性。用于筛选的抗来自狭义布氏疏螺旋体属的细菌裂解物的血清的反应性示于表1A。抗体库将包含的血清的最终选择主要基于免疫印迹实验中的多条免疫原性条带的存在，代表性Western印迹示于图1B和C。该全面的抗体表征方法已导致抗广义布氏疏螺旋体超免疫血清的明确鉴定。
将选择的血清用于6个不同的用于通过细菌表面展示进行的抗原鉴定的IgG库(每个库中3-5份血清)。通过亲和纯析和DH5α反义性抗的耗竭原以避免细菌表面展示筛选中的背景来从汇集的血清纯化IgG抗体。血清库代表游走性红斑EM-IgG(P3055、P3144、P3186和P3219)、神经型疏螺旋体症NB-IgG(P3077、P3084、P3286、P3288和P3337)、慢性萎缩性肢皮炎ACA-IgG(P3183、P3209和P3336)、莱姆关节炎LA-IgG(P3120、P3239和P3251)以及使用来自具有混合症状的患者产生的两个库LBI-IgG(P1755、P1766、P1772、P1806和P1811)和LBII-IgG(P3016、P3150、P3301、P3344和P3394)。
实施例3：广义布氏疏螺旋体的高度随机的、读框选择性(frame-selected)、小片段基因组DNA文库的产生。
实验方法
基因组DNA的制备
从400ml细菌培养物中收集(5,000rpm，20分钟，室温)细胞，用80ml的50mM Tris pH 7.4洗涤细胞，将其重悬浮于10ml的50mM Tris pH 7.4/25％蔗糖/50mM EDTA中。将悬浮液转移至新玻璃管，加入溶菌酶(终浓度：1.5mg/ml)和SDS(终浓度：2％)。将管在冰上温育以进行细胞裂解。加入蛋白酶K(终浓度：0.1mg/ml)，然后在37℃下温育10分钟，然后进行酚/氯仿(1∶1)提取，进行数次该提取。使用氯仿/异戊醇(1∶24)进行终提取步骤以除去微量的酚。将样品在室温下用RNA酶A(终浓度：10μg/ml)处理1小时，如上所述进行酚/氯仿和氯仿/异戊醇提取。通过加入1/10的起始体积的3M NaAc(pH 5.3)和2.5x体积的99.5％乙醇沉淀剩余上清液中的DNA。于-20℃下温育1小时后，离心(20,000rpm，15分钟)混合物，用70％乙醇洗涤沉淀。最后，将沉淀溶解在TE-缓冲液中。
小基因组DNA片段的制备
使用cup-horn超声仪(配备有BB5 cup horn，在100％功率输出10秒脉冲的Bandelin Sonoplus UV 2200超声仪)将基因组DNA片段机械剪切成大小在150-300bp范围内的片段，或者通过温和的DNA酶I处理(Novagen)剪切成50-70bp大小的片段。观察到，当将DNA断裂成150-300bp大小范围的片段时，超声处理产生紧密得多的片段大小分布。然而，尽管DNA对超声波诱导的流体力学剪切力充分暴露，不能有效且重复性获得片段大小的随后减小。因此，使用Novagen的鸟枪切割(shotgun cleavage)试剂盒通过温和的DNA酶I处理获得50-70bp大小的片段。制备1∶20稀释的试剂盒提供的DNA酶I，在20℃下在60μl体积中在MnCl2存在的情况下进行消化5分钟，以确保双链被酶切割。用2μl的0.5M EDTA终止反应，在2％TAE-琼脂糖凝胶上估计片段化效率。该处理导致基因组DNA的总片段化至接近50-70bp的片段。然后在100μM各dNTP存在的情况下，使用T4DNA聚合酶对片段进行平末端化两次，以确保末端有效平齐(flushing)。将片段立即用于连接反应或于-20℃保存以待以后使用。
载体的描述
