军团菌选择性分离培养基 技术领域：
这种发明涉及一种培养基，具体是一种适合对环境和临床标本中军团菌的分离培养，可减少杂菌污染、提高军团菌分离培养阳性率的军团菌选择性分离培养基。
背景技术：
目前，国内外公认的军团菌分离培养基是法国生物梅里埃(bioMérieux)、英国OXOID、美国BD、DIFCO公司等生产的BCYEα-CCVC、BCYEα-GVPC和BCYEα-GPVA等[1]，这些培养基大多价格昂贵(18～25元/1个平皿)，在医院临床和卫生防疫部门大量应用时，检测成本高。且对军团菌分离培养阳性率由一般为35.1％～65.0％[2-3]，阳性率比较低。因此现有的军团菌分离培养基不利于临床和卫生防疫部门推广应用。
发明内容：
本发明的目的是针对以上所述军团菌分离培养基存在的不足，提供一种成本低、分离培养阳性率偏高的军团菌选择性分离培养基。
本发明是这样实现的：军团菌选择性分离培养基，其包括的组份重量份数如下：
基础液：
酵母粉 8～13
琼脂 10～15
碳粉 1.5～2.5
ACES 8～13
a-酮戊二酸 0.5～1.5
焦磷酸铁 0.15～0.30
蛋白液：
甘氨酸 2.5～3.5
L-半胱氨酸 0.3～0.8
白蛋白 0.05～0.15
染料液
溴甲酚紫 0.005～0.02
溴酚兰 0.005～0.02
抗生素液：
万古霉素 0.0005～0.002
多粘菌素B 0.006～0.010
放线菌酮 0.006～0.010
制备步骤如下：
(1)基础液中的酵母粉、琼脂、碳粉、ACES和a-酮戊二酸按上述重量份数称量放置容器中，加水900～1000份，用KOH将pH值调至6.85；煮沸1分钟，然后再121℃高温灭菌15分钟；将焦磷酸铁溶于8～12份水中，过滤灭菌；将121℃高温灭菌后的酵母粉、琼脂、碳粉、ACES和a-酮戊二酸冷却至55℃后加入过滤灭菌的焦磷酸铁溶液混匀；
(2)将甘氨酸、L-半胱氨酸和白蛋白按上述重量份数称量放置容器中加入27～31份水进行溶解；
(3)、将溴甲酚紫和溴酚兰按上述重量份数称量放置容器中加入8～12份乙醇中进行溶解；
(4)将万古霉素、多粘菌素B和放线菌酮按上述重量份数称量放置容器中加入0.8～1.2份水中进行溶解；
(5)将(1)步骤的溶液加入(2)步骤得到的溶液中，所得到的混合液再加入(3)步骤得到的溶液中，最后将所得到的混合液加入(4)步骤所得到的溶液中混匀。
本发明在包括以酵母粉、活性炭、琼脂、ACES(N-2-乙酰氨基-2-氨基乙烷磺酸)缓冲剂、α-酮戊二酸、可溶性焦磷酸铁以及L-半胱氨酸等军团菌生长所必需的营养成分的基础配方上，添加染料溴麝香草酚兰和溴甲酚紫，在对军团菌进行选择性分离培养的同时可以使菌落显色，根据菌落形态和颜色鉴定和区分军团菌目标菌；添加选择性抗生素可抑制非军团菌属细菌如革兰阳性球菌、革兰阴性杆菌和霉菌类生长，从而提高军团菌分离培养阳性率。
与现有技术相比，本发明军团菌选择性分离培养基有益效果是：(1)添加的染料使军团菌生长过程中产生色素，根据菌落形态和颜色有利于鉴定和区分军团菌目标菌；(2)添加和调整选择性抗生素浓度，提高对非军团菌属及杂菌类的抑制能力，降低对军团菌种的抑制性，从而提高了对军团菌属分离培养阳性率；(3)降低检测成本、经济实用，便于临床和卫生防疫部门推广应用。
【附图说明】
图1是空白培养基的图。
图2是四区划线法接种军团菌ATCC33153标准菌株，培养72小时后的图片。
【具体实施方式】
以下结合实施例对本发明的具体实施例进行详细的说明。
实施例1
军团菌选择性分离培养基，其包括的组份重量份数如下：
基础液：
酵母粉 9～11
琼脂 12～14
碳粉 1.5～2.3
ACES 9～11
