与水稻抗白叶枯病基因紧密连锁的分子标记SV3.pdf

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510420998.5 (22)申请日 2015.07.16 C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 1/21(2006.01) (71)申请人 深圳华大农业与循环经济科技有限 公司 地址 518083 广东省深圳市盐田区北山道 146 号北山工业区综合楼科技创业园 604 申请人 深圳华大基因研究院 (72)发明人 倪雪梅 蔡雪梅 雷雪静 张荣 黄聪 (54) 发明名称 与水稻抗白叶枯病基因紧密连锁的分子标记 SV3 (57) 摘要 本发明属于。

2、分子生物学领域， 涉及一种分子 标记， 具体的， 涉及一种与水稻抗白叶枯病基因紧 密连锁的分子标记， 该分子标记含有Seq ID No.1 所示序列。 本发明还涉及扩增该分子标记的引物、 该分子标记和引物在水稻抗白叶枯病基因定位或 水稻遗传育种中的用途， 以及一种水稻育种方法。 本发明的分子标记将基因组 DNA 序列与水稻抗白 叶枯病基因联系起来， 有利于水稻分子标记辅助 育种体系的建立 ； 所述分子标记与水稻抗白叶枯 病基因的遗传紧密连锁距离为 0.5cM。本发明的 分子标记及分子标记扩增引物可以简便、 快速、 高 通量地应用于水稻育种实践和资源及品种鉴定。 (51)Int.Cl. (19)。

3、中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书9页 序列表2页 附图1页 CN 106350515 A 2017.01.25 CN 106350515 A 1/1 页 2 1.一种与水稻抗白叶枯病基因紧密连锁的分子标记， 其特征在于 ： 所述分子标记含有 Seq ID No.1 所示序列 ； 优选的， 所述分子标记为 Seq ID No.1 所示序列。 2.一种可用于扩增与水稻抗白叶枯病基因紧密连锁的分子标记的引物对， 其特征在 于扩增的目标序列包含 Seq ID No.1 所示序列 ； 具体地， 所述引物对的引物 1 包含 Seq ID No.2 所示序列， 引物。

4、 2 包含 Seq ID No.3 所示序列 ； 更具体地， 引物 1 为 Seq ID No.2 所示 序列， 引物 2 为 Seq ID No.3 所示序列。 3.一种筛选权利要求1所述的分子标记的方法， 其特征在于 ： 1)获得纯合型父本、 母本 基因组 ； 2) 分别测序获得父本、 母本基因组序列 ； 3) 比较父本、 母本基因组序列， 获得差异 位点 ； 4) 构建遗传群体并收集表型数据 ； 5) 对群体中的个体进行基因型分析 ； 6) 结合基因 型和表型数据， 将目标基因定位在基因组上 ； 7) 在靠近目标基因的区段选择候选的分子标 记。 4.根据权利要求 3 所述分子标记的筛选方。

5、法， 其特征在于在候选的分子标记的上下游 设计引物， 进行 PCR 扩增 ； 优选的， 所述引物为权利要求 2 所述的引物对。 5.权利要求 1 所述的分子标记的检测方法， 包括步骤 ： 在权利要求 1 的分子标记的核 苷酸序列的上下游设计引物 ； 以被检测水稻基因组 DNA 为模板进行扩增 ； 判断扩增产物中 是否存在该分子标记 ； 优选的， 所述引物为权利要求 2 所述的引物对。 6.一种载体， 其特征在于 ： 含有权利要求 1 所述的分子标记。 7.一种重组细胞， 其特征在于 ： 含有权利要求 7 所述的载体。 8.权利要求1所述的分子标记或权利要求2的分子标记引物对在水稻辅助育种或者水。

6、 稻抗白叶枯病基因定位或检测中的用途。 9.一种水稻抗白叶枯病基因定位的方法， 其特征在于 ： 所述方法包括使用权利要求 1 中所述的分子标记或权利要求 2 的分子标记引物对的步骤。 10.一种水稻辅助育种方法， 其特征在于 ： 所述方法包括检测权利要求 1 中所述的分子 标记或用权利要求 2 的分子标记引物对进行检测的步骤。 权 利 要 求 书 CN 106350515 A 2 1/9 页 3 与水稻抗白叶枯病基因紧密连锁的分子标记 SV3 技术领域 0001 本发明属于分子生物学领域， 涉及一种分子标记， 特别是涉及一种与水稻抗白叶 枯病基因紧密连锁的分子标记。本发明还涉及扩增该分子标记的。

