猪5号染色体上一个与产仔数相关的SNP位点及其引物.pdf

摘要
申请专利号：	CN201310727948.2	申请日：	20131226
公开号：	CN103757007B	公开日：	20160817
当前法律状态：		有效性：	失效
法律详情：
IPC分类号：	C12N15/11,C12Q1/68	主分类号：	C12N15/11,C12Q1/68
申请人：	中国科学院昆明动物研究所,江西农业大学
发明人：	张亚平,黄路生,谢海兵,任军,艾华水,徐丹
地址：	650223 云南省昆明市五华区教场东路32号
优先权：	CN201310727948A
专利代理机构：	昆明今威专利商标代理有限公司	代理人：	杨宏珍
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内容摘要

本发明涉及与猪产仔数性状相关的SNP位点，具体涉及猪5号染色体上一个与产仔数相关的SNP位点及其引物，属生物技术领域。该位点为基因组版本NCBI Build Sscrofa 10.2的Chr5:32282098；该位点的等位基因为T和C，该位点及其侧翼序列如SEQ ID NO:1所示。扩增权利要求1所述SNP位点的引物及延伸引物为：Chr5‑2‑PCRU：5’‑TTT TTC TGG TCA TGG TAG TTT TG‑3’；Chr5‑2‑PCRL：5’‑ATA CTG AGG ACC TAC ACA CAA AAC A‑3’；Chr5‑2‑SNPU：5’‑TGA CTA GCT TTA GCT TGT TTT GAG TGT TAG‑3’。该位点有C/C、T/C和T/T三种基因型，带有T/T基因型的猪产仔数高于T/C和C/C基因型个体。本发明的有益效果在于：运用全基因组重测序方法，能够快速、批量地筛选与性状相关的SNP位点或候选基因，Chr5:32282098这个位点能够作为遗传标记用于猪的遗传育种提高母猪的产仔数。

权利要求书

1.一种检测猪5号染色体上一个与产仔数相关的SNP位点的引物在检测猪产仔数中的应用，其特征在于：所述引物包括PCR扩增引物以及延伸引物，其中PCR扩增引物的核苷酸序列如下所示：Chr5-2-PCRU：5’-TTTTTCTGGTCATGGTAGTTTTG-3’；Chr5-2-PCRL：5’-ATACTGAGGACCTACACACAAAACA-3’；延伸引物的核苷酸序列如下所示：Chr5-2-SNPU：5’-TGACTAGCTTTAGCTTGTTTTGAGTGTTAG-3’，所述猪为白色杜洛克×二花脸猪杂交资源群F2代母猪，所述SNP位点为基因组版本NCBISscrofal10.2的Chr5:32282098,该位点的等位基因为T和C，有C/C、T/C和T/T三种基因型，带有T/T基因型的猪产仔数高于带有T/C和C/C基因型的猪，其中等位基因T为提高猪产仔数的有益等位基因。

说明书

技术领域：

本发明涉及与猪产仔数性状相关的SNP位点，具体涉及猪5号染色体上一个与产仔数相关的SNP位点及其引物，属生物技术领域。

背景技术：

猪的产仔数性状是猪繁殖性状的主要组成部分，提高猪产仔数对提高养猪业的总体经济效益意义重大。但产仔数属于遗传力很低的数量性状，难以用常规育种技术进行遗传改良。我国的太湖猪以高产而闻名，窝产仔数比大多数其它中国地方猪种以及国外猪种的窝产仔数多4-5头（《中国猪品种志》张仲葛主编，上海科技出版社，1986）。二花脸猪是太湖猪的一种，是世界上繁殖力最高的猪种。太湖猪中与高产仔数相关的多态位点，能够作为遗传标记用于提高母猪的产仔数。

国内外研究人员采用全基因组扫描和候选基因的方法对产仔数性状进行QTL定位及候选基因的研究。Li等人（Li,K.,J.Ren,et al.Anim Genet.2009.40(6):963-966）利用覆盖了猪19条染色体的183个微卫星标记对与猪产仔数相关的总产仔数，产活仔数，产死仔数进行QTL（Quantitative Trait Locus,数量性状基因座）定位。他们研究了299个杜洛克猪与中国二花脸猪杂交的F2代，在6，7，8和15号染色体上定位了与总产仔数，产活仔数和产死仔数相关的QTL。