在用具有与卡那霉素抗性基因交换的β-内酰胺酶(bla)基因的pASK-IBA骨架(Skerra，A.，1994)上构建载体pMAL4.31。此外，将bla基因克隆入多克隆位点。将ompA的前导肽序列置于编码成熟β-内酰胺酶的序列之前以允许其有效分泌穿过质膜。此外，编码成熟β-内酰胺酶的前12个氨基酸的序列(间隔子序列)跟在ompA前导肽序列之后，以避免紧接前导肽酶切割位点后的序列融合，因为例如在该区域内的带正电荷的氨基酸簇将减少或消除穿过质膜的转运(Kajava，A.等人，2000)。SmaI限制性位点用于文库插入。用于回收选择的片段的上游FseI位点和下游NotI位点在SmaI位点两翼。这样将所述三个限制性位点插入编码12个氨基酸的间隔子序列的序列之后，使bla基因在-1读框处转录，从而导致在NotI位点后15bp的终止密码子。+1bp插入恢复bla ORF从而产生3-内酰胺酶蛋白，从而获得氨苄青霉素抗性。
通过将lamB基因克隆入pEH1(Hashemzadeh-Bonehi，L.等人，1998)的多克隆位点来构建载体pMAL9.1。然后，将包含限制性位点FseI、SmaI和NotI的序列在氨基酸154后插入lamB。这样构建该插入的阅读框架，以使通过使用FseI和NotI的消化从质粒pMAL4.31切割的读框选择性DNA片段的转移产生lamB和各插入片段的连续阅读框架
通过将fhuA基因克隆入pBH1的多克隆位点来构建载体pHIE11。此后，将包含限制性位点FseI，XbaI和NotI的序列在氨基酸405之后插入flhuA。这样选择该插入的阅读框架，以使通过使用FseI和NotI的消化从质粒pMAL4.31切割的产生读框选择性DNA片段的转移产生fhuA和各插入片段的连续阅读框架。
用于读框选择的文库的克隆和估计
将基因组广义布氏疏螺旋体DNA片段连接入载体pMAL4.31的SmaI位点。通过电穿孔将重组DNA导入DH10B电感受态(electrocompetent)大肠杆菌细胞(GIBCO BRL)，然后将转化子涂板在含有卡那霉素(50μg/ml)和氨苄青霉素(50μg/ml)的LB-琼脂板上。将板在37℃下温育过夜，收集菌落以用于大规模DNA提取。将代表性板贮藏和保存以用于收集菌落的菌落PCR分析和大规模测序。简单菌落PCR测定法用于初步确定大致的片段大小分布和插入效率。根据测序数据，估计精确的片段大小、插入位点上接头的完整性以及读框选择的精确度(3n+1 rule)。
细菌表面展示的文库的克隆和估计
使用限制性酶FseI和NotI从pMAL4.31载体切取包含广义布氏疏螺旋体文库的基因组DNA片段。然后将整个片段群体转移入已用FseI和NotI消化的质粒pMAL9.1(LamB)或pH1E11(FhuA)。通过使用这两个识别8bp富含GC的序列的限制性酶，将在pMAL4.31载体中选择的阅读框架保持在每一个平台载体中。然后通过电穿孔将质粒文库转化入大肠杆菌DH5α细胞内。将细胞涂板在含有50g/ml卡那霉素的LB-琼脂板上，然后在37℃下培养过夜以产生清晰可见的单个菌落的密度。然后将细胞刮离这些板的表面，用新鲜LB培养基洗涤，以等分的形式于-80℃下贮存以待文库筛选。
结果
用于读框选择的文库
对于阿氏疏螺旋体株系K78在pMAL4.31载体中产生分别具有大约70和300bp大小的两个文库。对于每一个文库，大约1μgpMAL4.31质粒DNA和50ng片段化的基因组阿氏疏螺旋体DNA的连接和随后的转化在框架选择后产生8x104-2x105个克隆。为了估计文库的随机性，对每一个文库的500-600个随机选择的克隆进行测序。两个文库(LBA-50和LBA-300)的代表性生物信息学分析显示：在相应于这些文库的克隆中，只有非常少的克隆出现多次。此外，对于LBA-50文库，显示平均插入大小为51bp，非常接近预期的插入大小(图2A)。关于LBA-300文库，平均插入大小为170bp，比预期的插入大小略短(图2B)。？
细菌表面展示文库