7、引物、 该分子标记和引物 在水稻抗白叶枯病基因定位或水稻遗传育种中的用途。 背景技术 0002 水稻 (Oryza sativa) 是我国最重要的粮食作物之一， 稻谷是我国 60以上人口 的主食。因此， 水稻生产水平的提高一直是关系我国农业发展和民生安定的重大问题。 0003 水稻白叶枯病是一种世界性的重要病害。 它是一种维管束病害， 在自然条件下， 病 菌通常由水孔或伤口侵入， 沿叶脉产生白色病斑。白叶枯病发生时可导致水稻减产 20 30， 严重时甚至绝收。 为保证水稻高产、 稳产， 人们主要采用两种防治技术， 一是用化学防 治方法， 二是培育和种植抗病品种。 由于化学防治成本高且污染环境，。

8、 因此培育和种植抗病 品种成为水稻育种的主要目标。 0004 传统抗病育种是根据分离群体的表现和育种者的经验进行选择， 通常受环境条 件、 显隐性关系、 基因上位等因素的影响， 费时、 费力、 不准确， 从鉴定一个植物抗病种到培 育出抗病良种需花费十多年时间， 而病原菌一旦侵袭， 其扩散速度要比育种速度快得多。 0005 近年来生物技术的发展， 尤其是分子标记技术的应用给水稻遗传育种带来了巨大 变化。分子标记辅助选择为育种者提供了对目标性状进行选择的有效手段， 它大大加速了 育种进程， 提高了育种选择效率， 同时减少了盲目选择和人力、 物力的大量浪费， 展示出极 其广阔的应用前景。 0006 。

9、目 前 已 鉴 定 的 抗 白 叶 枯 病 基 因 达 30 多 个， 来 自 长 药 野 生 稻 (Oryza longistaminata)的广谱抗白叶枯病Xa21基因和普通野生稻O.rufipogon的全生育期抗白 叶枯病 Xa23 基因备受关注。 0007 目前， 虽然已经定位了一些与水稻抗白叶枯病相关的基因和 QTLs， 但由于水稻抗 白叶枯病的遗传机制较复杂， 仍然缺乏足够数量的与抗白叶枯病相关的 QTLs 及分子标记。 随着基因组学和生物信息的发展， 通过基因组测序， 开发与抗白叶枯病紧密连锁的 SV 标 记， 将为水稻的遗传研究及育种开辟新的思路和方法。 发明内容 0008 本。

10、发明的目的是提供一种与水稻抗白叶枯病基因紧密连锁的分子标记。 0009 本发明的另一目的是提供一种可用于扩增与水稻抗白叶枯病基因紧密连锁的分 子标记的引物对。 0010 本发明的另一目的是提供一种筛选水稻抗白叶枯病基因紧密连锁的分子标记的 方法， 其特征在于 ： 1) 获得纯合型父本、 母本基因组 ； 2) 分别测序获得父本、 母本基因组序 列 ； 3) 比较父本、 母本基因组序列， 获得差异位点 ； 4) 构建遗传群体并收集表型数据 ； 5) 对 群体中的个体进行基因型分析 ； 6) 结合基因型和表型数据， 将目标基因定位在基因组上 ； 说 明 书 CN 106350515 A 3 2/9 。

11、页 4 7)在靠近目标基因的区段选择候选的分子标记。 对筛选的水稻抗白叶枯病分子标记进一步 做多态性及稳定性鉴定 ： 在筛选的分子标记的上下游设计引物， 进行 PCR 扩增， 通过条带的 不同进行多态性判断 ； 利用重组自交系进行稳定性验证。 0011 本发明的目的还包括一种水稻抗白叶枯病紧密连锁的分子标记的检测方法， 包括 步骤 ： 在分子标记的核苷酸序列的上下游设计引物 ； 以被检测水稻基因组 DNA 为模板进行 扩增 ； 判断扩增产物中是否存在该分子标记。 0012 本发明的目的还包括提供一种包括上述分子标记的重组载体， 以及含有该重组载 体的重组细胞。 0013 本发明的目的目的还包括。

