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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810485209.X (22)申请日 2018.05.21 (83)生物保藏信息 CCTCC No:M 2018211 2018.04.16 (71)申请人 黑龙江东方学院 地址 150008 黑龙江省哈尔滨市南岗区学 府路331号 (72)发明人 接伟光郭娜乔巍张颖智 张睿张俊山姚延轩 (74)专利代理机构 哈尔滨市文洋专利代理事务 所(普通合伙) 23210 代理人 何强 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12R 1/125(2006.0。
2、1) (54)发明名称 一株产碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌 (57)摘要 一株产碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌， 其为枯 草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)DFSW101保藏 于中国典型培养物保藏中心， 保藏号为CCTCC No:M2018211。 该菌株具有高耐碱性可在pH值为 13.0、 温度为68和10NaCl的多重胁迫条件下 生长， 最佳产碱性蛋白酶环境pH值为11.0。 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 CN 108587978 A 2018.09.28 CN 108587978 A 1.一株产碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌， 其为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 。
3、DFSW101保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏号为CCTCC No:M 2018211。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108587978 A 2 一株产碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌 技术领域 0001 本发明涉及一种枯草芽孢杆菌。 背景技术 0002 蛋白酶指能够水解蛋白质肽链的一类酶的总称。 根据蛋白酶降解多肽的方式不 同， 可将其分为内肽酶和端肽酶。 内肽酶能够将大分子量的多肽链从中间切断， 进而形成分 子量较小的朊和胨； 端肽酶分为羧肽酶和氨肽酶， 它们能够分别从多肽的游离羧基末端或 游离氨基末端逐一将肽链水解生成氨基酸。 按其反应的最适pH值， 可将蛋白酶分为酸性、 中 性和碱性。
4、蛋白酶。 蛋白酶广泛存在于动物内脏、 植物茎叶、 果实和微生物中。 蛋白酶是一种 重要的工业酶制剂， 能催化蛋白质和多肽水解， 已广泛应用于皮革、 食品、 医药、 环境治理等 方面。 0003 在污水生物处理的过程中， 会产生大量的污泥， 污泥中含有许多难被分解的大分 子有机物， 如难分解的蛋白质， 通常需要利用机械破碎、 超声破碎或发酵等方式， 才能使污 泥中的这些大分子有机物从细胞中释放出来。 污泥碱性发酵是将污泥厌氧消化过程与碱预 处理方法相结合， 有效地将污泥中的内碳源以挥发性脂肪酸的形式累积， 进而实现污泥的 资源化利用。 发明内容 0004 本发明提供了一株产碱性蛋白酶的枯草芽孢杆。
5、菌， 该菌株具有高耐碱性可在pH值 为13.0、 温度为68和10NaCl的多重胁迫条件下生长， 最佳产碱性蛋白酶环境pH值为 11.0。 0005 本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFSW101为革兰氏阳性菌， 菌株个体呈 直杆状， 长为3.093.48 m， 宽为0.901.21 m， 常以成对或链状排列， 具圆端， 周生鞭毛； 枯草芽孢杆菌DFSW101菌落形状不规则， 边缘呈锯齿形， 灰白色， 菌落扁平， 无光泽， 表面有 皱褶， 不透明， 不易挑起。 0006 本发明枯草芽孢杆菌DFSW101无荚膜， 每一个细胞产一个芽孢， 芽孢位于菌体近中 央， 芽孢呈椭圆。
6、或卵圆， 芽孢形成后菌体略膨大， 如图1所示。 0007 本发明枯草芽孢杆菌DFSW101好氧， 葡萄糖发酵为阳性、 蔗糖发酵为阳性、 乳糖发 酵为阳性、 果糖发酵为阳性、 纤维二糖发酵为阳性、 鼠李糖发酵为阴性、 麦芽糖发酵为阳性、 D-木糖发酵为阴性、 山梨醇发酵为阳性、 甘露醇发酵为阳性、 L-阿拉伯糖发酵为阳性、 柠檬 酸盐利用试验为阳性、 甲基红试验为阴性、 V-P试验为阳性、 硝酸盐还原试验为阳性、 亚硝酸 盐还原试验为阳性、 淀粉水解试验为阳性、 明胶液化试验为阳性、 产氨试验为阳性、 生长温 度68试验为阳性、 质量浓度2的NaCl耐盐性试验为阳性、 质量浓度3的NaCl耐盐性。
7、试 验为阳性、 质量浓度7的NaCl耐盐性试验为阳性、 质量浓度10的NaCl耐盐性试验为阳 性、 pH 8.013的NaOH耐碱试验为阳性。 0008 产酶液体培养基(由40g葡萄糖、 20g蛋白胨、 1.4g磷酸氢二钠、 0.6g氯化钙、 0.4g硫 说明书 1/3 页 3 CN 108587978 A 3 酸镁和1000mL蒸馏水组成， pH值为11.0， 121灭菌20min)中投加枯草芽孢杆菌DFSW101， 然 后在130r/min、 2852条件下发酵培养至枯草芽孢杆菌DFSW101菌数浓度达到11071 108cfu/mL， 发酵液中碱性蛋白酶的酶活力可达1940U/mL以上。。