肽在大肠杆菌表面上的展示需要将插入片段从来自读框选择载体的pMAL4.31的LBA-50和LBA-300文库转移至展示质粒pMAL9.1(LamB)或pHIE11(FhuA)。使用FseI和NotI限制性切割基因组DNA片段，5ng插入片段与0.1μg质粒DNA的连接和随后转化至DH5α细胞，产生2x105-5x105个克隆。从LB板上刮取细胞，然后冷冻而不进一步扩增。
实施例4：使用细菌表面展示的基因组文库和人血清进行的来自广义布氏疏螺旋体的高免疫原性肽序列的鉴定。
实验方法
MACS筛选
将来自给定文库的大约2.5x108个细胞在37℃下培养在5ml含有50g/ml卡那霉素的LB培养基中2小时。通过加入1mM IPTG诱导表达，进行30分钟。用新鲜LB培养基洗涤细胞两次，将大约2x107个细胞重悬浮于100μl的LB培养基中，然后转入Eppendorf管。将10至20μg生物素化的从血清中纯化的人IgG加入细胞，在轻微振荡的条件下将悬浮物在4℃下温育过夜。加入900μl的LB培养基，混合悬浮物，随后以6,000rpm在4℃下离心10分钟。细胞用1ml的LB洗涤一次，然后重悬浮于100μl的LB培养基。加入10μl偶联至链霉抗生物素蛋白的MACS小珠(Miltenyi Biotech，Germany)，在4℃下继续温育20分钟。然后加入900μl的LB培养基，将MACS小珠细胞悬浮物加在被回定至磁铁的经平衡的MS柱(Miltenyi Biotech，Germany)上。(通过用1ml的70％EtOH洗涤一次和用2ml的LB培养基洗涤两次平衡MS柱。)
然后用3ml的LB培养基洗涤柱子三次。在取出磁铁后，通过用2ml的LB培养基洗涤来洗脱细胞。在用3ml的LB培养基洗涤柱子后，第二次将2ml洗脱物加在相同的柱子上，重复洗涤和洗脱步骤。第三次进行上样、洗涤和洗脱步骤，从而产生2ml的终洗脱物。
将在两轮选择后选择的细胞涂板在含有50μg/ml卡那霉素的LB-琼脂板上，在37℃下培养过夜。
通过测序和Western印迹分析进行的选择的克隆的评估
将随机选择的克隆在37℃于含有50μg/ml卡那霉素的3ml LB培养基中培养过夜，以使用标准方法来制备质粒DNA。在MWG(Germany)进行测序。
关于Western印迹分析，将大约10-20μg总细胞蛋白通过10％SDS-PAGE进行分离，然后转印至HybondC膜(Amersham PharmaciaBiotech，England)上。使用以大约1∶3,000-1∶5,000稀释的人血清作为一抗体和以1∶5,000稀释的偶联至HRP的抗人IgG抗体作为第二抗体来检测LamB或FhuA融合蛋白。使用ECL检测试剂盒(AmershamPharmacia Biotech，England)进行检测。备选地，将兔抗-FhuA或兔抗-LamB多克隆免疫血清用作一抗与各自的偶联至HRP的第二抗体一起用于融合蛋白的检测。
结果
通过使用生物素化的Ig的磁性激活的细胞分选术(MACS)进行的细菌表面展示文库的筛选。
使用生物素化的从莱姆疏螺旋体病患者的血清(P1755、P1766、P1772、P1806、P1811、P3055、P3144、P3186、P3219、P3077、P3084、P3286、P3288、P3337、P3016、P3150、P3301、P3344、P3394、P3183、P3209、P3336、P3120、P3239、P3251)制备的人IgG筛选pMAL9.1中的文库K78-LamB和pHIE11中的K78-FhuA(参见实施例1：来自人血清的抗体的制备)。如在实验方法所述进行选择方法。图3A显示使用K78-FhuA文库和EM-IgG进行的筛选的代表性实例。如在从MACS筛选的第一轮选择后通过菌落计数可看到的，结束时回收的细胞的总数目急剧地从1x107个细胞减少至大约3x104个细胞，不使用抗体的选择显示更显著的细胞数目的减少，这表明选择依赖于广义布氏疏螺旋体特异性抗体(图3A)。为了估计筛选的效能，随机挑拣20个选择的克隆，将其经历使用筛选EM-IgG库的免疫印迹分析(图3B)。该分析显示，大部分选择的克隆显示与存在于相关血清中的抗体的反应性，然而表达FhuA而无阿氏疏螺旋体特异性插入片段的对照不与相同的血清反应。通常，观察到反应性的比例在40至70％范围内。菌落PCR分析显示所有选择的克隆都包含预期的大小范围内的插入片段。
