一种利用分子标记技术鉴定金顶侧耳的方法.pdf

一种利用分子标记技术鉴定金顶侧耳的方法，包括菌丝培养与收集、基因组DNA的提取、SCAR-PCR分子标记的检测建立和SCAR-PCR产物的检测。本发明的方法具有灵敏度高，所需要的DNA用量少，与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短、准确性高、容易判断、重复性好等优点。为金顶侧耳种质资源的利用和新品种的登记工作，提供了有效的菌种鉴定方法。

1、  一种利用分子标记技术鉴定金顶侧耳的方法，包括菌丝培养与收集、基因组DNA的提取、SCAR-PCR分子标记的检测建立和SCAR-PCR产物的检测；其特征在于
(1)SCAR-PCR分子标记的检测，使用的检测引物是嘉鱼金顶侧耳F/R，其中，嘉鱼金顶侧耳F是5′-ATGAACTAATGACCGCTTG-3′’，嘉鱼金顶侧耳R是5′-CCAATAGTAAGGGTCCTCC-3′；
(2)SCAR-PCR分子标记的检测建立：SCAR-PCR扩增体系为10×PCR buffer 2.5μl，25mmol/L MgCL₂ 1μl，2.5m mol/L dNTP 2μl，5U/ulTaq DNA Polymerase 0.3μl，10μmol/L检测引物各1μl，1ng～10ng/μl模板DNA 1μl，ddH₂O 16.2μl；
SCAR-PCR反应条件为94℃ 1min；94℃ 45second，64℃45second，72℃ 1min，30个循环；72℃5min；
(3)SCAR-PCR产物的检测结果：在电泳检测的DNA图谱中显示，扩增出的分子量为470bp的DNA条带，为嘉鱼金顶侧耳的标志。

一种利用分子标记技术鉴定金顶侧耳的方法
技术领域
本发明涉及一种微生物的鉴定方法，具体涉及利用分子标记技术鉴定嘉鱼金顶侧耳的方法，属生物技术领域。
背景技术
金顶侧耳(Pleurotus citrinopileatus Singer)又名榆黄蘑，为东北地区特有的食药兼用菌，属担子菌亚门，层菌纲，伞菌目，口蘑科，侧耳属。金顶侧耳既具味道鲜美、香味浓郁、营养丰富的食用价值，又具有滋补强身的药用价值，可用于治疗肾虚阳痿和痢疾。金顶侧耳含多糖类物质及丰富的氨基酸、蛋白质，还含有维生素和矿物质等多种营养成分，属高营养、低热量食品，有“素肉”之称，从金顶侧耳菌丝体中提取的多糖对人结肠低分化腺癌细胞有抑制作用。通过对其化学成分的分析，发现其中含有洛伐他汀、D-甘露醇、麦角甾醇、1-癸醇等物质，优质金顶侧耳的必须氨基酸含量占其自身氨基酸总量的40.8％。
然而我国食用菌的菌种比较混乱，同名异物、同物异名的现象严重。传统的鉴定方法有依据形态学特征，如杨延杰等通过比较子实体阶段的菌盖直径、菌盖厚度、菌柄直径、菌柄长度、菌盖颜色、发菌时间和产量等7个性状，用聚类分析的方法对试验数据进行处理，提出用遗传距离对菌种分类的鉴定方法(《辽宁农业科学》，2005(5)：21～22)。应用此法的工作量大，易受环境因素影而常出现不稳定，会给判断造成较大的误差。
另有学者从同工酶酶谱的差异对菌株间进行鉴定。李喜梅等对河南省表现较好的38个平菇菌株的菌丝体进行酯酶同工酶测定，根据酶谱的差异，将测试的38个菌株分为12个类型，并指出PL₇₉菌株和川白菌株虽属四川健门山大白菇，但它们不属于一个菌株(《河南农业大学学报》，1989，23(1)：73～77)。然而用这个方法会受菌体的遗传、培养条件、取样部位(菌丝、菌盖、菌柄)、样品制备、电泳条件、染色方法(包括染色时间)等的影响。
随着分子生物学的发展，为菌株间的鉴定提供新的方法。我国学者张金霞等应用微卫星间区(inter simple sequence repeat，ISSR)技术，对我国1982年至2004年22年间栽培的白黄侧耳Pleurotus cornucopiae 30个菌株进行了锚定ISSR分析，通过聚类分析，在遗传相似性61％的水平下将30个供试菌株划分为15个类群，即15个具一定遗传差异的菌株(《菌物学报》，2007，26(1)：115～121，)。
虽然学者们对金顶侧耳的栽培、营养成份与功效等方面研究的较多，但对金顶侧耳菌种的鉴定研究甚少，因此有必要对金顶侧耳菌种的鉴定技术进行研究，开发简便、快速、准确的菌种鉴定技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用分子标记技术鉴定嘉鱼金顶侧耳的方法。所述嘉鱼金顶侧耳指由湖北嘉鱼县环宇食用菌研究所提供的金顶侧耳菌种。
