技术领域
本发明属于生物技术检测领域,具体涉及一种下肢动脉硬化闭塞症术后再狭窄鉴别诊断标记物及其试剂盒。
背景技术
慢性下肢缺血源于下肢动脉粥样硬化狭窄或闭塞导致的下肢供血不足,是最常见的使人失去正常行走能力的一类疾病,称之为下肢动脉硬化闭塞症1,主要表现为间歇性跛行、下肢静息痛以及坏疽等,严重影响患者的生活质量甚至危及生命2。随着我国生活水平的改善以及人口老龄化,下肢动脉硬化闭塞症的发病率也在逐年提高。
近年来随着医疗技术的飞速发展,下肢动脉硬化闭塞症的治疗也呈现多元化,如,旁路术、内膜剥脱术以及介入治疗等均能够有效恢复血供、改善症状3。在临床诊疗中,由于下肢动脉硬化闭塞症患者罹患疾病时往往年龄较高,且常合并冠心病、心力衰竭、脑梗等多种疾病,综合评估患者一般情况对旁路术和内膜剥脱术的耐受性较差。介入治疗以其创伤小、术后恢复快等优点相对于其他两种治疗方法在下肢动脉硬化闭塞症的手术治疗中更被广泛应用4。与此同时,有学者关注到“暂时灌注提高”现象5,6,7,即下肢动脉硬化闭塞症导致的慢性下肢缺血在介入治疗后,闭塞段动脉灌注得以暂时改善,为缺血组织的修复和闭塞段动脉周围侧枝循环的形成争取了一定时间,但当介 入干预后的动脉再次狭窄或闭塞时,就会使得原有病变处于亚临床缺血状态。因此,术后再狭窄成为了影响部分患者远期疗效的关键问题之一。
目前,针对术后再狭窄的CTA、血管造影等检查手段,因诊疗资源有限、检查费用昂贵等多种因素,往往不能在患者长期随访中常规实施,而需要患者再次出现间歇性跛行、静息痛甚至坏疽时才得以实施,此时往往需要再次手术甚至已失去保肢治疗的机会,严重者危及患者生命7。因此,寻找下肢动脉硬化闭塞症术后再狭窄的早期诊断生物标记物成为了亟待解决的关键科学问题之一,这对及时采取有效治疗措施、监测病情发展以及避免严重并发症发生具有重要意义。
Ranasinghe等8提出了理想的早期诊断指标应具备的一般特点:灵敏度高、特异性强、能够反映疾病的病程转归、快捷、易用、价格低廉、具有良好的临床应用前景和广泛的商业供应商。为下肢动脉硬化闭塞症术后再狭窄生物标记物的研究提供了理论标准。
在临床诊疗过程中,许多实验室检查项目以其迅速、能够在床边完成、并且对疾病具有较高的敏感度和特异度等特点,得到了广泛应用。近年来科学的重大发现微小RNA(mircoRNA,miRNA)是一类在人类和动物广泛存在并高度保守的小分子非编码RNA,其在心血管组织细胞发育与分化及结构形成异常过程中扮演了极为重要的角色。
新近研究表明,miRNA因具有组织特异性及高度保守的特性,使其具有作为疾病生物标记物的强大潜质。Ai等9通过急性心肌梗死 患者与对照组比较,结合模型小鼠中miR-1的过表达,证实在急性心肌梗死患者循环血中miR-1水平显著增高,两周后恢复到基础水平的变化趋势;荆清教授等10报道了急性心肌梗死患者较健康人循环血中显著增高的miR-208a,其血浆水平随病情转归而变化,且外周血中miR-208a早于心肌肌钙蛋白出现的特性,提示miR-208a可能是急性心肌梗死一个更敏感的早期生物标志物。
有研究显示,下肢动脉硬化闭塞症术后再狭窄是动脉损伤后的愈合反应11,其发生发展是一系列血管活性物质和生长因子介导的动脉内膜损伤后,内皮细胞和平滑肌细胞共同参与的修复过程稳态失衡的结果。近年来miRNA被报道在多种血管疾病的发生发展中发挥着重要作用:有研究显示,miR-221和miR-222高表达可抑制血管平滑肌细胞增殖、迁移和凋亡功能,而在内皮细胞中,miR-221和miR-222可以促进其增殖、迁移和凋亡;这种截然相反的作用可能会在血管疾病的发生发展中发挥重要作用13;Quintavalle M等14报道机械性血管损伤后,miR-21、miR-143和miR-145的表达变化会影响血管平滑肌细胞由收缩型向合成型转化,而miR-21和miR-145表达水平的恢复可避免血管再狭窄的发生,提示血管损伤修复后再狭窄过程中miRNA可能发挥这重要作用。那么,下肢动脉硬化闭塞症术后再狭窄的过程中是否也伴随着特定miRNA的表达改变,这些miRNA中是否会存在下肢动脉硬化闭塞症术后再狭窄潜在生物标记物呢,至今尚未有人给出答案。