在使用来自其他血清库的文库的筛选中观察到类似的结果。作为第二实例，图3C和D显示了使用大插入片段K78-FhuA和LA-IgG抗体库获得的数据。一轮MACS选择导致细胞只在特异性IgG存在而其非不存在的情况下富集(图3C)，这表明选择对于使用的抗体是特异性的。然后在使用相同的LA-IgG抗体库的单个细菌菌落的Western印迹分析中确认该特异性选择(图3D)。
更大量的来自每一次筛选的随机挑拣的克隆(600至800个)的随后测序导致被用于筛选的人血清抗体特异性识别的基因和相应的肽或蛋白质序列被鉴定。特异性克隆被选择的频率至少部分反映血清中用于选择和识别由该克隆呈递的表位的特异性抗体的丰度和/或亲和力。在这点上，令人惊讶的是，来源于一些ORF(例如BAP001和BAP024)的克隆被挑拣超过100次，表明它们的高免疫原性特性。表1概述了获得的关于所有12个进行的筛选的数据。表1中所示的所有克隆已经通过使用来自单克隆的完整细胞提取物的免疫印迹分析验证，显示与用于各筛选的人血清库的指定的反应性。如可从表1看到的，相同ORF的不同区域被鉴定为免疫原性的，因为蛋白质的大小变化的片段通过平台蛋白展示于表面。由于阿氏疏螺旋体的基因组序列在进行筛选时是不可获得的，因而首先使用来自狭义布氏疏螺旋体的基因组序列，然后使用来自嘎氏疏螺旋体的基因组序列进行使用来源于阿氏疏螺旋体筛选的表位的所有BLAST分析。表1展示了来源于阿氏疏螺旋体K78基因组的最初注释的阿氏疏螺旋体ORF名称，质粒来源的ORF按年代顺序编号。
值得进一步注意的是，许多通过细菌表面展示筛选鉴定的基因编码被附着至细菌表面的蛋白质。这与表面附着蛋白在广义布氏疏螺旋体的毒性中的预期作用相符。
实施例5：使用从阿氏疏螺旋体K 78鉴定的高免疫原性蛋白进行的基因分布研究
实验方法
通过PCR进行的抗原的基因分布
理想的疫苗抗原将是存在于疫苗针对的靶生物的所有或绝大部分株系中的抗原。为了确定编码鉴定的阿氏疏螺旋体K78抗原的基因是否明确地发生在相关株系中，使用对于目的基因是特异性的引物对一系列独立的细菌分离株进行PCR。获得包括如表3中所示最频繁存在于患者中的ospC型的广义布氏疏螺旋体分离株。设计作为引物的寡核苷酸序列以使所有鉴定的ORF产生大约1,000bp的产物，如果可能包括所有鉴定的免疫原性表位。如根据实施例2如所述制备所有广义布氏疏螺旋体株系的基因组DNA。按照厂商说明书(Invitrogen，TheNetherlands)，使用Taq聚合酶(1U)，200nM dNTPs，10pMol各寡核苷酸和试剂盒在25μl的反应体积中进行PCR。作为标准，进行个30循环(1x：5分钟95℃，30x：30秒95℃，30秒56℃，30秒72℃，1x4分钟72℃)，除非条件必须适合单个引物对。
结果
就鉴定的编码免疫原性蛋白的基因在30个不同广义布氏疏螺旋体株系中的存在，通过PCR对所述基因进行检测(表3)。例如，图4显示使用所有指定的30个株系进行的对于阿氏疏螺旋体BAP004的PCR反应。如清楚可见的，所述基因存在于所有分析的株系中。使用选择的抗原的所有结果概述于表4。重要的是，一些鉴定的抗原在序列和大小上在各病原体的所有株系十分保守，从而是预防由广义布氏疏螺旋体引起的感染的新型疫苗候选物。
