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1、(10)申请公布号 CN 102212135 A (43)申请公布日 2011.10.12 CN 102212135 A *CN102212135A* (21)申请号 201110007354.5 (22)申请日 2011.01.14 C07K 16/22(2006.01) C12N 15/13(2006.01) G01N 33/577(2006.01) (71)申请人 中国科学院北京基因组研究所 地址 100029 北京市朝阳区北土城西路 7 号 G 座 (72)发明人 冯杰 高静 邵长君 (54) 发明名称 一种抗血管内皮生长因子的单克隆抗体及应 用 (57) 摘要 本发明提供了一种能够结。
2、合人血管内皮生长 因子(VEGF)的特异单克隆抗体。 该单克隆抗体具 有与人VEGF特异结合的特性。 本发明还提供了所 述单克隆抗体在科学研究及免疫学检测方面的应 用。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 序列表 1 页 附图 1 页 CN 102212142 A1/1 页 2 1. 一种免疫球蛋白 IgG， 其特征在于， 它能够特异性地结合人 VEGF。 2. 如权利要求 1 所述的免疫球蛋白， 其特征在于， 它是单克隆抗体。 3. 如权利要求 1 所述的免疫球蛋白， 其特征在于， 它具有的重链可变区具有 S。
3、EQ ID NO ： 1 所示的氨基酸序列， 轻链可变区具有 SEQ ID NO ： 2 所示的氨基酸序列。 4. 一种分离的核酸分子， 其特征在于， 该分子含有 SEQ ID NO ： 1 所示的编码所述单克 隆抗体重链的核苷酸序列， 以及 SEQ ID NO ： 2 所示的编码所述单克隆抗体轻链的核苷酸序 列。 5. 根据权利要求 4 所述的核酸分子， 其特征在于， 它编码权利要求 1 所述的免疫球蛋 白。 6. 一种检测 VEGF 免疫学检测试剂， 它含有权利要求 1 所述的免疫球蛋白。 权 利 要 求 书 CN 102212135 A CN 102212142 A1/3 页 3 一种抗。
4、血管内皮生长因子的单克隆抗体及应用 技术领域 0001 本发明涉及抗体工程和医学领域。更具体地， 本发明涉及获得识别人血管内皮生 长因子 (hVEGF) 表位的鼠单克隆抗体。 背景技术 0002 癌症是影响人类健康的重大疾病， 死亡率高。1971 年 Folkman 首先观察到当肿瘤 体积超过 1 2mm3， 需要形成新血管才能继续生长， 从而提出通过调控血管生成控制肿瘤 生长的假说。目前研究表明通过阻断肿瘤血管生成生长因子信号传导通路能够抑制实体 肿瘤发展过程的新血管生成， 可以特异地干预肿瘤发展进程。新血管生成的过程需要多种 刺激因子参与， 其中包括血管内皮生长因子 VEGF(vascul。
5、ar endothelia growth factor)。 Genentech 公司生产针对 VEGF 的人源化单抗阿瓦斯汀 (Bevacizumab， Avastin) 是重组的 人源化单克隆抗体， 于 2004 年 2 月 26 日获得 FDA 的批准， 是第一个获得批准上市的抑制肿 瘤血管生成的药物。 Bevacizumab已被批准用于一线治疗转移性结直肠癌， 与某些化疗方案 联合治疗晚期非小细胞肺癌以及乳腺癌。 0003 血管内皮生长因子 (VEGF) 是血管生成重要调节因子， 在胚胎发育及出生后的血 管发程中均起着极为重要的调节作用， 主要参与新生血管的形成 VEGF 有至少五种不同。
6、大 小的剪切形式， 包括 121、 145、 165、 189 和 206 个氨基酸等， 其中 VEGF121、 VEGF145和 VEGF165是 分泌蛋白。VEGF 受体包括 VEGFR1、 VEGFR2 和 VEGFR3。VEGF 与内皮细胞膜上内皮生长因子 受体(VGFR)结合后， 使VEGFR二聚体化， 受体酪氨酸激酶活性被激活， 由受体自身磷酸化后 启动下游信号通路如PKC信号通路。 VEGF在肿瘤细胞中表达水平显著升高。 高表达的VEGF 除了能够使血管内皮细胞分化增殖和迁移， 促进血管的构建及生长， 还能够提高血管的通 透性、 增加血浆蛋白溶酶激活物 (PA) 及血浆纤溶酶原激。