参考文献:
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发明内容
本发明是为解决上述问题而进行的,目的在于提供一种灵敏度高、特异性强、能够反映疾病的病程转归、快捷、易用、价格低廉、具有良好的临床应用前景和广泛的商业供应商的下肢动脉硬化闭塞症术后再狭窄标记物以及相应的检测试剂盒。为了实现上述目的,本发明采用了以下技术方案:
本发明提供了一种miR-320a作为下肢动脉硬化闭塞症术后再狭窄鉴别标记物的应用,其中,所述miR-320a的序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步的,本发明还提供了一种下肢动脉硬化闭塞症术后再狭窄鉴别试剂盒,其特征在于,具有:血浆总RNA提取试剂组、外源参照物、RNA逆转录试剂组、RNA逆转录引物组、实时定量PCR试剂组、实时定量PCR引物组和实时定量PCR探针组。其中,RNA逆转录引物组包括miR-320a逆转录引物和外源参照物逆转录引物;实时定量PCR引物组包括miR-320a实时定量PCR引物和外源参实时定 量PCR引物;实时定量PCR探针组包括miR-320a实时定量PCR探针和外源参实时定量PCR探针。
在上述试剂盒中,外源参照物为cel-miR-39-3p,cel-miR-39-3p序列如SEQ ID NO.2所示,cel-miR-39-3p的所有核苷酸的2’O被甲基化修饰。
发明作用与效果
本发明提供的miR-320a作为下肢动脉硬化闭塞症术后再狭窄鉴别诊断标记物的应用以及一种针对miR-320a的下肢动脉硬化闭塞症术后再狭窄鉴别诊断试剂盒,实现了对下肢动脉硬化闭塞症术后再狭窄的灵敏度高、特异性强、能够反映疾病的病程转归、快捷、易用、价格低廉的诊断,具有良好的临床应用前景和广泛的商业供应商。
附图说明
图1是本发明的下肢动脉硬化闭塞症介入术后再狭窄组和对照组血浆中miRNA芯片实验扫描图(部分);
图2是芯片数据监督聚类分析结果图,其中,下肢动脉硬化闭塞症术后再狭窄组:N1、N2、N3、N11、N12、N13、N14、N15;下肢动脉硬化闭塞症术后长期随访康复者:N4、N6、N8、N10、N17;健康志愿者:N5、N7、N9、N16。
具体实施方式
以下结合附图来说明本发明的具体实施方式。
一、miR320a的获取
发明人在小样本的预实验中,在征得患者和健康志愿者知情同意并签署知情同意书的情况下,在患者初次出现下肢缺血症状就诊时采集患者和健康志愿者外周静脉血,并对受试者进行诊治和长期随访。1、病例与对照组的选择:
收集拟行手术治疗的357例下肢动脉硬化闭塞症患者血浆标本,同时收集年龄相仿的106例健康志愿者血浆标本。所有样本均在患者及其家属(或志愿者)签署知情同意书后以及符合伦理学等科学审查的前提下获得。
1.1纳入标准:
a.下肢动脉硬化闭塞:初次发生下肢动脉硬化闭塞、未手术治疗(股浅动脉病变的TASC分级A型、B型、C型患者);
b.志愿者:年龄相仿的健康志愿者;
c.下肢动脉硬化闭塞症术后再狭窄患者:术后随访6个月内再次出现下肢缺血症状,经下肢CTA或动脉造影获得影像学证据;
d.下肢动脉硬化闭塞症术后长期随访康复者:术后随访1年内未再次出现下肢缺血症状,经下肢CTA或动脉造影获得影像学证据;
1.2.排除标准
均无下肢手术史、无输血史、无肝肾功能不全;合并有股浅动脉以外其他下肢动脉病变的下肢动脉硬化闭塞症患者以及TASC分级D型患者(手术方式不同将导致组间、组内差异,故排除);
1.3.采集的标本分组:
a.实验组1(N=16):下肢动脉硬化闭塞症术后再狭窄患者;
实验组2(N=100):下肢动脉硬化闭塞症术后再狭窄患者;
实验组3(N=200):下肢动脉硬化闭塞症术后再狭窄患者;
b.空白对照组1(N=10):健康志愿者;
空白对照组2(N=100):健康志愿者;
空白对照组3(N=150):健康志愿者;