本发明的一种利用分子标记技术鉴定嘉鱼金顶侧耳的方法，包括菌丝培养与收集、基因组DNA的提取、SCAR-PCR分子标记的检测建立和SCAR-PCR产物的检测；其特征在于
1、SCAR-PCR分子标记的检测，使用的检测引物是嘉鱼金顶侧耳F/R，其中，嘉鱼金顶侧耳F是5′-ATGAACTAATGACCGCTTG-3′，嘉鱼金顶侧耳R是5′-CCAATAGTAAGGGTCCTCC-3′；
2、SCAR-PCR分子标记的检测建立：SCAR-PCR扩增体系为10×PCRbuffer 2.5μl，25mmol/L MgCL₂ 1μl，2.5mmol/L dNTP 2μl，5U/ul TaqDNA Polymerase 0.3μl，10μmol/L检测引物各1μl，1ng～10ng/μl模板DNA 1μl，ddH₂O 16.2μl；
SCAR-PCR反应条件为94℃ 1min；94℃ 45second，64℃ 45second，72℃ 1min，30个循环；72℃ 5min；
3、SCAR-PCR产物的检测结果：在电泳检测的DNA图谱中显示，扩增出的分子量为470bp的DNA条带，为嘉鱼金顶侧耳的标志。
所述SCAR的全称为sequence characterized amplified regions。
本发明提供的利用分子标记技术鉴定嘉鱼金顶侧耳的方法，具有灵敏度高，所需要的DNA用量少，与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短、准确性高、容易判断、重复性好等优点。具体如下：
1、检测时间短：该检测方法，从子实体部位或从可获得不小于0.5g菌丝体的样品检测一般只要2～3天，而常规的拮抗试验所需时间至少需要两周时间，常规形态学检测和出菇试验则需要至少2个月的时间。
2、准确性高、容易判断，而且重复性好：该检测方法以基因组DNA为材料，DNA是稳定的遗传物质，不易受外界因素等的影响，同时它的470bp的显性标记判断一目了然，减少人为判断的偏差，大大提高了准确性；常规的拮抗试验中，拮抗表现形式至少有3种，甚至更多，有时表现形式不明显，还受培养环境的影响，拮抗表现不仅在种内的不同品种之间会出现，同时在种间的菌株之间也会表现出来，给准确判断造成困难；出菇试验更容易受到环境、时间等各方因素的影响，重复性差，加大了检测困难；形态学检测在同一属种内的不同品种之间可区别的特征少，有些甚至没有什么差异，同时还需要判断者具有丰富的知识与经验，方可做出准确的判断。
3、此外该方法得到的显性标记可减少嘉鱼金顶侧耳品种认定的工作量，检测时该方法只需要1个阳性菌株和1个阴性菌株对照便可快速比较，而用常规形态学、拮抗试验、出菇试验方法来认定一个新品种，需要将所有同种内的不同品种一起搬出来比较，才能做出正确的认定，这就要很大的人力和物力，当品种多时可能使得认定工作无法进行。
本发明为金顶侧耳种质资源的利用和新品种的登记工作，提供了更有效的菌种鉴定方法，以及加强对我国金顶侧耳种质资源的保护工作都具有重要意义。
附图说明图
1为使用引物嘉鱼金顶侧耳F/R检测金顶侧耳菌种扩增的DNA图谱。其中M～16为泳道编号；左侧的数字表示DNA片段的分子量，箭头所指是嘉鱼金顶侧耳性标记。
具体实施方式
为了充分公开本发明的利用分子标记技术鉴定嘉鱼金顶侧耳的方法，以下结合实施例加以说明。
实施例1：一种利用分子标记技术鉴定嘉鱼金顶侧耳的方法
一种利用分子标记技术鉴定嘉鱼金顶侧耳的方法，包括以下步骤：
一、菌丝培养与收集
(一)若供测试金顶侧耳菌株的保藏时间小于6个月，则菌丝培养按如下方法进行;
1、用接种耙耙碎含金顶侧耳菌丝的PDA培养基，转接入250ml三角瓶，含100ml PDA液体培养基中；
2、放置在25℃摇床上，转速90～130r/min培养7～10天；
3、用纱布过滤培养好的菌丝，蒸馏水冲洗，滤纸吸干；
4、称取0.5～1.3g菌丝，用滤纸包好，保存于-20℃备用。
(二)若供测试金顶侧耳菌株保藏时间不小于6个月，则菌丝培养采用如下方法：
1、取金顶侧耳菌种豆块大小转接到PDA斜面上，25℃培养7～10天；
2、用接种耙耙碎含金顶侧耳菌丝的PDA培养基，转接入250ml三角瓶，含100ml PDA液体培养基中；
3、放置在25℃摇床上，转速90～130r/min培养7～10天；
4、用纱布过滤培养好的菌丝，蒸馏水冲洗，滤纸吸干；
5、称取0.5～1.3g菌丝，用滤纸包好，保存于-20℃备用。
二、基因组DNA的提取，所述基因组DNA可以从菌株的菌丝体或子实体中提取。
1、取保存备用的金顶侧耳菌丝0.5～1.3g，或子实体0.5～1.3g，放入研钵，加入液氮迅速研磨成粉末，转入7ml的离心管；
