一种抗人DAB2IP的单克隆抗体及其细胞株.pdf

本发明公开了一种可以抗人肿瘤抑制因子DAB2IP的单克隆抗体。本发明还公开了生产上述单克隆抗体的细胞株[CCTCC保藏号为C2013148]，由该细胞株分泌的单克隆抗体可以特异性识别人DAB2IP蛋白，从而为DAB2IP蛋白的检测及基于DAB2IP蛋白检测的应用研发奠定基础。

1.  一种制备单克隆抗体杂交瘤细胞株的方法，其特征在于，所述方法包 括，将DAB2IP基因（SEQ ID NO.1）重组表达，得到DAB2IP蛋白（SEQ ID NO.2）， 利用该蛋白免疫动物，再经细胞融合得到可以分泌DAB2IP单克隆抗体的细胞 株。

2.  权利要求1的方法，其特征在于，所述方法包括，将DAB2IP基因（SEQ  ID NO.1）重组到改造过的pET32a载体上，该载体同时含有6His tag和TRX tag， 并在6His tag和多克隆位点之间含有TEV酶切位点；将重组质粒在大肠杆菌 BL21菌株中进行表达，所表达的蛋白为TRX-6His-DAB2IP（SEQ ID NO.2）融 合蛋白，经TEV酶切及二次镍柱和分子筛纯化，得到纯化的DAB2IP蛋白（SEQ  ID NO.2），利用该蛋白免疫小鼠，再经细胞融合及亚克隆化得到可以分泌 DAB2IP单克隆抗体的细胞株。

3.  一种抗人肿瘤抑制因子DAB2IP单克隆抗体杂交瘤细胞株。

4.  权利要求3的杂交瘤细胞株，其保藏号为CCTCC No.C2013148。

5.  根据权利要求3或4的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述细胞株由权 利要求1或2的方法制备。