c.病例对照组1(N=16):下肢动脉硬化闭塞症术后长期随访康复者;
病例对照组2(N=100):下肢动脉硬化闭塞症术后长期随访康复者;
病例对照组3(N=150):下肢动脉硬化闭塞症术后长期随访康复者。
2、血液标本及临床资料的采集:
A.使用EDTA-K2抗凝管采集外周静脉血5ml,并于1小时内完成离心:820g,4℃,15min,取上清后16000g,4℃,10min;分别做好记录和标记后,移至RNAse-free冻存管,保存于-80℃冰箱中。
B.收集标本来源者的性别、年龄、现病史、吸烟饮酒史、合并症(高血压、糖尿病、高脂血症等)、临床分期、术前MRA或CTA所见的影像学各项指标(依据TASC分级记录闭塞段、闭塞长度、狭窄段、狭窄程度及长度、远端血供情况等),将这些参数整理成统计学数据库。
3、血浆标本中差异miRNAs的筛选和验证:
A.RNA的抽提:用基于Trizol法的QIAGEN miRNeasy Mini kit抽提血浆样品总RNA。
B.RNA质量检测:用Nanodrop测定RNA在分光光度计260nm、280nm和230nm波长的吸收值,以计算浓度并评估纯度;用甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳,检测RNA纯度及完整性。
C.循环miRNAs的检测:
a.筛选阶段:用Agilent Human miRNA 8×60K芯片V16.0对抽提后的miRNAs进行高通量筛选;
b.验证阶段:基于Taqman探针法的RT-qPCR验证候选miRNAs。
D.数据的采集及分析:用Agilent Feature Extraction(v10.7)提取原始数据并保存,用Agilent GeneSpring对原始数据进行分析,用SPSS16.0进行统计运算。
患者基本特征描述:Student’s t-test和Fisher’s exact test。
各组间miRNAs表达水平比较:ANOVA。
特定miRNA用于下肢动脉硬化闭塞症介入术后再狭窄早期诊断的敏感性及特异性分析:ROC曲线及AUC。
miRNAs与现有生物标记物比较:repeated-measures ANOVA。
E.筛选出下肢动脉硬化闭塞症介入术后再狭窄特异性及敏感性高的miRNAs。
4、特定miRNA与患者临床资料的相关性分析:
A.分析特定miRNA与下肢动脉硬化闭塞症介入术后再狭窄的 各项临床参数(如年龄、性别、临床分期等)、危险因素(如高血压、糖尿病、高脂血症等)、病程转归及预后等指标之间的相互关联。
B.患者随访,获取发病后3个月、6个月、1年及2年的随访信息(症状、影像资料)、外周静脉血标本;
C.与下肢动脉硬化闭塞症术后再狭窄金标准—下肢动脉造影相对比,分析特定miRNA在下肢动脉硬化闭塞症术后再狭窄早期诊断及预后等方面较较下肢动脉造影的优劣势;分析在病程转归方面特定miRNA较下肢动脉造影的变化趋势。
图1是下肢动脉硬化闭塞症介入术后再狭窄组和对照组血浆中miRNA芯片实验扫描图(部分)。
如图1所示,通过高通量技术对比下肢动脉硬化闭塞症术后再狭窄患者(A,n=8)、下肢动脉硬化闭塞症术后长期随访康复者(B,n=5)与健康志愿者(C,n=4)循环血中miRNA的差异表达,经显著性分析获得差异miRNA 61个。
图2是芯片数据监督聚类分析结果图。
在图1结果的基础上进一步经人工神经网络模型并结合芯片预测分析(Prediction analysis ofmicroarrays,PAM),得到图2中的与下肢动脉硬化闭塞症术后再狭窄密切相关的miR-320a等15个miRNA。这些miRNA中部分具有外周动脉组织特异性,其中不同miRNA的细胞来源可能不尽相同。
在上述15个miRNA中,miR-320a的诊断准确度为91.7%、特异性为97.6%、敏感度为90.3%,属于鉴别性能较强的miRNA。