Rothschild等(Rothischild,M.,Jacobson,D.et al.Proc Natl Acad Sci USA.1996.93(1):201-205)通过候选基因法，利用包括中国梅山系太湖猪在内的两个极端品种杂交，发现1号染色体上雌激素受体座位的一个基因（ESR）与高产仔数主效基因连锁。通过雌激素受体基因座位的RFLPs分析，认为具有3.7kb条带的纯合型母猪（BB型）比具有4.3kb条带的纯合型母猪（AA型）初产时要多2.3头（P<0.01），每胎平均多产1.5头（P<0.01）。目前已报道与产仔数相关的基因还有OPN(US6410227B1)，PRLR(Tomas,A.,J.Casellas,etal.J Anim Sci.2006.84(8):1991-1998)，FSHβ(Zhao,Y.Li N,et al.Sci China C LifeSci.1998.41(6):664-668)和RBP4(Spotter,A.,S.Muller,et al.Reprod DomestAnim.2009.44(1):100-105)等。

应用QTL定位方法能够定位与性状紧密连锁的区域，但是需要研究几代家系的很多个体，周期长，费时费力，在一般的实验室无法完成，而且有些QTL定位很宽泛。利用候选基因法对性状进行研究，相对来说简单直接，但是利用候选基因法主要研究的是外显子区域的突变，而很多发挥重要功能的突变很可能在内含子或者其它功能区域；有些复杂性状是受到多基因调控的；不能检出所有的QTL，而且有些用候选基因法研究的基因并没有找到QTL的定位。

随着技术的发展和成熟，基因组及基因注释越来越完善。由于测序技术的快速发展，测序成本的降低，能够利用全基因组测序或者转录组测序对性状相关基因或突变位点进行批量筛选。本发明选择二花脸猪（太湖猪的一种），藏猪，巴马香猪，莱芜猪，滇南小耳猪等5个中国地方猪种以及野猪进行了全基因组重测序。希望从中筛选出与高产仔数相关的SNPs（single nucleotide polymorphisms,单核苷酸多态性）位点作为遗传标记用于猪的遗传育种，以提高母猪的产仔数。

发明内容：

本发明的目的是提供猪5号染色体上一个与产仔数相关的SNP位点及其引物。

本发明选择了二花脸猪（太湖猪的一种），藏猪，巴马香猪，莱芜猪，及滇南小耳猪5个中国地方猪种以及野猪进行了全基因组重测序。6个猪种的重测序个体数分别为11个，11个，9个，10个，10个和10个。重测序数据跟参考基因组（NCBI Build Sscrofa10.2）进行比对，利用SAMTools软件进行SNPs位点的提取。发明人比较了二花脸猪与其它5个猪种，在5号染色体上发现一个SNP位点（基因组版本NCBI Build Sscrofa10.2的Chr5:32282098）与猪的产仔数相关。该位点的等位基因为T和C，有C/C、T/C和T/T三种基因型。该位点及其侧翼序列（SEQ ID NO:1）为：

tcccactgta ttctttccta tcttgagtgg cagctctccc tttaggacat ttattctacc 60

tcttctagtc tgaagaccat cctccttgct gaaagaagac agacggaaat aatgatgtta 120

ttattaacct ctgccttctt tttctatctg ctgattttat atttccttct caaagtcacg 180

gggctgtttt ctcatttttg ttcttgctta gaaggcttct tgttagttcg tttattctct 240

ttttctggtc atggtagttt tgactatttt ctccaagctt tagcttgttt tgagtgttag 300

cctgcttaag gtgtggttca cgctgttttg tgtgtaggtc ctcagtatgc cccccgtcat 360

cttttcaaac ggcctttaaa aatctgaact caggagttcc cattgtggct cagtggaaat 420

gaatctgact aggaaccatg aggttgtagg ttcgatccct ggcctcgctc agcgggttaa 480

ggatctggtg ttgctgtgag ctgtggtgta ggtaacaaat gtgacttgga tctcttgttg 540

ctgtggctgt ggtataggcc tgcagctgtg gctccaattt gacccctagc ctgggaacct 600

c 601

筛选到该位点后，发明人以猪的DNA为模板扩增包含该位点在内的核苷酸序列片段并进行测序，对该位点进行验证和相关性分析。其中发明人选择的个体是白色杜洛克×二花脸猪（太湖猪的一种）的F2后代。结果发现该位点与猪产仔数有显著相关性。

本发明的有益效果在于：运用全基因组重测序方法，能够快速、批量地筛选与性状相关的SNP位点或候选基因，基因组版本NCBI Build Sscrofa 10.2的Chr5:32282098这个位点能够作为遗传标记用于猪的遗传育种提高母猪的产仔数。

附图说明：

图1为白色杜洛克×二花脸猪F2代母猪资源群中Chr5:32282098位点3种基因型的产仔数比较（图中*表示两种基因型产仔数比较时，0.01≤P≤0.05；**表示P＜0.01）。

