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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810815564.9 (22)申请日 2018.07.24 (71)申请人 江苏徐淮地区徐州农业科学研究所 (江苏徐州甘薯研究中心) 地址 221231 江苏省徐州市鲲鹏路 (72)发明人 何弯弯王健康丁成伟郭荣良 吴玉玲徐家安王友霜胡婷婷 赵轶鹏 (74)专利代理机构 南京汇恒知识产权代理事务 所(普通合伙) 32282 代理人 夏恒霞 (51)Int.Cl. C12N 1/04(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 稻瘟病菌株的长。
2、期保存方法 (57)摘要 本发明公开了一种稻瘟病菌株的长期保存 方法。 所述方法以滤纸为保存介质， 实现对稻瘟 病菌株的长期保存， 实施步骤如下： 1)玉米粉稻 秸秆琼脂培养基的制备； 2)滤纸片放置于凝固的 玉米粉稻秸秆琼脂培养基平板上； 3)将活化后的 稻瘟病菌株接种到平板上； 4)将长满稻瘟病菌株 的滤纸取出； 5)将滤纸在超净台内进行干燥处 理； 6)将滤纸保存于-20。 本发明方法简单， 污 染较少， 保存周期长， 减少活化次数， 菌株性状稳 定， 同时节省保存空间， 菌株活化方便。 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 CN 108865890 A 2018.11.23 CN 10。
3、8865890 A 1.稻瘟病菌株的长期保存方法， 其特征在于， 具体步骤如下： 步骤1， 按玉米粉40g/L， 琼脂20g/L， 稻秸秆粉末2040g/L， 无菌水1000ml配制玉米粉 稻秸秆琼脂培养基； 步骤2， 将玉米粉稻秸秆琼脂培养基高压灭菌， 倒入培养皿中， 制成培养平板； 步骤3， 将滤纸片平铺于凝固的玉米粉稻秸秆琼脂培养基平板上； 步骤4， 将在马铃薯琼脂培养基活化后的稻瘟病菌株接种到玉米粉稻秸秆琼脂培养基 平板上； 步骤5， 将培养皿倒扣放置， 于25恒温培养至菌株长满培养皿； 步骤6， 将滤纸片取出， 放置于纸袋中； 步骤7， 在纸袋上注明菌株信息及保存时间； 步骤8， 吹。
4、干， 放置于装有干燥剂的铝盒中； 步骤9， 用保鲜膜包裹铝盒， 放于-20下长期保存。 2.根据权利要求1所述的长期保存方法， 其特征在于， 步骤1中， 所述的稻秸秆粉末是将 稻秸秆粉碎所得。 3.根据权利要求1所述的长期保存方法， 其特征在于， 步骤3中， 所述的滤纸片面积大小 为12cm2。 4.根据权利要求1所述的长期保存方法， 其特征在于， 步骤6中， 所述的纸袋的规格为 50*100mm。 5.根据权利要求1所述的长期保存方法， 其特征在于， 步骤8中， 铝盒的规格为235*125* 60mm。 6.根据权利要求1所述的长期保存方法， 其特征在于， 步骤9中， 所述的干燥剂为变色硅 。
5、胶。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108865890 A 2 稻瘟病菌株的长期保存方法 技术领域 0001 本发明属于菌株保藏技术领域， 涉及一种稻瘟病菌株的长期保存方法。 背景技术 0002 稻瘟病是由子囊真菌引起的一种世界性的病害， 可引起水稻大幅度减产， 严重时 减产4050， 甚至颗粒无收。 稻瘟病在水稻的整个生育期均可发生， 具有危害时间长， 症状多样化以及侵染部位多等特点。 由于稻瘟病菌小种的遗传复杂性及致病力的易变性， 抗性品种在推广种植3-5年后， 抗性就会减弱或丧失。 选育和种植抗稻瘟病品种是防治稻瘟 病最经济、 有效和安全的措施， 实时、 准确地了解和掌握各稻区稻瘟病。