综上所述,发明人提出这样的假说:下肢动脉硬化闭塞症术后再狭窄发生后,外周动脉组织中特别是内膜及中膜受损的细胞释放出miRNA进入血液循环,外周动脉组织特异的miRNA同时也进入了外周血,这些miRNA在健康人以及其他疾病患者的外周血中不存在或者丰度极低。这些特定miRNA可能预示着下肢动脉硬化闭塞症术后再狭窄发生及血管重构过程中起着关键作用的细胞或结构处于不同进程,因此,其中的一个或数个miRNA不仅有成为下肢动脉硬化闭塞症术后再狭窄早期诊断生物标记物的可能,还可能与下肢动脉硬化闭塞症术后再狭窄的病程转归及预后有着密切的联系。
二、下肢动脉硬化闭塞症术后再狭窄鉴别试剂盒的使用
在下述的具体实施过程中,相应步骤中使用的试剂如下:以购自Qiagen公司的miRNeasy Mini Kit进行RNA提取,其中包括2ml离心管(无盖)、1.5ml离心管(有盖)、QIAzol lysis Reagent、无RNA/DNA酶的水、RWT缓冲液、RPE缓冲液以及Rneasy Mini spin column滤过柱;以购自Applied Biosystems公司的MicroRNA Reverse Transcription Kit(货号4366597)进行RNA逆转录,其中包括:10×Reverse Transcription Buffer、100mM dNTPs(with dTTP)、20U/μL Rnase Inhibitor、50U/μL MμLtiScribeTM Reverse Transcriptase;以购自Applied Biosystems公司的Universal PCR Master Mix II,no UNG(货号4440048)进行实时定量PCR。此外,RNA逆转录引物以及实时定量PCR引物和探针为购自 Applied Biosystems公司的MicroRNA Assays(货号4427975),其中包括两部分,一部分用于反转录为:5×RT primer(反转录引物);一部分用于实时定量PCR扩增,包含了扩增引物和特异性探针,为:Small RNA Assay(20×),即此具体实施方式中实施定量PCR引物和探针是预先混合的。ABI公司的miRNA assays使用统一货号,具体某个miRNA又有其编号,涉及本项目的miR-320a的Assays ID为:002277;外源参照物cel-miR-39-3p(是否也采用该种外源参照物?)的Assays ID为:000200。
本发明的检测对象为患者的血浆样本。
1、血浆总RNA的提取
血浆中的总RNA的提取按照
miRNeasy Mini Kit(Qiagen,Hilden,Germany)的生厂商Qiagen公司提供的血浆标本总RNA提取标准说明书进行;标本在总RNA提取过程中掺入cel-miR-39-3p(序列如SEQ ID NO.2所示,所有核苷酸2’O甲基化修饰)作为PCR实验的外源性参照物,cel-miR-39-3p掺入量为0.4pmol/200μL血浆标本。具体如下:
(1)将cel-miR-39-3p模拟物使用无RNA/DNA酶的水配成0.08pmol/μL溶液;
(2)取200μL血浆/血清样品于2ml离心管中,加1000μL QIAzol lysis Reagent(样品体积的5倍),漩涡摇匀,使溶液均一无白色沉淀;
(3)室温放置5分钟;
(4)加5μL0.08pmol/μL cel-miR-39-3p溶液(仅用于PCR实验的标本提取总RNA时包含此步);
(5)加入200μL氯仿(为样品体积的1倍),漩涡摇匀,使溶液均一为粉红色;
(6)室温放置2-3分钟;
(7)12000g4℃条件下离心15分钟;
(8)取上层水相部分600μL置于已提供的2ml离心管中(不可触及中层白色物质),加900μL无水乙醇,抽打数次(请勿离心,可能会产生沉淀物,不会影响);
(9)取700μL样品,包含沉淀物,加入Rneasy Mini spin column(滤过柱)中,柔和的盖上盖子,室温下8000g离心15s。弃去滤过液;
(10)剩余样品重复第9步;
(11)向Rneasy Mini spin column加700μLRWT缓冲液,8000g,15℃离心15s洗柱,弃去滤过液;