6.  一种由权利要求3-5任一项所述的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。

7.  一种DAB2IP蛋白（SEQ ID NO.2）作为抗原免疫动物得到的抗体。

8.  权利要求5或6所述的抗体在DAB2IP检测中的应用。

9.  一种用于检测人DAB2IP蛋白的试剂盒、试剂或药剂，其包括权利要 求6或7所述的抗体。

一种抗人DAB2IP的单克隆抗体及其细胞株
技术领域
本发明涉及一种抗体，具体涉及的是一种抗人肿瘤抑制因子DAB2IP的抗体。本发明还涉及生产该单克隆抗体的细胞株及其制备方法。 
背景技术
DAB2IP（DOC2／DAB2interaction protein）是一种新发现的肿瘤抑制基因，为Ras GTPase-activating protein（Ras GAP）家族的新成员。它与DAB2／DOC2蛋白的N末端相结合，是DAB2信号途径的下游效应器，而DAB2是一个重要的肿瘤抑制基因，在肿瘤的发生中发挥重要作用，并在多种肿瘤中低或缺失表达。DAB2IP作为一种新的GTPase激活蛋白，是Ras和肿瘤坏死因子介导的凋亡通路等多条信号通路中的重要环节，并且参与多种基因表达调节以及细胞的生长调控，因而具有功能多样性。研究发现DAB2IP基因在多个信号通路中都与肿瘤发生密切相关，通过Ras-Erk途径，Ask1-Jnk途径和PI3K-Akt途径等来控制细胞的增值、扩散、凋亡和生存。 
DAB2IP在体内的表达变化与多种肿瘤的发生发展以及转移密切相关，因而倍受人们的关注。该基因的低表达可见于前列腺癌、乳腺癌、胃肠肿瘤、肺癌、肝癌、子宫内膜癌、膀胱移形细胞癌等多种肿瘤中。在DAB2IP与各种肿瘤的关系中，研究最早、最多的当属其与前列腺癌发生发展的关系。Chen等发现人正常前列腺上皮细胞有DAB2IP基因表达，而在前列腺癌细胞DAB2IP基因表达缺失或下调，转染DAB2IP基因后前列腺癌细胞停止生长。还有人发现DAB2IP基因的降低可引起前列腺上皮中致癌基因Skp2的升高，引发肿瘤生长，而在正常的细胞中，DAB2IP基因会抑制致癌基因Skp2的表达。另外，研究表明DAB2IP基因的表达与前列腺癌的分级和预测预后呈负相关，故将DAB21P的低表达用于前列腺癌的预测和诊治中有重要意义。Dote等发现DAB2IP的基因沉默对胃肠癌和乳腺癌的发生起重要作用。Yano等认为DAB2IP可作为肺癌发生的一个生物标 志物。 
以上研究表明该基因在多种肿瘤的发生、发展和预后等方面都发挥了举足轻重的作用。DAB2IP可能提供预兆的生物标记和潜在的治疗癌症转移的靶点，将DAB2IP的低表达用于癌症的早期诊断和治疗中具有很好的前景。因此有效准确的检测DAB2IP成为一项关键的技术，而制备该蛋白特异性的单克隆抗体更成为一种迫切的需要，意义重大。 
吴建祥等公开了“蚕豆萎蔫病毒单克隆抗体研制”（浙江农业大学学报,1999,25(2):147-150），其全文引入本文作为参考。 
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗DAB2IP单克隆抗体杂交瘤细胞株及其分泌的的单克隆抗体。 
本发明的另一目的是提供一种制备上述单克隆抗体杂交瘤细胞株的方法。 
本发明的再一目的是提供一种上述单克隆抗体在DAB2IP检测中的应用。 
本发明通过如下技术方案实现： 
一种抗DAB2IP单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为CCTCC No.C2013148，保藏时间为2013年10月23日，保藏名称为杂交瘤细胞株DAB2IPMab1。 
经鉴定此抗体为IgG1亚类（中国典型培养物保藏中心地址：中国湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，邮编：430072）。 
本发明还提供了一种制备上述杂交瘤细胞株的方法，其特征在于，所述方法包括：将DAB2IP基因（SEQ ID NO.1）重组表达，得到DAB2IP蛋白（SEQ ID NO.2），利用该蛋白免疫动物，再经细胞融合得到可以分泌DAB2IP单克隆抗体的细胞株。所述动物是能够制备抗体的动物，优选哺乳动物，例如兔，小鼠，大鼠等。 
在一个具体的实施方案中，所述制备上述杂交瘤细胞株的方法包括，将DAB2IP基因（SEQ ID NO.1）重组到改造过的pET32a载体上，该载体同时含有6Histag和TRX tag，并在6His tag和多克隆位点之间含有TEV酶切位点；将重组质粒在大肠杆菌BL21菌株中进行表达，所表达的蛋白为TRX-6His-DAB2IP（SEQ ID NO.2）融合蛋白，经TEV酶（S219V）切及二次镍柱和分子筛纯化，得到纯化的 DAB2IP（SEQ ID NO.1）蛋白，利用该蛋白免疫小鼠，再经细胞融合及亚克隆化得到单克隆抗体杂交瘤细胞株。 
本发明还提供了一种由上述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。 
本发明还提供了DAB2IP蛋白（SEQ ID NO.2）作为抗原的应用，并且提供了一种DAB2IP蛋白（SEQ ID NO.2）作为抗原免疫动物得到抗体。 
本发明还提供了利用上述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体或DAB2IP蛋白（SEQ ID NO.2）作为抗原免疫动物得到抗体在检测人DAB2IP蛋白的应用。 
本发明还提供了用于检测人DAB2IP蛋白的试剂盒、试剂或药剂，其包括上述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体或DAB2IP蛋白（SEQ ID NO.2）作为抗原免疫动物得到抗体。 
本发明具有如下有益效果： 
本发明人发现了SEQ ID NO.2表示的DAB2IP蛋白的多肽片段（编码该多肽片段的DNA为SEQ ID NO.1表示的序列）。本发明重组人DAB2IP（SEQ ID NO.2）蛋白作为免疫抗原，免疫小鼠，采用细胞融合技术，通过筛选获得一株能稳定分泌抗DAB2IP的特异性单克隆抗体（亚型鉴定为IgG1亚类）的杂交瘤细胞株（保藏号为C2013148）。经ELISA检测，该单克隆抗体可以很特异性结合DAB2IP蛋白，且效价达到10^-8，表明制备的单克隆抗体具有高特异性和高灵敏度。该抗体可以用于DAB2IP蛋白的检测，并且可以用于开发相关的检测产品。 
附图说明
图1为DAB2IP的cDNA序列（SEQ ID NO.1）和氨基酸序列（SEQ ID NO.2）。 
图2为DAB2IP（SEQ ID NO.1）PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测（A）及载体构建示意图（B）。 
图3为DAB2IP蛋白表达与纯化的SDS-PAGE电泳检测；A：M，marker；1，TEV酶切前即TRX+6His+DAB2IP（SEQ ID NO.1）蛋白；2，TEV酶切后即DAB2IP（SEQ ID NO.1）蛋白。 