实施例6：用在大肠杆菌表面展示的、来自广义布氏疏螺旋体的高免疫原性蛋白质/肽免疫的小鼠获得的免疫血清的免疫原性
实验方法
来自小鼠的免疫血清的产生
将具有编码融合至阿氏疏螺旋体K78的肽的平台蛋白的质粒的大肠杆菌克隆培养在37℃下、含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中。以1∶10稀释过夜培养物，进行培养直至达到0.5的OD600，然后使用0.2mM的IPTG诱导2小时。将沉淀的细菌细胞重悬浮于PBS缓冲液，在冰上通过超声破裂细胞，从而产生粗制细胞提取物。根据OD600测量值，将相应于5x107个细胞的等分静脉内注射入NMRI小鼠，然后在2周后加强。在第二次注射后1周采集血清。通过肽ELISA测量表位特异性抗体水平。
结果
小鼠中的免疫原性
通过肽ELISA确定特异性抗体的存在，如在图5中举例说明并概述于表5中。显示由109个不同表位代表的来自广义布氏疏螺旋体的99个抗原在小鼠中具有免疫原性。这些实验确认了生物信息学预测：许多鉴定的表位/蛋白质不仅在人中而且还在实验动物中具有免疫原性。
实施例7：通过肽ELISA对来自阿氏疏螺旋体K78的肽的验证
酶联免疫吸附测定法(ELISA)
用在包衣缓冲液(0.1M碳酸钠pH9.2)中稀释的5-10μg/ml总蛋白包被ELISA板(Maxisorb，Millipore)。在PBS-BSA中进行血清的两个稀释(400X，2,000X)。按照厂商的推荐(稀释度：1,000x)使用高特异性辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗人IgG第二抗体(SouthernBiotech)。通过基于通过自动ELISA酶标仪(TECAN SUNRISE)读出的OD405nm读数测量底物(ABTS)至有色产物的转化来定量抗原-抗体复合物。将在400x稀释度下的测量值用于计算表6中显示的结果。
结果
人中的免疫原性
如表6中概述的，通过肽ELISA确定特异性抗体在人中的存在。用于该分析的人血清相应于用于通过细菌表面展示筛选进行的抗原鉴定的各种血清库中包括的血清。分析来自来源于阿氏疏螺旋体K78的个体抗原的单个或多个肽，显示这些肽中有许多在人中具有免疫原性。很明显，一些选择的肽与许多或所有研究的人血清(例如BAOba0565.02或BAOba0077.01)具有很高的反应性，然而其他肽显示中等反应性。关于对于选择的表位包含超过30个氨基酸的那些抗原，设计具有5至6个氨基酸的交叠的多个肽。对于一些抗原，观察到这些来自相同抗原的多个肽显示不同的反应性，进一步描绘了各抗原(例如BA0314或BA0546)免疫原性区域。这些实验证明了许多鉴定的表位/蛋白质在人中具有高度的免疫原性，这表明它们在感染过程中由病原体表达并且能够诱导很强的免疫反应。
实施例8：从使用在大肠杆菌表面展示的、来自阿氏疏螺旋体K78的高免疫原性蛋白/肽免疫的小鼠获得的免疫血清的对广义布氏疏螺旋体的表面结合。
实验方法
FACS分析
在34℃下培养阿氏疏螺旋体株系K78；通过暗视场显微镜检查确定螺旋体的数目，用新鲜BSK培养基稀释螺旋体至每毫升106个生物体。用新鲜BSK培养基(100μl)以1∶25稀释每一份小鼠血清，在56℃下进行热灭活30分钟。将100μl小鼠血清加入100μl(105个细胞)疏螺旋体悬浮物(血清最后以1∶50稀释)。轻轻混合测定悬浮物，在室温下温育1小时。在温育后，以5,000rpm离心样品3分钟，用1ml PBS，0.5％BSA洗涤一次。使用缀合有PE的抗小鼠抗体(所述抗体按照厂商说明书使用(稀释于100μl中))进行第二次染色。在冰上进行第二次染色45分钟。温育结束时，以5,000rpm离心样品3分钟，用1ml的PBS 0.5％BSA进行洗涤，重悬浮于1ml的PBS-1％多聚甲醛。将样品进行涡旋，通过流式细胞术进行分析。