12、提供上述分子标记在水稻抗白叶枯病基因定位、 检测以 及水稻辅助育种中的用途以及上述分子标记的检测方法。 0014 为了实现上述目的， 本发明采用了以下技术方案 ： 0015 本发明公开了一种与水稻抗白叶枯病基因紧密连锁的分子标记， 所述分子标记包 含 Seq ID No.1 所示序列 ； 优选的所述分子标记具有 Seq ID No.1 所示序列。 0016 本发明还公开了一种用于扩增与水稻抗白叶枯病基因紧密连锁的分子标记的引 物对， 所述引物对扩增的目标序列 Seq ID No.1 所示序列。具体地， 所述引物对的引物 1 包 含 Seq ID No.2 所示序列， 引物 2 包含 Seq I。

13、D No.3 所示序列 ； 更具体地， 所述引物 1 具有 Seq ID No.2 所示序列， 引物 2 具有 Seq ID No.3 所示序列 ； 0017 本发明公开了一种筛选权利要求水稻抗白叶枯病分子标记的方法， 其特征在于 ： 1) 获得纯合型父本、 母本基因组 ； 2) 分别测序获得父本、 母本基因组序列 ； 3) 比较父本、 母 本基因组系列， 获得差异位点 ； 4) 构建遗传群体并收集表型数据 ； 5) 对群体中的个体进行 基因型分析 ； 6) 结合基因型和表型数据， 将目标基因定位在基因组上 ； 7) 在靠近目标基因 的区段选择候选的分子标记。 对筛选的水稻抗白叶枯病分子标记进。

14、一步做多态性及稳定性 鉴定 ： 在筛选的分子标记的上下游设计引物， 进行 PCR 扩增， 通过条带的不同进行多态性判 断 ； 利用重组自交系进行稳定性验证。为了进一步验证抗白叶枯病这种表型与分子标记间 的对应关系， 公开了水稻白叶枯病菌接种实验结果。本发明还公开了一种与水稻抗白叶枯 病基因紧密连锁的分子标记， 所述分子标记是由上述的引物对以抗白叶枯病的水稻基因组 DNA 为模板经 PCR 扩增得到的。 0018 本发明还公开了一种与水稻抗白叶枯病基因紧密连锁的分子标记检测方法， 包括 步骤 ： 在分子标记Seq ID No.1的核苷酸序列上下游设计引物， 以被检测水稻基因组DNA为 模板进行扩。

15、增， 利用相同的引物对扩增的结果中抗白叶枯病的水稻比不抗白叶枯病的扩增 分子大 382bp， 此分子大小为分子标记的大小。利用优选的引物 Seq ID No.2， Seq ID No.3 扩增抗白叶枯病的水稻与不抗白叶枯病的水稻基因组， 扩增产物的大小分别为 985bp、 603bp。 0019 在本发明的一个实施方案中， 公开了用 3730 测序仪对各扩增产物进行测序验证 的方法， 所以本领域技术人员可理解， 为了检测 Seq ID No.1 分子标记， 在进行 PCR 扩增后 可用电泳检测也可利用测序的方法进行检测。本领域的技术人员可以理解， 检测分子标记 序列是否存在的方法不局限于PCR。

16、凝胶电泳、 测序， 荧光定量PCR等方法亦可进行目标序列 检测。 本领域的技术人员也可以理解， 检测目标序列的引物设计不局限与给出的引物序列， 在目标序列的上下游设计引物进行 PCR 扩增， 能达到凝胶电泳检测、 或者测序或者荧光定 说 明 书 CN 106350515 A 4 3/9 页 5 量 PCR 检测的目的即可。 0020 本发明还公开了一种载体， 其含有本发明的分子标记。所述载体可以是插入有本 发明的分子标记的表达重组载体或者克隆重组载体。获得上述重组载体后， 本领域技术人 员可以理解， 含有分子标记的片段的大小随着引物设计位置的不同而不同， 同时本领域技 术人员可以理解， 根据不。