(12)向Rneasy Mini spin column加500μLRPE缓冲液,8000g,15℃离心15s洗柱,弃去滤过液;
(13)重复第12部,离心后取出虑过柱,不要触及滤过液;
(14)将滤过柱置于新的2ml离心管,微量离心机全速离心2分钟(离心力>17000g);
(15)将滤过柱置于新的1.5ml离心管(试剂盒中已提供),加入50μL无RNA酶水,柔和的盖上盖子,静置1分钟,8000g,15℃离 心1分钟;
(16)取第15步中离心所得的溶液45μL加入滤过柱(不更换离心管);柔和的盖上盖子,静置1分钟,8000g,15℃离心1分钟;
(17)、所得溶液取1μL使用NP1000测定RNA质量及浓度,记录A260/280,A260/230及浓度;剩余溶液保存于-80℃冰箱或直接用于下一实验过程(芯片或qRT-PCR实验)。
2、逆转录反应
2.1准备样本总RNA
室温下溶解-80℃下保存的样品总RNA并混匀或提取的总RNA直接用于该实验。
2.2反转录主反应液制备
(1)将MicroRNA Reverse Transcription Kit中的各组分试剂置于冰上溶解;
(2)在聚丙烯管(PP管)中进行配液,该操作须在冰上进行,各组分比例按表1计算;在此推荐增加配液期望反应量的10-20%,以避免移液时试剂损耗带来的配液不足;
表1反转录主反应液的配置表
(3)混合时要缓慢,离心使溶液溶解混合在PT管底部(不可漩涡摇匀);
(4)在进行反转录前,需将配液置于冰上。
2.3准备反转录反应
(1)在冰上溶解5x反转录引物和RNA模板;使用前,漩涡震荡保存反转录引物的试剂管使其溶液均匀,并进行短暂离心;
(2)将准备好的总RNA进行以下操作:
①15μL反应体系中,按每7μL反转录主反应液中加入5μL总RNA(1-10ng)的比例混合,成为反转录主反应液-总RNA混合液;
②混合时要缓慢,短暂离心使溶液溶解混合在PT管底部(不可漩涡摇匀);
③将每12μL反转录主反应液-总RNA混合液转移至0.2ml PT管或者96孔板;
④在相应的管/孔中加入3μL反转录引物,使反应体系达到15μL;
⑤封板/管,轻柔的混合,短暂离心(不可漩涡摇匀);
⑥至少在冰上孵育5分钟,然后,保持该状态至进行反转录反应;
⑦按表2设定PCR仪的反应步骤和条件。
表2反转录反应条件
步骤 时间 温度(℃) 保持 30min 16 保持 30min 42 保持 5min 85 保持 ∞ 4
3、实时定量PCR(qPCR)反应
3.1准备qPCR反应
(1)将各组份置于冰上,小心倒置使其混合均匀后,放回冰上;
(2)按照20μL体系计算所需各组份体积(ABI推荐每个反应进行三次重复,为防止移液时试剂的消耗,增加总试剂使用体积20%),如表3;
表3qPCR反应体系的配制
(3)在微量离心管中混合各组份试剂;
(4)小心倒置离心管以混合溶液,再进行短暂离心。
3.2准备qPCR反应板
(1)转移20μL制备好的PCR反应液;
(2)使用光学粘性膜或者光学帽封板,短暂离心。
3.3进行PCR反应
(1)按照以下参数创建实验文件:
①模式:标准
②反应体系:20μL
③热循环参数如表4
(2)将反应板置入PCR仪;
(3)启动反应。
表4qPCR热循环设定
4、读取实验数据
(1)观察扩增曲线;
(2)设定基线及阈值获取实验数据。
实施例的作用与效果
本实施例中的项目针对下肢动脉硬化闭塞症术前、术后随访以及再狭窄发生系列过程中循环血特定miRNA为研究对象,在下肢动脉硬化闭塞症术后再狭窄疾病谱中进行大样本的定量验证,建立疾病早期诊断模型并对其进行独立样本验证和校正,获取了可作为下肢动脉硬化闭塞症术后再狭窄鉴别诊断标记物的miR-320a。miR-320a不仅灵敏度高、特异性强,而且稳定不易降解;同时,针对miR-320a的 下肢动脉硬化闭塞症术后再狭窄鉴别诊断试剂盒快捷、易用、价格低廉,具有良好的临床应用前景和广泛的商业供应商。为下肢动脉硬化闭塞症术后再狭窄的早期预警、病情监测及预后寻找到了临床可用的实验室检查指标。