6、菌群体组成及生理小 种变化动态趋势， 对防控稻瘟病都具有重要的理论和实际意义， 而稻瘟病菌株的保存是完 成这一科研工作的基础。 0003 目前稻瘟病菌株保存的方法主要有： 干燥低温保存法、 高粱粒保存法、 斜面保存法 和斜面滤纸保存法。 干燥低温保存法是先将平板上的孢子洗脱下来， 利用真空泵将孢子收 集在滤纸上， 然后干燥滤纸进行保存。 该方法的优点是菌株不易变异， 不容易被其他真菌或 细菌污染。 缺点是操作麻烦， 需要专门设备。 高粱粒保存法是将高粱粒煮至八分熟， 灭菌后 将菌株移入， 待高粱粒长满菌丝， 放入试管进行干燥， 待高粱粒完全干燥后置于-20冷冻 保存。 其优点是便于活化， 保存。
7、菌株量大， 操作简单， 不需要特殊设备。 缺点是保存过程复 杂， 容易发生霉变污染， 并且保存时所占体积较大， 玻璃器皿易碎、 破裂等问题。 斜面保存法 是将马铃薯琼脂培养基倒入试管中， 灭菌后摆斜面， 将菌株块移入进行培养， 待菌株长满培 养基放4保存。 该方法操作简单， 不易污染， 直接看出菌株的活性状态。 缺点是保存时间不 长， 菌株的生长并未全部被抑制， 容易发生变异， 培养基成分会被菌株消耗， 需要经常更换 培养基， 需要占用大量的储存空间， 玻璃器皿易碎、 破裂等问题。 斜面滤纸保存法是将稻瘟 病菌株在试管斜面培养基上培养， 待菌丝长满斜面再放入滤纸， 滤纸在长满孢子后取出， 干 。
8、燥， 放于-20下长期保存。 。 该方法的优点是所需工具简单， 操作简便， 所占空间也小， 并 且经过很长一段时间后， 稻瘟病菌的致病性基本没有变化。 缺点是试管较小， 每次保存滤纸 片量较小， 一个菌株需要多个试管斜面进行培养保存， 马铃薯琼脂培养基营养丰富， 易污 染， 容易发生菌株变异。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种操作简单， 不需要专门设备， 保存时间长且菌株性状 稳定， 不易污染， 节省保存空间， 提高保存效率和质量的稻瘟病菌株的长期保存方法。 0005 为了达到以上目的， 本发明采用如下技术方案： 0006 稻瘟病菌株的长期保存方法， 具体步骤如下： 0007 步骤。
9、1， 按玉米粉40g/L， 琼脂20g/L， 稻秸秆粉末2040g/L， 无菌水1000ml配制玉 米粉稻秸秆琼脂培养基； 0008 步骤2， 将玉米粉稻秸秆琼脂培养基高压灭菌， 倒入培养皿中， 制成培养平板； 说明书 1/3 页 3 CN 108865890 A 3 0009 步骤3， 将滤纸片平铺于凝固的玉米粉稻秸秆琼脂培养基平板上； 0010 步骤4， 将在马铃薯琼脂培养基(PDA)活化后的稻瘟病菌株接种到玉米粉稻秸秆琼 脂培养基平板上； 0011 步骤5， 将培养皿倒扣放置， 于25恒温培养至菌株长满培养皿； 0012 步骤6， 将滤纸片取出， 放置于纸袋中； 0013 步骤7， 在纸。
10、袋上注明菌株信息及保存时间； 0014 步骤8， 吹干， 放置于装有干燥剂的铝盒中； 0015 步骤9， 用保鲜膜包裹铝盒， 放于-20下长期保存。 0016 优选地， 步骤1中， 所述的稻秸秆粉末是将稻秸秆粉碎所得。 0017 步骤2、 步骤3、 步骤4、 步骤6、 步骤7和步骤8均在无菌超净工作台上进行操作， 且实 验过程中所用的接菌针， 镊子， 滤纸， 纸袋等都经过高温灭菌， 高压灭菌条件为121下灭菌 25分钟。 0018 步骤3中， 所述的滤纸片面积大小为12cm2。 0019 步骤6中， 所述的纸袋的规格为50*100mm。 0020 步骤8中， 铝盒的规格为235*125*60m。