7、活物抑制剂 -1(PAI-1) 的表达， 促 进肿瘤的侵袭、 转移。 0004 由于 VEGF 和其受体的多样性， 不同抗原表位或者亲和力不同的 VEGF 抗体对肿瘤 生长抑制的效果可能是不同的。VEGF 抗体药物的升级需要获得和研究针对 VEGF 不同表位 的CDR。 不同的CDR序列免疫原性是不同的， 通过CDR移植制备的人源化抗体被机体的耐受 速度及产生的毒性是有差异的， 直接影响药物的疗效。抗体的疗效还受抗体血浆半衰期和 血管穿透能力等因素的影响。因此研究不同 VEGF 抗体将有助于获得疗效更好的治疗性人 源化抗体。 发明内容 0005 本发明的目的提供一种特异性抗人血管内皮生长因子 。
8、(hVEGF) 的单克隆抗体， 能 够特异识别人 VEGF。 0006 本发明提供了一种针对 hVEGF 的免疫球蛋白， 其特征在于， 它特异性地结合于人 血管内皮生长因子 (hVEGF)。 0007 所述的免疫球蛋白， 其特征在于， 所述的免疫球蛋白是鼠单克隆抗体 IgG。 说 明 书 CN 102212135 A CN 102212142 A2/3 页 4 0008 所述的鼠单克隆抗体， 其特征在于， 所述的鼠单克隆抗体产生的杂交瘤细胞株， 它 是小鼠杂交瘤细胞系 18-5。 0009 本发明提供了一种抗人VEGF单克隆抗体， 其重链可变区具有SEQ ID NO ： 1所示的 氨基酸序列，。
9、 轻链可变区具有 SEQ ID NO ： 2 所示的氨基酸序列。 0010 本发明还提供了一种分离的核苷酸， 编码抗人 VEGF 单克隆抗体重链可变区 (SEQ ID NO ： 1)核苷酸序列具有表1所示的碱基序列， 编码抗人VEGF单克隆抗体轻链可变区(SEQ ID NO ： 2) 核苷酸序列具有表 2 所示的碱基序列。 0011 本发明还提供了抗人 VEGF 单克隆抗体在免疫学检测中的用途。 附图说明 0012 图 1 ： 鼠单克隆抗体 18-5 的重链可变区氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 1)。 0013 图 2 ： 鼠单克隆抗体 18-5 的轻链可变区氨基酸序列 (SEQ ID 。
10、NO ： 2)。 0014 图 3 ： 鼠单克隆抗体 18-5 用于 Western-blot 检测 VEGF。L1 ： 阴性对照， L2 ： pLenti7.3/V5-VEGF165转染细胞裂解物， L3 ： pLenti7.3/V5-VEGF165转染细胞培养上清 0015 图4 ： 鼠单克隆抗体18-5用于VEGF的免疫荧光检测。 A ： 转染pLenti7.3/V5-TOPO 空载体 EGFP 荧光， B ： 转染 pLenti7.3/V5-TOPO 空载体对照， C ： 转染 0016 pLenti7.3/V5-VEGF165EGFP 荧光， D ： 转染 pLenti7.3/V5-。
11、VEGF165(CY3 标记二抗 ) 0017 实施方式 0018 具体实施例 1 小鼠单克隆抗体的制备和筛选 0019 (1) 抗原的制备 0020 将人血管内皮生长因子 VEGF165(Human Vascular endothelial growth factor， hVEGF165) 基因通过 PCR 从人基因转录组中扩增获得， 上游引物为 ： 5 -CGCGGATCCGCACCCAT GGCAGAAGGAGG-3 ； 下游引物为 ： 5 -CTCCTCGAGTCACCGCCTCGGCTTGTCACATC-3 。利用 BamH I 和 Xho I 双酶切， 将基因片段连入原核表达载体 。
12、pET32a(+)， PCR 和双酶切鉴定阳性克隆 后测序， 序列测定正确后， 提取质粒。原核表达载体 pET32a-VEGF165转化 Rosetta 菌株， 在 100mlLB 培养基中， OD600达到约 0.5 时， 1mM IPTG 诱导表达 4h， VEGF165蛋白形成包涵体。超 声破菌后， 用 1SDS 上样缓冲液溶解包涵体， 测定靶蛋白的表达量。将制备好的 VEGF165蛋 白进行 SDS-PAGE 电泳， 割胶纯化蛋白。 0021 (2) 小鼠的免疫 0022 将纯化后的 VEGF165 蛋白溶解在 1PBS， 取适量的蛋白溶液与弗氏完全佐剂 (Sigma) 混匀乳化， 取。
