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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610836503.1 (22)申请日 2016.09.21 (71)申请人 贵州大学 地址 550025 贵州省贵阳市贵州大学花溪 北校区科技处 (72)发明人 文晓鹏梅利那范付华崔博文 (74)专利代理机构 贵阳中新专利商标事务所 52100 代理人 吴无惧 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) (54)发明名称 一种利用转录组测序的SSR分子标记鉴定马 尾松种质的方法 (57)摘要 本发明公开了一种利用转录组测序的SSR分 子标记鉴定马尾松种质。
2、的方法, 其特征在于: 包 含以下步骤: (1)DNA提取采用天根DNAsecure PlantKit试剂盒优化步骤, 然后按如下的PCR反 应体系和反应程序用引物对马尾松样本进行扩 增; (2)基于马尾松转录组测序的序列设计SSR引 物, 并进行PCR扩增体系优化; (3)最后对PCR产 物, 采用优化的10聚丙烯酰胺变性凝胶电泳, 通过银染法对PCR产物进行检测, 根据谱带的有 无和大小来判定结果。 权利要求书1页 说明书6页 附图1页 CN 106282371 A 2017.01.04 CN 106282371 A 1.一种利用转录组测序的SSR分子标记鉴定马尾松种质的方法, 其特征在于。
3、: 包含以下 步骤: (1)DNA提取采用天根DNAsecure Plant Kit试剂盒优化步骤, 然后按如下的PCR反应体 系和反应程序用引物对马尾松样本进行扩增; (2)基于马尾松转录组测序的序列设计SSR引物, 并进行PCR扩增体系优化; (3)最后对PCR产物, 采用优化的10聚丙烯酰胺变性凝胶电泳, 通过银染法对PCR产物 进行检测, 根据谱带的有无和大小来判定结果。 2.根据权利要求1所述的一种利用转录组测序的SSR分子标记鉴定马尾松种质的方法, 其特征在于: SSR标记引物为如下的1对或任意几对: 3.根据权利要求1所述的一种利用转录组测序的SSR分子标记鉴定马尾松种质的方法,。
4、 其特征在于: PCR反应体系采用10-20 l反应体系: 分别包含10-50ng的模板DNA 1-2 l, 正、 反向引物各0.3-0.6 l, 5-10 l Mix及适量ddH2O。 其中Mix含0.1U/ l Taq polymerase、 500 M dNTP、 20mM Tris-HCl、 100mM KCl、 3mM MgCl2, 以及其它稳定剂和增强剂。 4.根据权利要求3所述的一种利用转录组测序的SSR分子标记鉴定马尾松种质的方法, 其特征在于: PCR的反应程序为: 94预变性4min; 对94反应30s, 60-63反应45s, 72反 应45s进行40个循环; 72延伸7。
5、min; 4最终保存。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106282371 A 2 一种利用转录组测序的SSR分子标记鉴定马尾松种质的方法 技术领域 0001 本发明属于分子生物学领域, 涉及基于马尾松转录组测序序列而开发的SSR引物 及其应用。 基于转录组序列开发的多对SSR标记引物, 专用于从DNA水平对马尾松种质进行 快速鉴定及亲缘关系分析。 背景技术 0002 马尾松(Pinus massoniana)是我国南方最主要的优质针叶用材树种之一, 在我国 森林资源发展、 林纸一体化、 松香林产化工业及森林生态服务功能中具有重要地位, 其中, 马尾松优良种质的发掘和保护对产业的健康发展至关。
6、重要。 因此, 马尾松种质的准确、 高效 鉴定和亲缘关系分析, 对种质的知识产权保护、 开发和利用具有重要现实意义。 目前, 已有 马尾松遗传多样性、 遗传连锁图谱构建等方面的相关报道, 但由于马尾松基因组及转录组 数据的缺乏, 造成马尾松生长发育规律解析、 分子标记开发和遗传图谱构建等相对滞后。 随 着分子生物学的发展, , 主要有RAPD、 AFLP、 ISSR、 SRAP等分子标记技术已被用于马尾松种质 鉴定、 亲缘关系分析和遗传图谱构建, 但这些多为显性标记, 不能区分纯合体和杂合体, 且 这些分子标记覆盖马尾松基因组的比例较小, 标记密度较低。 0003 简单重复序列(SSR)广泛分。