11、m。 0021 步骤9中， 所述的干燥剂为变色硅胶。 0022 与现有技术相比， 本发明具有以下优点： 0023 (1)本发明利用稻秸秆粉末配制培养基， 提供了稻瘟病菌株生长所需成分； 0024 (2)本发明保存方法简单， 操作便捷， 一个培养皿可以放几十个滤纸片， 一个菌株 的保存只需要12个培养皿， 工作量小； 0025 (3)本发明保存时间长久， 不易污染， 铝盒中的干燥剂可以定期更换， 保证滤纸片 一直处于干燥的环境中； 0026 (4)本发明占用空间小， 一个铝盒中能存放2030份菌株。 0027 (5)经本发明方法保存后的菌株活化简便， 只需要将滤纸片取出放入培养基中， 不 易污染。
12、。 附图说明 0028 图1为本发明将菌体植入培养基中， 并铺上滤纸示意图。 0029 图2是本发明将植菌植入培养基中， 并铺上滤纸四天后的示意图。 具体实施方式 0030 下面结合附图与实施例对本发明作进一步详述。 0031 本发明所用的培养基、 滤纸、 培养皿、 纸袋、 接菌针、 镊子均经过高温灭菌处理(121 ， 25min)， 步骤2)、 步骤3)、 步骤4)、 步骤6)、 步骤7)和步骤8)均在无菌超净工作台上进行 操作。 0032 实施例1 0033 稻瘟病菌株的长期保存方法， 包括以下步骤： 0034 1)玉米粉稻秸秆琼脂培养基(RCA)的制备： 按常规方法制备培养基， 培养基成。
13、分 为： 玉米粉40g， 琼脂20g， 稻秸秆粉末20g， 无菌水1000ml。 说明书 2/3 页 4 CN 108865890 A 4 0035 2)高压灭菌， 倒入培养皿中， 制成培养平板； 0036 3)将滤纸片平铺于凝固的玉米粉稻秸秆琼脂培养基平板上； 0037 4)将在马铃薯琼脂培养基(PDA)活化后的稻瘟病菌株接种到玉米粉稻秸秆琼脂培 养基平板上； 0038 5)将培养基培养皿倒扣放置， 于25培养至菌株长满培养皿； 0039 6)用镊子将滤纸片取出， 放置于纸袋中； 0040 7)在纸袋上注明菌株信息及保存时间； 0041 8)在超净台吹干， 放置于装有变色硅胶的铝盒中； 00。
14、42 9)用保鲜膜包裹铝盒， 放于-20长期保存。 0043 实施例2 0044 稻瘟病菌株长期保存方法包括以下步骤： 0045 1)玉米粉稻秸秆琼脂培养基(RCA)的制备： 按常规方法制备培养基， 培养基成分 为： 玉米粉40g， 琼脂20g， 稻秸秆粉末40g， 无菌水1000ml。 0046 2)高压灭菌， 倒入培养皿中， 制成培养平板； 0047 3)将滤纸片平铺于凝固的玉米粉稻秸秆琼脂培养基平板上； 0048 4)将在马铃薯琼脂培养基(PDA)活化后的稻瘟病菌株接种到玉米粉稻秸秆琼脂培 养基平板上； 0049 5)将培养基培养皿倒扣放置， 于28培养箱至菌株长满培养皿； 0050 6。
15、)用镊子将滤纸片取出， 放置于纸袋中； 0051 7)在纸袋上注明菌株信息及保存时间； 0052 8)在超净台吹干， 放置于装有变色硅胶的铝盒中； 0053 9)用保鲜膜包裹铝盒， 放于-80长期保存。 0054 对实施例1和2所保存的菌株进行活化， 取保存1、 3、 5年的样品活化测其存活情况， 结果见表1。 0055 表1在-20及-80条件下保存不同年限后菌株的存活情况。 0056 0057 对比例1 0058 本对比例与实施例1基本相同， 唯一不同的是在配制培养基过程中， 未加入稻秸秆 粉末。 说明书 3/3 页 5 CN 108865890 A 5 图1 图2 说明书附图 1/1 页 6 CN 108865890 A 6 。