2、加2.5mL65℃预热的抽提液，同时加入50μl巯基乙醇，上下震荡，使蛋白质变性沉淀；
3、65℃水浴1h，每隔10min振荡1次；
4、加入2.5ml的氯仿异戊醇混匀，除去蛋白质；
5、8000r/min，4℃离心10min，取上清到7ml离心管；
6、加1/5体积65℃预热的CTAB/NaCl混匀，加入2.5ml的氯仿异戊醇混匀；
7、10000r/min，4℃离心10min，取上清；
8、加入2.5ml65℃预热的CTAB沉淀液，颠倒混匀，65℃水浴1h至沉淀可见或可过夜；
9、12000r/min，4℃离心10min后，小心去除上清液；
10、用0.5ml TE溶液或无菌水溶解沉淀10min；
11、加入0.25ml饱和酚和0.25mL氯仿异戊醇，混匀；
12、12000r/min，4℃离心10min，取上清，加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀；
13、放置-20℃冰箱1h或过夜；
14、12000r/min，4℃离心10min，弃上清；
15、自然风干沉淀，用30μl TE溶液或无菌去离子水溶解沉淀，-20℃保存备用。
三、SCAR-PCR分子标记的检测建立
SCAR-PCR扩增体系：10×PCR buffer 2.5μl，25mmol/L MgCL₂ 1μl，2.5m mol/L dNTP 2μl，5U/ul Taq DNA Polymerase 0.3μl，10μmol/L专用检测引物嘉鱼金顶侧耳F/R各1μl，1ng～10ng/μl模板DNA 1μl，ddH₂O16.2μl。
SCAR-PCR反应条件：94℃ 1min；94℃ 45second，64℃ 45second，72℃ 1min，30个循环；72℃ 5min。
所述专用检测引物嘉鱼金顶侧耳F/R，是采用PCR技术，经过大量的筛选试验，获得了嘉鱼金顶侧耳菌株的DNA片断，以此片段的DNA序列为基础，设计嘉鱼金顶侧耳菌种的检测引物。所述专用检测引物嘉鱼金顶侧耳F/R具体内容为：嘉鱼金顶侧耳F是5′-ATGAACTAATGACCGCTTG-3′，嘉鱼金顶侧耳R是5′-CCAATAGTAAGGGTCCTCC-3′。
四、PCR扩增产物检测
具体检测方法为，取PCR扩增产物8μl加上1.5μl 6×溴酚蓝上样缓冲液，混匀，在1.0％琼脂糖凝胶，含Goldview^TMDNA染料进行电泳，5V/cm恒压电泳50min，通过紫外凝胶成像系统观察并照像。或者，取PCR扩增产物8μl，与1.5μl 6×溴酚蓝上样缓冲液混匀，点样于1％的琼醋糖凝胶上，于0.5 X TBE缓冲液中，5V/cm恒压电泳0.5～1h，电泳结束后，用EB染色，然后在凝胶成像仪上照相。
PCR扩增产物检测结果采用检测引物嘉鱼金顶侧耳F/R对金顶侧耳菌株进行SCAR—PCR扩增，只有嘉鱼金顶侧耳菌株能扩增出分子量为470bp的DNA条带。
本发明所使用的主要试剂如下：(所有化学试剂均为分析纯)
1、CTAB抽提液：100mmol/L Tris-HCl，2.0％ CTAB，20mmol/LEDTA，1.4mol/L NaCl，pH 8.0；
2、CTAB沉淀液：50mmol/L Tris-HCl，1.0％ CTAB，10mmol/LEDTA，pH8.0；
3、CTAB/NaCl：0.7mol/L NaCl，10％ CTAB；
4、TE缓冲液：10mmol/L Tris HCl，1mmol/L EDTA；
5、0.5×TBE：44.5mmol/L Tris，50mmol/L HBO₃、1mmol/LEDTA；
6、上样缓冲液：0.1％溴酚蓝，40％蔗糖；
7、EB：10mg/ml溴化乙锭；
8、PCR扩增试剂购自大连宝生物公司。
本发明所使用的主要仪器如下：SW-CJ-1FB型单人水平垂直两用净化工作台：苏州净化设备有限公司；
手提式灭菌锅：上海三申；
HYG-A全温摇瓶柜：太仓市实验室；
冷冻离心机：Sigma 3K30；
PCR扩增仪：Eppendorf AG22331 Hamburg；
掌型离心机：江苏海门市麒麟医用仪器厂Lx-100手掌型离心机；
凝胶成像系统：TANON-2008。
Untitled.ST25
SEQUENCE LISTING
<110>福建农林大学
<120>一种利用分子标记技术鉴定金顶侧耳的方法
<130>
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>金顶侧耳
<400>1

<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>金顶侧耳
<400>2