17、同的需要， 将重组载体转化到合适的细胞中， 得到含有该重组载体 的重组细胞。因此， 本发明还公开了一种含有所述重组载体的重组细胞。 0021 在本发明的一个实施方案中， 所述分子标记 ( 含有 Seq ID No.1 所示核苷酸序列 的 DNA 片段 ) 所包含的 Seq ID No.1 的 5 端和 / 或 3 端可操作地连接有人工序列和 / 或 控制序列， 例如启动子、 增强子、 终止子、 酶切位点、 引物序列等等。其中， 术语 “可操作地” 在本发明中定义为一种如下构象， 在该构象中， 控制序列例如启动子被适当地置于 Seq ID No.1 的一个位置上， 以致该控制序列指导 Seq I。

18、D No.1 编码的多肽的产生。 0022 在本发明的一个实施方案中， 所述分子标记包含 Seq ID No.1 所示序列以及 Seq ID No.1 的 5 端和 / 或 3 端的上下游序列。本领域技术人员可以理解， 只要扩增或者检 测抗白叶枯病的水稻基因组 DNA 中的该分子标记， 必然能够检测或扩增得到含有 Seq ID No.1 所示的序列。Seq ID No.1 的 5 端和 / 或 3 端的上下游序列的长度为适当长度， 并 不特别限定， 例如， 满足分子标记的长度小于 10,000bp、 小于 5,000bp、 小于 2,000bp、 小于 1,500bp、 小于 1,200bp、。

19、 小于 1,000bp、 或者小于 800bp。 0023 本发明还公开了所述分子标记的制备方法， 包括下述步骤 ： 使用抗白叶枯病的水 稻的基因组 DNA 作为模板， 以 Seq ID No.2 和 Seq ID No.3 引物对进行 PCR 扩增， 得到的 985bp 扩增产物即含有所述分子标记 ； 优选地， 还包括将 PCR 扩增产物进行纯化的步骤。本 领域的技术人员可理解含有分子的标记的 PCR 产物大小随引物设计位置的改变而改变。 0024 对本领域技术人员而言， 可以理解， 也可以 DNA 化学合成的方法得到本发明的分 子标记。 0025 本发明还公开了所述的分子标记在水稻抗白叶枯。

20、病基因定位或检测中的用途。 0026 本发明还公开了一种水稻抗白叶枯病基因定位的方法， 所述方法包括使用本发明 的分子标记的步骤。 0027 本发明还公开了所述的分子标记在水稻辅助育种中的用途。 0028 本发明还公开了一种水稻辅助育种方法， 所述方法包括检测本发明的分子标记或 分子标记引物对的步骤。 0029 本发明的分子标记可用于今后的分子标记辅助育种中， 本领域技术人员可以理 解， 比如通过检测是否存在本发明的分子标记来筛选水稻是否含有抗白叶枯病基因。所述 检测可以是 PCR 检测的方法， 具体地， 可以使用上述的本发明的分子标记的引物对。所述检 测还可以通过测序方法进行。该水稻辅助育种。

21、方法具有简便、 快速、 高通量的优点。 0030 在本发明中， 具体地， 所述水稻为801， 抗白叶枯病 ； R15， 不抗白叶枯病。 801和R15 的杂交后代为 F1。F1 代通过单粒传法得到的重组自交系为 RIL 群体， 即 F7 代。 0031 有益效果 0032 本发明提供了与水稻抗白叶枯病基因紧密连锁的分子标记， 该分子标记将基因组 DNA 序列与水稻抗白叶枯病基因联系起来， 有利于水稻分子标记辅助育种体系的建立 ； 所 述分子标记与水稻抗白叶枯病基因的遗传紧密连锁距离为 0.5cM。本发明的分子标记及分 说 明 书 CN 106350515 A 5 4/9 页 6 子标记扩增引物。