结果
对广义布氏疏螺旋体细胞的表面结合
在FACS分析中检测识别阿氏疏螺旋体K78上的表面蛋白的抗体的存在。由40种不同血清代表的32种抗原在FACS分析中与缓冲液对照相比显示显著的转换(表7)。该体外实验表明体外培养的广义布氏疏螺旋体细胞的32种抗原在表面上表达。
实施例9：重组疏螺旋体属抗原诱导抗广义布氏疏螺旋体的针攻击(needle challenge)的保护性免疫反应。
实验方法
重组疏螺旋体蛋白质的克隆和表达
基因的克隆：
使用特异性引物通过PCR，从分离自阿氏疏螺旋体K78的基因组DAN扩增目基因。除了基因特异性部分外，引物还具有帮助定向克隆扩增的PCR产物的限制性位点。引物的基因退火(特异性)部分在15-30个碱基的长度范围内变化。用适当的限制性内切酶消化获得的PCR产物，将其克隆入用于His标记的蛋白的pET28b(+)载体(Novagen)。选择的抗原的构建体列于表8。当确认重组质粒包含目的基因后，转化用作表达宿主的大肠杆菌BL21 CodonPlus(DE3)-RIPL细胞(Invitrogen)。
蛋白质的表达和纯化
以所需培养体积将具有重组质粒的大肠杆菌BL21 CodonPlus(DE3)-RIPL细胞培养至对数生长期。当OD600nm达到0.6时，用0.5mM的IPTG在37℃下诱导培养物3小时。通过离心收集细胞，通过冻-融方法，然后用Bug-![]()
(Novagen)破裂细胞的组合来裂解细胞。通过离心将裂解物分离成可溶性(上清液)和不溶性(沉淀)级分。取决于蛋白质的定位，使用不同的纯化策略。
A)如果His标记的蛋白质在可溶性级分中，那么通过将上清液与Ni-Sepharose珠(Ni-SepharoseTM 6 Fast Flow，GE Healthcare)结合来进行蛋白质的纯化。由于在表达的蛋白质的C末端存在六组氨酸(6xHIS)，其结合Ni-Sepharose，然而其他污染性蛋白质被洗涤缓冲液从柱子洗涤掉。用在20mM NaH2PO4，0.5mM NaCl缓冲液pH 7.4中的500mM的咪唑洗脱蛋白质。浓缩洗脱物，通过Bradford测定蛋白质浓度，对其通过SDS-PAGE和Western印迹法进行检测。
B)如果蛋白质存在于不溶性级分，则将沉淀溶解在合适的包含8M尿素的缓冲液中，然后使用与上述相同的材料和方法在变性的条件(在包含8M尿素的缓冲液中)下用于Ni-NTA柱。污染性蛋白质被不含尿素的洗涤缓冲液从柱子洗涤掉。进行His标记的蛋白质的重折叠，同时将蛋白质固定在Ni-NTA基质上。复性后，通过加入500mM咪唑洗脱蛋白质。将洗脱物进行透析以除去痕量的尿素，如果体积大则进行浓缩，对其通过SDS-PAGE进行检测和通过Bradford法进行测量。
动物保护研究
动物：
使用C3H/HeN雌性小鼠(6-8周)。
主动免疫接种、超免疫小鼠血清的产生：
将50μg重组蛋白质经皮下注射入雌性C3H/HeN小鼠，以完全弗氏佐剂(CFA)作为佐剂。在第14和28天，使用相同量的蛋白质和不完全弗氏佐剂(IFA)对动物加强2次。公布的保护性OspA蛋白抗原用作阳性对照，使用PBS缓冲液中的单独的佐剂进行的免疫用作阴性对照(PBS)。在第35天，使用各自的重组蛋白通过ELISA测量抗体滴度。
细菌攻击：
在BSK-II培养基中新鲜培养的广义布氏疏螺旋体株系N40用作攻击株系。为了确定存在于细菌接种物中的存活细胞的数目，进行使用有限稀释的克隆。在34℃和5％CO2下，以理论上10、1.0或0.1个细胞/等分温育8个等分的2ml BSK-II。三周后，通过暗视场显微镜检查就活疏螺旋体细胞的存在评估等分。根据来自使用极限稀释的克隆的结果，第一稀释度中疏螺旋体细胞的最可能数目获自表9。将104个细胞皮下用于小鼠。通过在BSK-II培养基中培养来自耳和膀胱的疏螺旋体属细胞和通过使用Western印迹确定的血清转移确定通过免疫产生的保护作用(图6)。保护作用以未感染的动物的总数(10只小鼠/组)的百分数表示。