B：M，marker；1-7经superdex S200纯化的DAB2IP（SEQ ID NO.1）样品。 
具体实施方式
下面将结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式做进一步详细描述。以下实施例将有助于说明本发明，但本领域技术人员理解，下述实施例不以任何形式限制本发明。任何在本发明基础上做出的改进和变化，都在本发明的保护范围之内。 
1DAB2IP表达载体的构建 
1.1DAB2IP基因片段（SEQ ID NO.1）的获得 
为了获得SEQ ID NO.1表示DAB2IP基因片段序列，根据已公布DAB2IP cDNA序列设计一对特异性引物：正义链:5’-CGGGATCCAGGTCCTCCGGGGTCCAGC-3’（SEQ ID NO.3）;反义链：5’-ATTTGCGGCCGCTTACTGGGCATCAATGATCTTCTGTTT-3’（SEQ ID NO.4）；其中正义链含有BamHI酶切位点（GGATCC），反义链含有NotI酶切位点（GCGGCCGC）和终止密码子（TAA）。以DAB2IP全长cDNA为模板，用高保真酶（Primer HS STAR）DNA聚合酶（大连宝生物工程(TaKaRa)有限公司产品）进行PCR扩增，模板为扩增的含DAB2IP全长cDNA的pMD18T质粒，质粒浓度大约100ug/ml。 
反应体系是： 
2×PrimeSTAR GC缓冲液:25μl 
dNTP(每种均2.5mM):4μl 
正义引物(10μm):2μl 
反义引物(10μm):2μl 
模板(DAB2IP cDNA50ng/μl):2μl 
ddH₂O:14.5μl 
Prime HS STAR:0.5μl 
扩增条件是： 
98℃变性10s， 
55℃退火15s， 
72℃延伸1m30s， 
上述条件共循环33次。 
取PCR产物在1%琼脂糖凝胶中电泳（附图1），将该PCR产物测序确认正 确扩增了DAB2IP基因序列。 
1.2pET32a-TRX-His-DAB2IP（SEQ ID NO.1）载体的构建及大肠杆菌转化 
将步骤1.1得到的PCR产物和pET32a载体（购自Novagen）同时进行BamHI（购自TAKARA）和NotI（购自TAKARA）双酶切，酶切产物回收后用T4DNA连接酶（购自TAKARA）进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α。随后用步骤1.1中的特异性引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4对用质粒提取试剂盒（OMEGA,Plasmid Mini Kit I）从转化子中提取的质粒DNA（分光光度计测量浓度为500ng/μl,使用时稀释至50ng/μl）进行PCR（反应体系和扩增条件同上）以鉴定阳性转化子。提取阳性转化子的质粒进行BamHI和NotI双酶切，经1%琼脂糖凝胶检测可以得到与目标条带大小一致的序列，经测序确认序列正确。 
将重组质粒按如下条件转化表达菌株大肠杆菌BL21，得到含有pET32a-TRX-6His-DAB2IP质粒的大肠杆菌BL21菌株：从-80℃冰箱中取100μl感受态细胞，置于冰上解冻。待完全解冻后，加入连接产物，轻轻吹打均匀，冰浴30min，随后42℃温浴90秒，迅速置于冰浴中冷却3-5分钟。加入800μlLB液体培养基，混匀后37℃，150rpm振荡培养1h，之后涂布于含AMP抗性的平板上，37℃培养12-16h。 
1.3Pet32a-TRX-His-DAB2IP（SEQ ID NO.1）融合蛋白的诱导表达及纯化 
将含有pET32a-TRX-6His-DAB2IP（SEQ ID NO.1）质粒的大肠杆菌BL21菌株在含0.1mM氨苄青霉素（100mg/ml）的LB培养基（1%W/V NaCl，1%W/V胰蛋白胨和0.5%W/V酵母提取物）中培养至OD值0.5-0.6之间，加入诱导剂IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷）至终浓度0.3mmol/L，未加IPTG的菌液作为阴性对照。将上述菌液在16℃下培养12-14h，7000rpm离心5min收集菌体。将诱导的菌体和阴性对照菌体煮沸10分钟裂解，然后进行SDS-PAGE电泳分析。随后，选择阳性菌株按上述条件进行大量诱导，收集菌体后在裂解液（pH8.0Tris-Hcl，500mM NaCl，5%甘油）中进行超声破碎（功率380W，破碎30min），通过镍离子亲和层析（GE Healthcare）纯化，再用TEV蛋白酶切除标签后再通过镍离子亲和层析（同前）及分子筛（superdex S200，GE Healthcare）进行进一步纯化，用SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度达到90%左右（图 2），用于后续单克隆抗体制备。 
1.4抗人DAB2IP单克隆抗体的制备 
1.4.1免疫小鼠 
将步骤1.3中纯化的DAB2IP蛋白与完全弗氏佐剂（sigma）或不完全弗氏佐剂（sigma）按1∶1比例混合乳化。取5只4-6周龄的健康小鼠（BAlB/c小鼠），用上述DAB2IP蛋白与完全弗氏佐剂的乳化物进行腹腔免疫，每只小鼠每次50μg蛋白。8天后，用DAB2IP蛋白与不完全弗氏佐剂的乳化物对小鼠再次进行腹腔免疫。随后每隔7-10天用不加佐剂的DAB2IP蛋白进行一次免疫。细胞融合前4天，用DAB2IP蛋白进行加强免疫，分离小鼠脾细胞。 
1.4.2细胞融合 
取SP2/O骨髓瘤细胞与步骤1.4.1中得到的小鼠脾细胞按常规方法进行细胞融合后（吴建祥等,1999），加入HAT培养基（不完全培养基中含有15-20%V/V的FBS及2%V/V的HAT），轻轻吹打使细胞悬浮，最后加入到已有饲养细胞层（小白鼠腹水巨噬细胞）的96孔培养板中，每孔100μl，然后置5%CO₂、37℃孵箱培养进行融合。融合10天后，检测培养基上清中的特异性抗体（步骤见下文）。 
1.4.3阳性杂交瘤细胞的筛选及克隆 
筛选过程是以步骤1.3制备的DAB2IP蛋白作为抗原，取有杂交瘤细胞生长的培养孔的细胞培养上清液用间接ELISA方法检测。选择其中ELISA反应为阳性的杂交瘤细胞在HAT培养基中进行连续3次亚克隆培养，直至得到单克隆。 
1.5单克隆抗体的Ig亚类鉴定 
取1.4.3种筛选的单克隆细胞培养液上清各100μl加于包被有步骤1.3制备的DAB2IP蛋白的酶联条上，通过ELISA方法进行抗体类型鉴定，共检测6个类型，包括IgA、IgM、IgG1、IgG2A、IgG2B和IgG3，每种类型重复检测两次，经洗涤、免疫反应、显色及终止反应等步骤后，在ELISA读数仪（Thermo，MK3）上，双波长（630nm和450nm）处读数，结果如表1所示，所得到的单克隆抗体为IgG1亚类。 
表1 DAB2IP蛋白单克隆抗体的Ig亚类的ELISA鉴定 