22、可以简便、 快速、 高通量地应用于水稻育种实践和资源及品种鉴定。 附图说明 0033 图 1 ： 利用分子标记引物 (Seq ID No.2 和 Seq ID No.3) 对父母本和 RIL 群体 188 个水稻单株进行 PCR 扩增的扩增产物的部分电泳结果图。其中 ： 0034 泳道 1 5 为 RIL 群体中 5 株抗白叶枯病的水稻单株的 PCR 扩增产物 ； 泳道 7 11 为 RIL 群体中 5 株不抗白叶枯病的水稻单株的 PCR 扩增产物。泳道 6 为 marker， 其为 2000bp DNA Ladder ； 其分子量包括 ： 、 2000bp、 1000bp、 750bp、 5。

23、00bp、 200bp 以及 100bp。 0035 术语 0036 如本文所用， 分子标记 (Molecular Markers) 是指能反映生物个体或种群间基因 组中某种差异的特异性 DNA 片段， 是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标 记， 是 DNA 水平遗传多态性的直接的反映。 具体实施方式 0037 下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步详细说明。 以下实施例仅仅对 本发明进行进一步的说明， 不应理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件 的， 按照本领域内的文献所描述的技术或条件 ( 例如参考 J. 萨姆布鲁克等著， 黄培堂等译 的 分子克隆实验指南 ，。

24、 第三版， 科学出版社 ) 或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器 未注明生产厂商者， 均为可以通过市购获得的常规产品， 例如可以采购自 Illumina 公司。 0038 实施例 1 ： 水稻 RIL 群体的构建 0039 水稻种子购自 ： 深圳华大农业与循环经济科技有限公司。 0040 父本 ： 801， 抗白叶枯病 ； 0041 母本 ： R15， 不抗白叶枯病 ； 0042 父本和母本杂交得到 F1 代 ； 0043 F1 代通过单粒传代法得到 188 个重组自交系 RIL 群体 (F7 代 )。 0044 实施例 2 ： 水稻白叶枯病菌接种鉴定 0045 选用湖南省水稻白叶枯病菌优势。

25、致病型 IV 型菌的代表菌株 ( 由湖南杂交水稻研 究中心赠送 )。将菌株用胁本哲氏马铃薯半合成培养基 28恒温下培养 72 小时， 用无菌水 洗下菌苔， 用麦式比浊法将细菌悬液稀释至 108 109 细胞 / 亳升菌液。培养基配方 ： 马铃 薯 300 克， 蔗糖 15 克， 蛋白胨 5 克， Ca(NO3)2.4H2O 0.5 克， Na2HPO4.12H2O 2.0 克， 琼脂粉 16 克， 蒸馏水调至 1000 亳升。 0046 针对实施例1中获得的RIL群体， 在植株苗期采用人工剪叶接种法进行接种， 接种 后 14 20d， 待感病品种病情趋于稳定时调查， 用病斑面积占叶片面积的百分。

26、率作为抗感 反应参数。本试验以 15为抗感界限， 15为感病， 10 15为抗病， 10为高抗。 0047 接种结果 ： 双亲与 RIL 群体的抗病性表现 0048 白叶枯病菌菌液接种 20d 后， 父本 801 的平均病斑长度为 4.3cm， 对白叶枯病表现 为抗性反应。母本 R15 的平均病斑长度达到 22.4cm， 是典型的感病反应。188 个重组自交 系接种后， 其叶片的病斑长度从最短 2.8cm 至最长 23.6cm， 在群体内呈连续的正态分布， 其 平均值为 6.13cm， 双向的超亲分离极其明显， 并且分布区间广泛， 表现出数量性状的遗传特 说 明 书 CN 106350515 。

27、A 6 5/9 页 7 点。 0049 根据接种结果将 RIL 群体分为抗白叶枯病和不抗白叶枯病单株。 0050 实施例 3 ： 基因组 DNA 的提取 0051 用 CTAB 法分别提取父本、 母本、 F1 代及 RIL 群体单株的基因组 DNA， 具体方法如 下 ： 0052 (1) 称取 1.0g 新鲜叶片， 剪碎放入研钵， 用液氮研磨后加入 3mL 1.5CTAB， 研磨 成匀浆转入 15mL 的离心管中， 然后往研钵中加入 1mL 1.5CTAB 冲洗再转入离心管中。混 匀后于 65水浴 30min， 期间不时缓慢摇匀。 0053 其中 1.5CTAB 配方如下 (1L) ： 005。