7、布于各类真核生物基因组的不同位置, 由于重复次数 和重复程度不同, 使其呈现高度的多态性。 与其它分子标记技术相比, SSR标记具有多态信 息含量高、 共显性遗传、 技术简单、 重复性好、 特异性强等特点, 被认为是可靠性最高的分子 标记类型之一。 SSR标记可分为基因组SSR(gSSR)和表达序列标签SSR(EST-SSR), 基因组SSR 标记的开发操作繁琐, 费时费力, 费用高, 这是限制SSR标记应用的一大瓶颈。 与基因组SSR 标记相比, 表达序列标签来源于基因的转录区, 可直接反映基因的表达信息, 且标记在种间 的通用性更高。 0004 随着高通量测序技术的快速发展和测序成本的降低。
8、, 利用新一代高通量测序技术 对植物全基因组范围内进行测序, 产生丰富的转录组数据, 其中包含了大量的EST序列。 利 用转录组序列开发SSR标记既有EST-SSR标记的优点, 同时其海量的数据为SSR标记的开发 提供了比EST-SSR更全面的信息, 提高了遗传多样性和分子标记辅助育种研究的准确性。 因 此, 本发明利用高通量测序技术成功获得马尾松转录组数据, 对这些数据进行系统分析, 最 终找到了适用于马尾松SSR标记分析的引物, 这将会对马尾松重要性状基因的定位、 分子标 记辅助选择育种和比较基因组学研究等起重要推动作用。 发明内容 0005 本发明要解决的技术问题是: 为了克服现有分子标。
9、记覆盖马尾松基因组比例低、 操作复杂等缺点, 本发明旨在提供多态性检出率高、 分辨率更好、 稳定可靠、 简单高效的分 子标记鉴定方法。 该方法可直接用于马尾松的种质鉴定、 亲缘关系分析和遗传图谱的构建, 为种质知识产权保护和遗传改良提供更好的评估工具。 本发明需要解决的关键技术是马尾 松SSR标记引物的获得, 以及聚丙烯酰胺变性凝胶的优化。 说明书 1/6 页 3 CN 106282371 A 3 0006 本发明的技术方案是: 一种利用转录组测序的SSR分子标记鉴定马尾松种质的方 法, 包含以下步骤: 0007 (1)DNA提取采用天根DNAsecure Plant Kit试剂盒优化步骤, 。
10、然后按如下的PCR反 应体系和反应程序用引物对马尾松样本进行扩增; 0008 (2)基于马尾松转录组测序的序列设计SSR引物, 并进行PCR扩增体系优化; 0009 (3)最后对PCR产物, 采用优化的10聚丙烯酰胺变性凝胶电泳, 通过银染法对PCR 产物进行检测, 根据谱带的有无和大小来判定结果。 0010 所述的SSR标记引物为如下的1对或任意几对: 0011 0012 所述的PCR反应体系采用10-20 l反应体系: 分别包含10-50ng的模板DNA 1-2 l, 正、 反向引物各0.3-0.6 l, 5-10 l Mix及适量ddH2O。 其中Mix含0.1U/ l Taq poly。
11、merase、 500 M dNTP、 20mM Tris-HCl、 100mM KCl、 3mM MgCl2, 以及其它稳定剂和增强剂。 0013 所述的PCR的反应程序为: 94预变性4min; 对94反应30s, 60-63反应45s, 72 反应45s进行40个循环; 72延伸7min; 4最终保存。 0014 本发明的有益效果: 0015 本发明方法适用于马尾松种质快速可靠的分子检测和鉴定, 具有重要的实用价 值, 与其它方法相比, 本发明具有以下的技术优势: 0016 1、 操作简便快速: 本发明对样本进行简单处理、 PCR扩增和常规的聚丙烯酰胺变性 凝胶电泳后即可判断结果, 无需。
12、对扩增的产物进行限制性内切酶酶切, 整个检测过程可在5 说明书 2/6 页 4 CN 106282371 A 4 个小时内完成; 0017 2、 对聚丙烯酰胺变性凝胶的制作已进行优化, 并形成一套完整的体系, 效果较好: 制作过程简单, 耗时较短, 且能将差异较小的片段(3bp左右)较好的区分开, 进一步提高了 SSR标记在种质鉴定和知识产权保护上的应用效率; 0018 3、 检测结果灵敏度高: 对待检样品仅需提供模板10-50ng, 即可准确鉴定其所属种 质; 0019 4、 结果高度准确、 可靠、 重复性好: 本发明已经对不同种质的马尾松DNA样本进行 了检测, 经过多次重复检测, 检测准。