(A-F分别代表IgA、IgM、IgG1、IgG2A、IgG2B和IgG3），结果显示此DAB2IP单克隆抗体为IgG1型。 
1.6单克隆抗体特异性和灵敏性的ELISA鉴定 
以步骤1.3制备的DAB2IP蛋白作为抗原，并用BSA蛋白（由TIANGEN购得）作为阴性对照，利用上述鉴定的单克隆抗体进行ELISA检测。在ELISA读数仪（Thermo，MK3）上，630nm和450nm）处读数，结果如表2所示，阴性对照不结合，而DAB2IP蛋白和抗体可以很特异性结合，且效价达到10^-8，表明制备的单克隆抗体为针对DAB2IP蛋白的特异性且灵敏度高的单克隆抗体。 
表2 DAB2IP单克隆抗体特异性和灵敏度的ELISA检测； 

（A为空白对照，B-D为阴性对照，E-I为抗体浓度稀释10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8后所测的ELISA读数，效价达到10^-8。） 
结果表明，阴性对照和抗体不结合，而DAB2IP蛋白和所鉴定的抗体可以很特异结合，且效价达到10^-8，表明制备得到针对DAB2IP蛋白特异性强且灵敏度高的单克隆抗体。 
将所得到的杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC，保藏号为C2013148）。