28、4 CTAB15g 1mol/L 的 Tris.Cl(pH 为75mL 0055 8.0) 0.5mol/L 的 EDTA30mL NaCl61.4g 0056 加去离子水定容至 1L， 使用前加入终浓度为 0.2 (2ml) 的巯基乙醇。 0057 (2) 待冷却至室温， 加入等体积氯仿 / 异戊醇 (24 ： 1)， 轻轻混匀， 至下层液变为深 绿色。 0058 (3)4200rpm 离心 10min， 将上层水相移到新的 15mL 离心管， 加 2 倍体积预冷的无 水乙醇， 混合静止 5min。于 -20放置 30min 沉淀 DNA。 0059 (4)4200rpm 离心 10min，。

29、 弃掉上清， 加入 1mL 75乙醇洗涤沉淀 1 次， 倒置离心管 干燥 DNA， 加入 200L TE 溶解 DNA。 0060 (5) 用 0.8的琼脂糖凝胶检测基因组 DNA。 0061 (6) 将得到的父本、 母本、 F1 代及 RIL 群体单株的基因组 DNA 存于 -20备用。 0062 实施例 4 ： 遗传图谱构建、 基因定位和分子标记开发 0063 (1) 遗传图谱构建 0064 针对实施例 3 中获得的 RIL 个体的基因组 DNA， 利用 RAD-seq(http:/www.bioon. 基因分型， 获得 RIL 群体的基因型数据。 0065 用 MapMaker 3.0 。

30、软件 (Constructing genetic maps with MAPMAKER/EXP 3.0， S Lincoln,M Daly,E Lander-Cambridge,MA:Whitehead Institute,1992) 进行遗传连锁图 谱绘制， 得到遗传连锁图。 0066 (2) 基因定位 0067 针对实施例 2 中 RIL 群体， 将个体表型与父本型性状相似的记为 a， 与母本型性状 相似的记为 b， 性状居于父本和母本之间的记为 h。得到全部个体的表型数据， 将个体的表 说 明 书 CN 106350515 A 7 6/9 页 8 型数据与之前得到的基因型数据进行比较， 。

31、从而将水稻抗白叶枯病基因定位在遗传连锁图 谱上。结果显示， 水稻抗白叶枯病基因定位在 11 号染色体 20802924bp 至 20806518bp 区间 内， 长度约为 3594bp。 0068 (3) 分子标记开发 0069 将父本和母本分别进行全基因组重测序 (10X)， 然后根据 RAD-seq 的测序结果， 利 用 SOAP 软件 ( 也可以使用其它的序列比对软件 ) 比对测 序 reads， 然后用 SOAPsv( 寻找父母本基因组片段序列差 异较大的作为分子标记， 便于用凝胶电泳区分鉴别。 0070 选择靠近水稻抗白叶枯病基因所在区段的 382bp 差异序列作为候选分子标记 SV。

32、3， 核苷酸序列如 Seq ID No.1 所示。 0071 Seq ID No.1 ： 0072 AGAGATGAGAGTGATCAGCTATGTACTGACTGCTTAAGAGTATATAGATGCAAGAGATGAAGGGCCTGT TCACTTTGATGCCATTTTCAACCTTACCAAATTTTAGTAAAGTTGCTAAAAAAATGGCTATATTTAGTTTGCTGTCA AATTTTGGTAACTATATAAGAAATCCTGCCAAAATTTTGATAACTATGCCAAAATTTGGTAAGGTTTTTTTTTGGCA TCAAAGTGAACAGGCCCGAAAACT。

33、ATATGATTGTATAAATTGCTACATTGCTTGCCTACCGGCAAGATTGGAGTGAT CAAGGTTTATAACCACAGAACAGTAGTGAACAGTCAGGGTTGCACAATTGCACTTGTCTTTCACAACAAATGCAGAT AAAAA 0073 (382bp) 0074 实施例 5 ： 候选分子标记验证 0075 对实施例4中确定的水稻抗白叶枯病候选分子标记SV3(SEQ ID NO ： 1所示的核酸 序列 ) 进行验证， 具体如下 ： 0076 针对上述候选分子标记设计引物， 引物序列如下所示 ： 0077 正向引物 :5 -GCTTGTGCACAGC。