Western印迹法：
按照说明手册使用PAGE 4-20％ Tris-glycine ZOOM Gels 1 mm xIPG孔(Invitrogen)。将疏螺旋体属裂解物(25μg/样品)与5x还原样品缓冲液混合，在95℃下加热10分钟。PageRulerTM prestainedprotein ladder plus(MW 10-250kDa；Fermentas，Germany)用作蛋白质大小的指示剂。使用160V分离蛋白质，进行大约70分钟，凝胶进一步用于Western印迹。使用半干转移系统(semi-dry transfersystem)(Trans-![]()
SD；BioRad，U.S.A.)，将通过单相凝胶电泳分离的蛋白质转移至硝酸纤维素膜(HybondTM 0.45 Micron，AmershamBioscience，England)上。将凝胶和膜装配在印迹夹(blot sandwich)中并且在80mA下在室温下在转移缓冲液中印迹1小时。通过PonceauS(Sigma，Austria)染色显现印迹的蛋白质。通过在5％牛奶-PBS-T中在室温下温育膜1小时来封闭非特异性结合位点。用PBS-T溶液洗涤膜3次，每次15分钟，然后与一抗溶液(使用5％牛奶-PBS-T以1∶1,000稀释的单个小鼠血清)在室温下一起温育1小时。如上所述洗涤膜，然后将其与二抗溶液(来自Jackson Immuno ResearchLaboratory Inc.，U.S.A.的兔抗小鼠IgG-HRP；使用5％牛奶-PBS-T以1∶5,000稀释的)在室温下温育1小时。在检测前，用PBS-T洗涤膜3次，每次15分钟。使用ECL检测试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech，England)显现信号。
来自小鼠器官的疏螺旋体的培养：
在无菌条件下从小鼠获取器官(耳和膀胱)，将其转移至具有含有400μg/ml磷霉素和50μg/ml磺胺甲基异噁唑的10ml的BSK-II培养基的管中。将培养物在34℃，5％CO2下温育最长4周。就活疏螺旋体细胞的存在使用暗视场显微镜检查来检查培养物。
结果
在已用毒性狭义布氏疏螺旋体株系N40建立起疏螺旋体属动物模型后，评估体外选择的疫苗候选物的保护能力。在用狭义布氏疏螺旋体株系N40攻击之前，用使用CFA/IFA作为佐剂的重组抗原(表8)免疫小鼠。在攻击后四周，采集用于通过Western印迹分析确定血清转换的血清(图6)和用于通过在BSK-II培养基中的培养检测活疏螺旋体的器官。血清转换与来自小鼠器官的疏螺旋体的培养物之间的相关性为100％。在动物研究中鉴定了(表10)具有不同保护水平的几个抗原。将未感染小鼠的百分数与阴性对照组(用PBS中的单独的佐剂免疫的小鼠)(PBS)比较。保护抗原定义为其中免疫接种导致至少比PBS对照组中多一只未感染小鼠的抗原。
疫苗候选物的观察到的保护作用可描述为交叉保护作用，因为抗原的序列来源于与攻击株系不同的广义布氏疏螺旋体基因型群。从阿氏疏螺旋体株系K78克隆抗原，用于动物研究中的攻击株系是狭义布氏疏螺旋体株系N40。因此，对于与受试疫苗候选物的氨基酸序列的来源相同的基因型群阿氏疏螺旋体，预期存在更高的抗攻击株系的保护水平。
参考文献
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Altschul，S.，et al.(1990).Journal of Molecular Biology215：403-10.