13、 8 周龄的 BALB/c 雌鼠， 皮下多点注射抗原。2 周后， 取适量的蛋白溶 液与弗氏不完全佐剂 (Sigma) 混匀乳化， 在小鼠的皮下， 进行第二次免疫。以后每隔 3 周， 进行第三、 四次免疫。第四次免疫后 3 天， 取脾脏进行细胞融合。 0023 (3) 细胞融合和阳性克隆的筛选 0024 引颈处死小鼠， 用 70酒精消毒其体表。无菌条件下取出脾脏， 在灭菌不锈钢网 中， 用注射器向脾脏内注入 3ml 无血清培养液， 反复抽吸数次获得细胞悬液， 将细胞悬液注 入 50ml 离心管中， 加入 20ml 无血清培养液， 轻轻吹打数次， 1000rpm/min 离心。用无血清 培养液将细。
14、胞重悬， 与小鼠骨髓瘤细胞 SP2/0 以适当比例轻轻混匀， 在 37水浴锅中加入 PEG1400， 水浴 1.5min。加入无血清培养液 35ml， 离心。沉淀用含有 20 FCS 的 RPM1-1640 说 明 书 CN 102212135 A CN 102212142 A3/3 页 5 重悬， 每孔 200l 均分到 96 孔细胞培养板， 放入 37 5 CO2培养箱中培养。24h 后， 加入 选择培养液 HAT， 每 3 天换一次新鲜培养液。 0025 14 天后， 取细胞培养上清， ELISA 鉴定出阳性克隆。多次进行亚克隆鉴定阳性克隆 细胞成系， 继续体外培养 6 个月。选出 5 。
15、株高效表达细胞株， 分别命名为 18-1， 18-2， 18-3， 18-4， 18-5。 0026 (4) 单克隆抗体的鉴定 0027 血清 1 1000-1 50000 稀释， 100ngVEGF165蛋白上样， 进行 Western Blot 分析 抗体的特异性。将 VEGF165基因通过 TOPO 克隆方法连入表达载体 pLenti7.3/V5-TOPO， 真 核表达载体 pLenti7.3/V5-VEGF165利用 Lipofectamine 2000(Invitrogen) 介导瞬时转染 293T 细胞， 血清 1 100 稀释， 进行免疫荧光鉴定抗体。测定可知， 18-5 细胞株。
16、的抗体特异 性最好， 且能识别细胞内源表达的抗原。 0028 (4) 单克隆抗体可变区序列的获得 0029 利用 Trizol(Invitrogen) 法提取杂交瘤细胞株 18-5 的总 RNA， 然后用 oligo-dT 引物和 SuperScript II Reverse Transcriptase(Invitrogen) 反转录成 cDNA。根据小鼠 抗体重链和轻链的 FR1 区氨基酸序列， 合成兼并的寡核苷酸引物， 用作正向引物。反向引物 根据小鼠抗体的恒定区设计， 可将全部的可变区扩增得到。PCR 反应完成后， 分别将抗体重 链和轻链的 DNA 片段连于 TA 克隆载体， 挑取克隆进。
17、行测序。 0030 具体实施例 2 小鼠单克隆抗体的 Western-blot 和免疫荧光检测 0031 将VEGF165基因通过TOPO克隆方法连入表达载体pLenti7.3/V5-TOPO， 真核表达载 体pLenti7.3/V5-VEGF165利用Lipofectamine 2000(Invitrogen)介导瞬时转染293T细胞， 血清 1 100 稀释， 进行免疫荧光鉴定抗体。测定可知， 18-5 细胞株的抗体特异性最好， 且 能识别细胞内源表达的抗原。取培养细胞或细胞上清， 加入 3Loading buffer 煮沸 5 分 钟上样， westem-blot 检测。结果显示阳性蛋白条带的分子量与 VEGF165一致。 说 明 书 CN 102212135 A CN 102212142 A1/1 页 6 0001 序 列 表 CN 102212135 A CN 102212142 A1/1 页 7 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102212135 A 。