34、CACTTTG-3 (SEQ ID NO:2) ； 0078 反向引物 :5 -GCATGCGGGTTGTTTTGATT-3 (SEQ ID NO:3)。 0079 利用上述引物， 通过 PCR 扩增和琼脂糖凝胶电泳检测来验证该候选分子标记的多 态性和扩增稳定性。 0080 具体地， 以实施例 3 中提取的父本、 母本、 RIL 群体单株的基因组 DNA 为模板， 利用 上述扩增引物进行 PCR 扩增， 其中， 0081 PCR 反应体系如下 ： 0082 说 明 书 CN 106350515 A 8 7/9 页 9 0083 PCR 反应程序如下 ： 0084 94预变性 5 分钟 ； 94。

35、变性 30 秒， 60退火 30 秒， 72延伸 40 秒， 运行 35 个循 环 ； 最后 72延伸 3 分钟。PCR 扩增产物经纯化后于 4下保存。 0085 接着， 取部分PCR扩增产物， 用1琼脂糖凝胶电泳检测， 结果见图1。 如图1所示， 抗白叶枯病的单株均扩增出 985bp 的条带， 不抗白叶枯病的单株均扩增出 603bp 的条带。 0086 然后， 利用3730测序仪对各扩增产物进行测序， 结果， 父本及RIL群体中抗白叶枯 病的单株扩增条带， 与母本及 RIL 群体中不抗白叶枯病的单株扩增条带相比增加了 382bp 的序列 ( 核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 1 所示 )。

36、， 即为候选分子标记 SV3。由此， 证明该候选分 子标记 SV3 在父母本之间具有多态性， 该候选分子标记与水稻抗白叶枯病性状紧密相关， 且具有与抗白叶枯病基因连锁遗传的稳定性。 0087 候选分子标记具有多态性、 与抗白叶枯病基因连锁遗传的稳定性， 所以该候选分 子标记可作为抗白叶枯病基因的分子标记使用。多态性指的是 ： 分子标记在抗白叶枯和不 抗白叶枯病水稻基因组中的序列不同， 可以区分。 0088 实施例 6 ： 分子标记的制备 0089 以实施例 3 中提取的父本基因组或 RIL 群体中抗水稻白叶枯病的单株的基因组 DNA 为模板， 利用实施例 5 中的引物对进行 PCR 扩增。 0。

37、090 PCR 反应体系如下 ： 0091 无菌水20.2l 10*Buffer( 含 Mg2+)2.5l dNTPs(25mM)0.15l Taq 酶 (5U/l)0.15l 正向引物0.5l 说 明 书 CN 106350515 A 9 8/9 页 10 反向引物0.5l 模板1.0l 总体积25l 0092 PCR 反应程序如下 ： 0093 94预变性 5 分钟 ； 94变性 30 秒， 60退火 30 秒， 72延伸 40 秒， 运行 35 个循 环 ； 最后 72延伸 3 分钟。PCR 扩增产物经纯化后于 4下保存。 0094 将扩增产物纯化， 得到 985bp 的含有分子标记的核。

38、苷酸序列。纯化后进行测序， 结 果如 SEQ ID NO ： 4 所示。 0095 所述扩增产物 ( 如 SEQ ID NO ： 4 所示序列 ) 包含 Seq ID No.1 所示序列以及 Seq ID No.1 的 5 端和 / 或 3 端的上下游序列。本领域技术人员可以理解， 只要扩增或者检 测抗白叶枯病的水稻基因组 DNA 中的该分子标记， 必然能够检测或扩增得到含有 Seq ID No.1 所示的序列。Seq ID No.1 的 5 端和 / 或 3 端的上下游序列的长度为适当长度， 并 不特别限定， 例如， 满足分子标记的长度小于 10,000bp、 小于 5,000bp、 小于 。