a-酮戊二酸 0.8～1.2
焦磷酸铁 0.22～0.27
蛋白液：
甘氨酸 2.8～3.2
L-半胱氨酸 0.4～0.6
白蛋白 0.08～0.12
染料液：
溴甲酚紫 0.008～0.012
溴酚兰 0.008～0.012
抗生素液：
万古霉素 0.0008～0.0012
多粘菌素B 0.007～0.009
放线菌酮 0.007～0.009
制备步骤如下：
(1)基础液中的酵母粉、琼脂、碳粉、ACES和a-酮戊二酸按上述重量份数称量放置容器中，加水930～980份，用KOH将pH值调至6.85；煮沸1分钟，然后再121℃高温灭菌15分钟；将焦磷酸铁溶于9～11份水中，过滤灭菌；将121℃高温灭菌后的酵母粉、琼脂、碳粉、ACES和a-酮戊二酸冷却至55℃后加入过滤灭菌的焦磷酸铁溶液混匀；
(2)将甘氨酸、L-半胱氨酸和白蛋白按上述重量份数称量放置容器中加入28～30份水进行溶解；
(3)、将溴甲酚紫和溴酚兰按上述重量份数称量放置容器中加入9～11份乙醇中进行溶解；
(4)将万古霉素、多粘菌素B和放线菌酮按上述重量份数称量放置容器中加入0.9～1.1份水中进行溶解；
(5)将(1)步骤的溶液加入(2)步骤得到的溶液中，所得到的混合液再加入(3)步骤得到的溶液中，最后将所得到的混合液加入(4)步骤所得到的溶液中混匀。
实施例2
军团菌选择性分离培养基(BCYEα+DGVPC)，包括的组份重量份数如下：
基础液：
酵母粉 10
琼脂 13
碳粉 2.0
ACES 10
a-酮戊二酸 1.0
焦磷酸铁 0.25
蛋白液：
甘氨酸 3.0
L-半胱氨酸 0.5
白蛋白 0.1
染料液：
溴甲酚紫 0.01
溴酚兰 0.01
抗生素液：
万古霉素 0.001
多粘菌素B 0.008
放线菌酮 0.008
制备步骤如下：
(1)基础液中的酵母粉、琼脂、碳粉、ACES和a-酮戊二酸按上述重量份数称量放置容器中，加水950份的水，用KOH将pH值调至6.85；煮沸1分钟，然后再121℃高压灭菌(15磅)15分钟；将焦磷酸铁溶于10份水中，过滤灭菌；将高压灭菌后的酵母粉、琼脂、碳粉、ACES和a-酮戊二酸，冷却至55℃后加入过滤灭菌的焦磷酸铁溶液混匀；
(2)、将甘氨酸、L-半胱氨酸、白蛋白按上述重量份数称量放置容器中加入29份的水进行溶解；
(3)、将溴甲酚紫、溴酚兰按上述重量份数称量放置容器中加入10份的乙醇中进行溶解；
(4)将万古霉素、多粘菌素B、放线菌酮按上述重量份数称量放置容器中加入1份水中进行溶解；
(5)将(1)步骤的溶液加入(2)步骤得到的溶液中，所得到的混合液再加入(3)步骤得到的溶液中，最后将所得到的混合液加入(4)步骤所得到的溶液中混匀。
实施例3
军团菌选择性分离培养基，其包括的组份重量份数如下：
基础液：
酵母粉 8
琼脂 10
碳粉 1.5
ACES 8
a-酮戊二酸 0.5
焦磷酸铁 0.15
蛋白液：
甘氨酸 2.5
L-半胱氨酸 0.3
白蛋白 0.05
染料液
溴甲酚紫 0.005
溴酚兰 0.005
抗生素液
万古霉素 0.0005
多粘菌素B 0.006
放线菌酮 0.006
制备步骤如下：
(1)基础液中的酵母粉、琼脂、碳粉、ACES和a-酮戊二酸按上述重量份数称量放置容器中，加水900份，用KOH将pH值调至6.85；煮沸1分钟，然后再121℃高温灭菌15分钟；将焦磷酸铁溶于8份水中，过滤灭菌；将121℃高温灭菌后的酵母粉、琼脂、碳粉、ACES和a-酮戊二酸冷却至55℃后加入过滤灭菌的焦磷酸铁溶液混匀；
(2)将甘氨酸、L-半胱氨酸和白蛋白按上述重量份数称量放置容器中加入27份水进行溶解；
(3)、将溴甲酚紫和溴酚兰按上述重量份数称量放置容器中加入8份乙醇中进行溶解；