Bennett，D.，et al.(1995).J Mol Recognit 8：52-8.
Burgdorfer，W.，et al.(1982).Science 216：1317-1319.
Casjens，S.，et.al.(2000).Mol.Mirobiol.35：490-516.
Clackson，T.，et al.(1991).Nature 352：624-8.
Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley and Sons，Inc.(1987).
Devereux，J.，et al.(1984).Nucleic acids research 12：387-95.
Doherty，E.，et al.(2001).Annu Rev Biophys Biomol Struct30：457-475.
Eisenbraun，M.，et al.(1993).DNA Cell Biol 12：791-7.
Etz，H.，et al.(2001).J Bacteriol 183：6924-35.
Fraser，C.，et al.(1997).Nature 390：580-586.
Ganz，T.(1999).Science 286：420-421.
Georgiou，G.(1997).Nature Biotechnology 15：29-34.
![]()
G.，et al，(2004).Nucleic acids research 32：6038-6046.
Hashemzadeh-Bonehi，L.，et al.(1998).Mol Microbiol 30：676-678.
Heinje，von G.(1987).Sequence Analysis in MolecularBiology，Academic Press.
Hemmer，B.，et al.(1999).Nat Med 5：1375-82.
Hornef，M.，et al.(2002).Nat Immunol 3：1033-40.
Johanson，K.，et al.(1995).J Biol Chem 270：9459-71.
Jones，P.，et al.(1986).Nature 321：522-5.
Kajava，A.，et al.(2000).J Bacteriol 182：2163-9.
Kohler，G.，et al.(1975).Nature 256：495-7.
Kolaskar，A.，et al.(1990).FEBS Lett 276：172-4.
Lewin，A.，et al.(2001).Trends Mol Med 7：221-8.
Livey I.et al.(1995).Mol Microbiol.18：257-69.
莱姆Disease Surveillance(2004).MMWR 53：365-369.
Marks，J.，et al.(1992).Biotechnology(NY)10：779-83.
McCafferty，J.，et al.(1990).Nature 348：552-4.
Norman，R.L.and Kempe，L.L.(1960).J.Biochem.Microbiol.Technol.Engng.2：157-163.
Okano，H.，et al.(1991).J Neurochem 56：560-7.
Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of GeneExpression；CRC Press，Boca Raton，FL(1988).
Rammensee，H.，et al.(1999).Immunogenetics 50：213-9.
Report of WHO workshop on莱姆borreliosis and Diagnosisand surveillance(1995).WHO/CDS/VPH/95 141.
Seeger，C.，et al.(1984).Proc Natl Acad Sci USA81：5849-52.
Skerra，A.(1994).Gene 151：131-5.
Steere，A.C.，et al.(1977).Arthritis Rheum.20：7-17.
Steere，A.C.(1989).New England Journal of Medicine 321：586-596.
Surveillance of莱姆borreliosis in Germany，2002 and 2003(2005).Euro Surveill.10：83-85.
Tang，D.，et al.(1992).Nature 356：152-4.
Tempest，P.，et al.(1991).Biotechnology(NY)9：266-71.
Tourdot，S.，et al.(2000).Eur J Immunol 30：3411-21.
Wilske B.et al.(1988).Ann NY Acad Sci.539：126-43.
Xu，Y.，et al.(1995).J.Clin.Microbiol.33：2679-2685.
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