39、2,000bp、 小于 1,500bp、 小于 1,200bp、 小于 1,000bp、 或者小于 800bp。 0096 所述分子标记(含有Seq ID No.1所示核苷酸序列的DNA片段)所包含的Seq ID No.1 的 5 端和 / 或 3 端可操作地连接有人工序列和 / 或控制序列， 例如启动子、 增强子、 终止子、 酶切位点、 引物序列等等。 其中， 术语 “可操作地” 在本发明中定义为一种如下构象， 在该构象中， 控制序列例如启动子被适当地置于Seq ID No.1的一个位置上， 以致该控制序 列指导 Seq ID No.1 编码的多肽的产生。 0097 对本领域技术人员而言， 。

40、可以理解， 也可以通过 DNA 化学合成的方法得到该分子 标记。 0098 SEQ ID NO ： 4 0099 GCTTGTGCACAGCCACTTTGTCAGGTAGACATCATCAGCAGATAGCTCATATGGCAAGTTTTGTGATGA GTACCAATTGACCTGAAATTCAACTTGAATTGTAAGATGTTAATCTAGTCATGGTAAGGTAACTCTGTACCAGGATT GTTAACAGAAAACATGTATGGTGAACTTTGTGAAGTTCATACCATGAGCTTAACTTTGTCAGACTCTTTTAACTTGC TGCCCAAACACAGACAG。

41、GTCATGATTGAGGACAGTTTGTTAAGAGTACAAATTCAGCCACTTTGAGTGATCAGCTAT GTACTGACTGCTTAAGAGTATATAGATGCAAGAGATGAGAGTGATCAGCTATGTACTGACTGCTTAAGAGTATATAG ATGCAAGAGATGAAGGGCCTGTTCACTTTGATGCCATTTTCAACCTTACCAAATTTTAGTAAAGTTGCTAAAAAAAT GGCTATATTTAGTTTGCTGTCAAATTTTGGTAACTATATAAGAAATCCTGCCAAAATTTTGATAACTATGCCAAAAT TTGGT。

42、AAGGTTTTTTTTTGGCATCAAAGTGAACAGGCCCGAAAACTATATGATTGTATAAATTGCTACATTGCTTGC CTACCGGCAAGATTGGAGTGATCAAGGTTTATAACCACAGAACAGTAGTGAACAGTCAGGGTTGCACAATTGCACTT GTCTTTCACAACAAATGCAGATAAAAACGCAGGCCAACACAACGAGAACTTCAGGTCCAGAAAGGCCAACTCCATTA TATGCTTCAAAACCTAAACAAGTCAATATCTGTACTACGCAGTAAGCACCTGCATCAGCACTCAGCAGCGC。

43、TTCAAG TAGTTCACACTTGCAGACGACCTTATACCCATCAGAACCAAATAGAGTATATACTTAGTCAGCATATCTTAGGATTC TAACTAGGCATCAGCAGATAGCATAGAACAACACCAACACTAAATTGTCAATCAAAACAACCCGCATGC 0100 其中两端加粗斜体部分 ( 各 20bp) 为引物设计区段， 中间加粗斜体部分 (382bp) 为分子标记 SV3 序列 ( 即 SEQ ID NO ： 1)。 说 明 书 CN 106350515 A 10 9/9 页 11 0101 实施例 7 ： 分子标记克隆 0102 将实。

44、施例6中扩增获得的985bp的片段克隆到pMD18-T载体中， 获得重组载体。 将 该重组载体转化到大肠杆菌 JM109 中， 挑单克隆， 培养获得重组细胞。从重组细胞中提取质 粒， 所述质粒即重组载体， 采用 M13 通用引物 ( 序列信息参考 TaKaRa 商品目录 ) 对克隆片 段进行测序， 结果显示， 重组载体中含有本发明的分子标记 (Seq ID No.1)。上述克隆、 转 化、 培养、 质粒提取等步骤参考 分子克隆实验指南第三版 ， 黄培堂等译， 科学出版社 2002 年 9 月出版。 0103 以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明， 不能认定本发 明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说， 在不脱 离本发明构思的前提下， 还可以做出若干简单推演或替换， 都应当视为属于本发明的保护 范围。 说 明 书 CN 106350515 A 11 1/2 页 12 0001 0002 序 列 表 CN 106350515 A 12 2/2 页 13 序 列 表 CN 106350515 A 13 1/1 页 14 图 1 说 明 书 附 图 CN 106350515 A 14 。