(4)将万古霉素、多粘菌素B和放线菌酮按上述重量份数称量放置容器中加入0.8份水中进行溶解；
(5)将(1)步骤的溶液加入(2)步骤得到的溶液中，所得到的混合液再加入(3)步骤得到的溶液中，最后将所得到的混合液加入(4)步骤所得到的溶液中混匀。
实施例4
军团菌选择性分离培养基，其包括的组份重量份数如下：
基础液：
酵母粉 13
琼脂 15
碳粉 2.5
ACES 13
a-酮戊二酸 1.5
焦磷酸铁 0.30
蛋白液：
甘氨酸 3.5
L-半胱氨酸 0.8
白蛋白 0.15
染料液
溴甲酚紫 0.02
溴酚兰 0.02
抗生素液
万古霉素 0.002
多粘菌素B 0.010
放线菌酮 0.010
制备步骤如下：
(1)基础液中的酵母粉、琼脂、碳粉、ACES和a-酮戊二酸按上述重量份数称量放置容器中，加水1000份，用KOH将pH值调至6.85；煮沸1分钟，然后再121℃高温灭菌15分钟；将焦磷酸铁溶于12份水中，过滤灭菌；将121℃高温灭菌后地酵母粉、琼脂、碳粉、ACES和a-酮戊二酸冷却至55℃后加入过滤灭菌的焦磷酸铁溶液混匀；
(2)将甘氨酸、L-半胱氨酸和白蛋白按上述重量份数称量放置容器中加入31份水进行溶解；
(3)、将溴甲酚紫和溴酚兰按上述重量份数称量放置容器中加入12份乙醇中进行溶解；
(4)将万古霉素、多粘菌素B和放线菌酮按上述重量份数称量放置容器中加入1.2份水中进行溶解；
(5)将(1)步骤的溶液加入(2)步骤得到的溶液中，所得到的混合液再加入(3)步骤得到的溶液中，最后将所得到的混合液加入(4)步骤所得到的溶液中混匀。
本发明在军团菌选择性基础培养基的配方体系中，添加溴麝香草酚兰和溴甲酚紫燃料液和选择性抗生素。溴麝香草酚兰和溴甲酚紫在对军团菌进行选择性分离培养的同时可以使菌落显色，根据菌落形态和颜色鉴定和区分军团菌目标菌。选择性抗生素可抑制非军团菌属细菌如革兰阳性球菌、革兰阴性杆菌和霉菌类生长，从而提高军团菌分离培养阳性率。其中甘氨酸(glycine)对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度分别为1280μg/ml和160μg/ml；对痢疾杆菌的最低抑菌浓度为640μg/ml；对伤寒杆菌的最低抑菌浓度为1280μg/ml和640μg/ml；对大肠杆菌的最低抑菌浓度为1280μg/ml；万古霉素(vancomycin)对金黄色葡萄球菌具有较强的抑制作用；多粘菌素B(polymixin B)对绿脓杆菌和其他革兰阴性杆菌有明显抑制作用；放线菌酮(Cycloheximide)对霉菌类有明显抑制作用。
临床检测试验
将检测军团菌标本经过处理后，接种在本发明培养基中，于36℃，5％CO2孵箱中，培养2～3天，一般情况下军团菌的生长明显，如图1和图2所示，图2可以明显看到军团菌的生长情况；也可能培养至1周方可观察到军团菌。该选择性培养基的特点是进行选择性分离培养的同时，可以使菌落显色，根据菌落形态和颜色鉴定和区分军团菌目标菌；此外，调整了抗生素浓度，增强了对其它非军团菌属的抑制能力，降低对军团菌种的抑制性，从而提高了对军团菌属细菌分离培养的阳性率。
通过本发明对本地区采集的206份环境水样进行军团菌分离并和一些常用的培养基进行对比试验，如下表所示，军团菌分离培养阳性率由35.1％～65.0％[2，3]提高到50％～80％，并且降低成本3-5倍(3～5元/1个平皿)。
本发明的培养基一方面，既可以当作普通BCYEα-基础培养基使用，防止培养过程中，其他细菌的污染；另一方面，利于通过菌落形态和颜色鉴定军团菌，可以抑制杂菌生长，大大提高军团菌分离培养检出阳性率。