13、确率100, 为检测结果提供了高度的可靠性; 0020 5、 本发明的SSR引物开发基于马尾松转录组测序结果, 引物具有高特异性、 专一 性: 在马尾松SSR分子标记研究领域, 前人多采用从其他松属类植物中筛选的引物, 或依靠 生物信息学手段从松属EST数据库中开发的SSR引物, 但效果都不太理想; 0021 6、 本发明中开发的SSR引物获得的分子标记, 在马尾松基因组中分布均匀、 多态性 丰富、 清晰稳定、 分辨率高, 可有效用于马尾松的种质鉴定、 亲缘关系分析及遗传图谱构建 等工作, 在知识产权保护和遗传育种上具有重要实际意义; 0022 7、 取材方便、 经济效益明显: 针叶、 球花等。
14、组织或器官均可为实验材料, 苗期、 幼林 期、 成年大树均可取样, 不受季节、 地点的限制。 通过对马尾松苗木纯度的SSR分子鉴定, 可 避免苗木生产与销售过程中出现的鱼龙混杂现象。 附图说明 0023 图1为SSR引物扩增后1琼脂糖凝胶电泳初筛检测图; 14分别表示福建漳平G22 家系、 H90家系、 70-80-5家系; 5、 6分别表示广西南宁29-1家系、 1-2-1家系; M为DNA Marker; 0024 图2为SSR引物扩增后10聚丙烯酰胺变性凝胶电泳复筛检测图; 16分别表示都 匀林场的黄平49家系、 黄平50家系、 黄平38家系、 福泉4家系、 黄平34家系、 福泉3家系;。
15、 M为 DNA Marker; 0025 图3为引物对PmS54对来自贵州、 福建及广西共72份马尾松种质的10PAGE变性凝 胶电泳检测图; 124对应表2中贵州都匀林场各家系; 2548对应表2中福建漳平林场各家 系; 4972对应表2中广西南宁林场各家系; M为DNA Marker。 具体实施方式 0026 实施例1: 以本发明中的SSR引物, 鉴定贵州、 福建、 广西三地共72份马尾松种质, 其 中以引物对PmS54为例, 可区分供试材料。 0027 1.SSR引物的设计及合成 0028 首先对测序得到的序列进行前处理, 得到高质量无冗余的EST序列, 利用MISA软件 在转录数据中搜。
16、索SSR位点, 搜索标准为: 单核苷酸、 二核苷酸、 三核苷酸、 四核苷酸、 五核苷 酸和六核苷酸的最少重复次数分别为10、 6、 5、 5、 5和5, 接着用Primer3.0引物批量设计程序 对含有SSR位点的Unigene序列设计引物, 并且SSR位点序列长度在1827bp之间。 其中, 引 物设计的主要参数为: 退火温度(Tm)在5763之间, 60最佳; PCR产物大小为100 300bp; GC含量在4060之间, 50最佳。 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司 合成。 设计合成的PmS54正、 反向引物相关信息如表1所示。 说明书 3/6 页 5 CN 106282371 A。
17、 5 0029 表1引物PmS54相关信息 0030 0031 2.基因组DNA的提取及检测 0032 采用贵州、 福建、 广西三地共72份马尾松种质为供试材料, 见表2所示。 0033 采用天根DNAsecure Plant Kit(DP320)试剂盒并作适当修改, 提取基因组DNA, 用 1琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量, 核酸浓度测定仪检测DNA浓度, 将浓度稀释至1050ng/ L左右, -20保存。 0034 表2贵州、 福建、 广西三地共72份马尾松种质 0035 0036 3.PCR扩增 说明书 4/6 页 6 CN 106282371 A 6 0037 优化反应体系为(10-20。
18、 l): 1050ng的模板DNA, 各0.3-0.6 l正、 反向引物(10 M), 5-10 l Mix及适量ddH2O。 其中Mix含0.1U/ l Taq polymerase, 500 MdNTP, 20mMTris- HCl(pH8.3), 100mMKCl, 3mM MgCl2, 以及其它稳定剂和增强剂。 0038 优化的PCR程序为: 94预变性4min; 94变性30s, 复性45s, 72延伸45s, 40个循 环; 最后72延伸7min, 4保存。 0039 4.SSR引物初筛 0040 将PCR反应产物在含有GoldView 的1琼脂糖凝胶中, 以5V/cm的电压电泳适。