8、 0009 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFSW101属于芽孢杆菌属(Bacillus)； 保藏于 中国典型培养物保藏中心(CCTCC)， 保藏地址是中国武汉， 武汉大学， 保藏编号为CCTCC No: M2018211， 保藏日期为2018年4月16日。 附图说明 0010 图1是枯草芽孢杆菌DFSW101菌株形态透射电镜图。 具体实施方式 0011 本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式， 还包括各具体实施方式间的 任意组合。 0012 具体实施方式一： 本实施方式枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFSW101保藏号 为CCTCC No:M 2。
9、018211。 0013 本实施方式枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFSW101采用传统微生物分离纯 化方法从哈尔滨太平污水处理厂的剩余污泥中经碱性发酵后分离筛选得到。 经16S rDNA序 列Genbank比对， 并结合菌株、 菌落形态、 生理生化指标， 判定该菌株为芽孢杆菌属 (Bacillus)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。 16S rDNA比对结果如表1所示。 0014 表1 0015 0016 0017 本实施方式枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFSW101能在1068环境中 生长， 最适生长温度为2852， 最佳产碱性蛋。
10、白酶温度为32。 0018 本实施方式枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFSW101可在pH值5.013.0条件 下生长， 最佳产碱性蛋白酶环境pH值为11.0。 0019 具体实施方式二： 本实施方式产酶液体培养基(由40g葡萄糖、 20g蛋白胨、 1.4g磷 酸氢二钠、 0.6g氯化钙、 0.4g硫酸镁和1000mL蒸馏水组成， pH值为11.0， 121灭菌20min)中 投加5的枯草芽孢杆菌DFSW101， 然后在130r/min、 28条件下发酵培养至菌数浓度达到1 1071108cfu/mL。 说明书 2/3 页 4 CN 108587978 A 4 0020 采。
11、用Folin试剂显色法测定碱性蛋白酶的酶活力： 在pH值为11.0、 30条件下， 以 1mL发酵液每分钟水解酪蛋白产生1 g酪氨酸所需酶量定义为1个酶活力单位。 0021 本实施方式发酵液中碱性蛋白酶的酶活力为1940U/mL。 0022 具体实施方式三： 本实施方式产酶液体培养基(由40g葡萄糖、 20g蛋白胨、 1.4g磷 酸氢二钠、 0.6g氯化钙、 0.4g硫酸镁和1000mL蒸馏水组成， pH值为11.0， 121灭菌20min)中 投加5的枯草芽孢杆菌DFSW101， 然后在130r/min、 52条件下发酵培养至菌数浓度达到1 1071108cfu/mL。 0023 采用Fol。
12、in试剂显色法测定碱性蛋白酶的酶活力： 在pH值为11.0、 30条件下， 以 1mL发酵液每分钟水解酪蛋白产生1 g酪氨酸所需酶量定义为1个酶活力单位。 0024 本实施方式发酵液中碱性蛋白酶的酶活力为1980U/mL。 0025 具体实施方式四： 本实施方式产酶液体培养基(由40g葡萄糖、 20g蛋白胨、 1.4g磷 酸氢二钠、 0.6g氯化钙、 0.4g硫酸镁和1000mL蒸馏水组成， pH值为11.0， 121灭菌20min)中 5的枯草芽孢杆菌DFSW101， 然后在130r/min、 32条件下发酵培养至菌数浓度达到1 1071108cfu/mL。 0026 本实施方式枯草芽孢杆菌。
13、DFSW101发酵菌数浓度达到11071108cfu/mL一般 需48h。 0027 采用Folin试剂显色法测定碱性蛋白酶的酶活力： 在pH值为11.0、 30条件下， 以 1mL发酵液每分钟水解酪蛋白产生1 g酪氨酸所需酶量定义为1个酶活力单位。 0028 本实施方式发酵液中碱性蛋白酶的酶活力为2400U/mL。 0029 实施例1 0030 用2mol/L的NaOH溶液将3.5L污水处理厂剩余污泥pH值调节至11.0后， 平均分配到 2组(实验组和对照组)反应瓶(1L锥形瓶)中， 保证污泥性质、 质量浓度及颗粒大小一致。 实 验组按5接菌量接种枯草芽孢杆菌DFSW101， 对照组加同样体。
14、积的无菌水以保证污泥质量 浓度一致； 每种处理3个平行重复， 130r/min、 32振荡器内发酵， 每6h使用2mol/L的NaOH溶 液调节各反应瓶内pH值1次， 保证pH值稳定在11.00.3。 每24h取各反应瓶中发酵污泥 10mL， 10000r/min离心后立即将上清液用细菌滤器过滤， 测定上清液中VFAs(挥发性脂肪 酸)含量。 0031 实验组剩余污泥在碱性发酵第6天VFAs含量达到最高值， 而对照组剩余污泥在碱 性发酵第10天VFAs含量才达到最高值。 实验组VFAs含量最高值为对照组VFAs含量最高值的 1.52倍。 说明书 3/3 页 5 CN 108587978 A 5 图1 说明书附图 1/1 页 6 CN 108587978 A 6 。