19、当时 间, 然后于凝胶分析仪中观察并拍照保存, 筛选出条带清晰的引物, 如图1所示。 0041 5.SSR引物多态性位点复筛 0042 初筛引物的PCR反应产物, 在10聚丙烯酰胺变性凝胶中, 以80V电压预电泳10min 左右, 然后以150V电压正式电泳23h, 最后显影、 染色、 拍照, 筛选出条带清晰、 具有多态性 差异的引物, 如图2所示。 已优化的10聚丙烯酰胺变性凝胶电泳的操作过程如下: 0043 1)安装夹心式垂直电泳板 0044 (1)将玻璃板拿到流动水处洗刷干净、 晾干, 用乙醇或剥离硅烷均匀擦洗玻璃板; 0045 (2)将清洗干净的两块长、 短玻璃板晾干后, 按要求分别插。
20、入到U型硅橡胶框的凹 形槽中; 0046 (3)将装好的玻璃电泳板倾斜成45-60角, 放在灌胶支架上固定好; 0047 (4)用滴管吸取少量的1琼脂糖溶液, 灌入凝胶长玻璃板外侧底部, 灌胶液面高 度约0.5-1.0cm(封胶面应整齐), 待琼脂糖凝固; 0048 2)制备凝胶板 0049 (1)按表3各组分的用量, 从上到下依次加入小烧杯中, 混匀; 加完尿素后, 用双蒸 水补足至50ml后进行过滤, 过滤结束后同时加入10APS(过硫酸铵)和TEMED(四甲基二乙 胺), 混匀稍微静止等泡沫散去; 0050 表3 10聚丙烯酰胺变性凝胶组成成分及添加成分的顺序 0051 0052 (2)。
21、将混匀的凝胶沿玻璃板凹口快速均匀倒下, 至短玻璃板边缘, 插入适当的梳子 封条; 0053 (3)室温聚合1-2小时后, 小心取出梳子封条, 用注射器加ddH2O多次冲洗加样孔; 0054 (4)将凝胶板用力均匀地固定在垂直电泳槽里, 带凹口背板朝里, 面向缓冲液槽; 0055 (5)用1TBE电解液灌满电泳槽的缓冲液槽, 接上电极, 打开电源, 调试工作环境 为电压80V, 预电泳10min左右; 0056 (6)预电泳期间, 向PCR产物中加入2.5 l loading buffer(上样缓冲液), 混匀, PCR仪97变性10min, 4保存; 说明书 5/6 页 7 CN 106282。
22、371 A 7 0057 (7)正式电泳点样前, 用注射器加1TBE电解液再次冲洗加样孔, 边冲洗边点样, PCR产物上样量为2 l左右, 然后打开电源, 调试工作环境为电压150V, 电泳2.5小时左右; 0058 (8)电泳至所需位置后, 切断电源, 拔出导线, 回收缓冲液, 卸下玻璃板。 在工作台 上, 将背板撬起, 然后将胶板放入有ddH2O的托盘中冲洗一或两次, 银染检测; 0059 3)银染检测 0060 (1)固定(10冰乙酸): 50ml冰乙酸加ddH2O定容至500ml, 混匀, 倒入托盘中, 摇床 轻摇25min左右, 约至二甲苯靑褪去, ddH2O漂洗两次(速度快, 约5。
23、s); 0061 (2)染色(0.1AgNO3): 称取0.5g AgNO3用ddH2O定容至500ml, 染色时现加入3ml 37的甲醛, 混匀, 倒入托盘中于摇床上避光震荡约25min, 然后ddH2O漂洗2次, 时间不超过 5s; 0062 (3)显色: 称取7.5g NaOH, ddH2O定容至500ml, 染色时加入2ml 37甲醛, 混匀, 将 显色液倒入托盘中于摇床上震荡至满意为止(可分两次加入, 第一次加入少许, 洗掉黑色银 液倒掉, 再加入剩余显色液, 轻摇至条带满意为止); 0063 (4)ddH2O漂洗12次, 尽量不超过5s, 立即数码相机拍照记录。 0064 6.供试。
24、材料的SSR分析 0065 用复筛出的多态性较好的SSR引物(如PmS54), 对供试材料进行PCR扩增及变性 PAGE凝胶电泳、 银染, 结果如图3。 凝胶制备和染色方法见步骤5。 0066 7.数据处理及分析 0067 每种SSR引物重复扩增3次, 绝大部分带型可重复, 极少数不能重复的谱带统计时 忽略不计。 采用人工读带的方式, 对扩增结果进行统计分析, 将谱带按 “引物号-片段长度” 进行记录, 并按有无分别赋值1和0, 建立数据库。 0068 指纹图谱构建 0069 不同引物产生的谱带数及多态性存在差异, 根据用最少的引物组合鉴别尽量多种 质的原则, 建立马尾松遗传图谱, 且所有供试材料的特异性各不相同, 达到种质鉴定的目 的。 说明书 6/6 页 8 CN 106282371 A 8 图1 图2 图3 说明书附图 1/1 页 9 CN 106282371 A 9 。