具体实施方案：

（1）SNP位点的群体分布特征

本发明选择二花脸猪（太湖猪的一种），藏猪，巴马香猪，莱芜猪，及滇南小耳猪5个中国地方猪种以及野猪进行了全基因组重测序。6个猪种的重测序个体数分别为11个，11个，9个，10个，10个和10个。重测序数据跟参考基因组（NCBI Build Sscrofa10.2）进行比对，利用SAMTools软件进行SNPs位点的提取。发明人比较了二花脸猪与其它5个猪种，在5号染色体上发现一个SNP位点（基因组版本NCBI Build Sscrofa 10.2的Chr5:32282098）与猪的产仔数相关。从重测序的分析结果来看，其它4个中国地方猪种和野猪中该位点等位基因C的频率平均为50%以上，而在二花脸猪中等位基因T的频率为90%以上。

（2）SNP位点的鉴定

在引物设计网站设计SNAPSHOT引物，包括一对PCR扩增引物（Chr5-2-PCRU：5’-TTTTTC TGG TCA TGG TAG TTT TG-3’；Chr5-2-PCRL：5’-ATA CTG AGG ACC TAC ACA CAA AACA-3’）和延伸引物（Chr5-2-SNPU：5’-TGA CTA GCT TTA GCT TGT TTT GAG TGT TAG-3’）。该位点与其它11个位点共24条（12对）引物各取1μl混合为新的多重PCR引物池。首先进行12重PCR反应，反应体系所用试剂为：多重PCR引物池(6.25μM each)8μl、dNTP(10mMeach)8μl、10×PCR Buffer II116μl、MgCl2(25mM Stock)234μl、Fast Start Taq(5U/μl)24μl和ddH2O460μl，将以上试剂混合液8.5μl和1.5μl DNA(50ng/μl)混合成10μl体系进行12重PCR扩增反应。扩增反应条件为：94℃4min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，共40个循环。下一步进行PCR反应纯化，所需试剂为：Exo I(10U/μl)60μl、SAP(1U/μl)130μl、10×SAP Buffer35μl和ddH2O 125μl，在每个样品的PCR产物中加入3.5μl上述纯化混合液离心后按以下程序进行反应：37℃40min，96℃10min。然后进行单碱基延伸反应，所需试剂为：SNAPSHOTMultiplex ready reaction Mix 100μl、延伸引物池(6.25μM each，12条延伸引物各取1μl混合)8μl、5×Sequencing Buffer 200μl和ddH2O 300μl，将以上试剂混合液6μl和4μl的纯化产物混合成10μl体系进行延伸反应。延伸反应条件为：96℃10s，50℃5s，60℃30s，共25个循环。接着进行延伸反应产物的纯化，所需试剂为：SAP(1U/μl)120μl、10×SAPBuffer 70μl和ddH2O 140μl，在每个样品的延伸反应产物中加入上述3.3μl纯化混合液离心后按以下程序进行反应：37℃40min，75℃20min，4℃保存备用。每个样品取5-4μl上述纯化后的SNAPSHOT反应产物和5-6μl的高纯甲酰胺(Hi-Di Formamide)混合成10μl体系离心后上样于ABI 3730XL测序仪进行基因分型，使用GeneMarker软件分析分型结果。

(注：以上4个步骤的反应试剂混合液用量均为100个样品所需试剂量，从单碱基延伸反应开始，需要避光进行。)

（3）白色杜洛克×二花脸繁殖性能杂交资源群构建

后续的验证实验所用资源群个体样品及其性状数据由江西农业大学动物生物技术国家重点实验室培育基地提供。

1998年12月，在江西农业大学科研猪场将从江苏省3个二花脸猪保种场购买的二花脸母猪进行场间血缘的交叉配种。2001年1月根据亲本产仔性能，从3头公猪和11头母猪的纯繁后代中选择了17头二花脸母猪作为资源群体的祖代母本。把Sygen PIC公司惠赠的2头优质白色杜洛克公猪作为资源家系的祖代父本。将这2头白色杜洛克和17头二花脸猪杂交产生的F1代个体进行配种，避免全同胞交配，且每头公猪通常与同一头母猪配种，以获得大样本的F2半同胞家系。2003年1月、3月和6月，项目组分别将第1批和第2批F2母猪送往江西省宜春市畜牧良种场(59头)、江西省国营红星种猪场(52头)和江西上犹县四元杂交猪场(118头)用于母猪繁殖性状的测定。

（4）SNP位点在杂交资源群F2代母猪群体的基因分型

按照上述步骤(2)所述的方法，以192个白色杜洛克×二花脸猪杂交资源群F2代母猪个体DNA为模板检测该SNP位点的基因型。192个F2代资源群个体中有177个个体成功分型，3种基因型C/C，T/C和T/T的个体数分别是66，74和37。

（5）SNP位点对产仔数性状的调控效应

在F2代资源群个体中，带有C/C基因型个体的平均产仔数为10.6397，标准差为0.8617；带有T/C基因型个体的平均产仔数为10.871，标准差为0.865；带有T/T基因型个体的平均产仔数为11.8176，标准差为0.9176。

本发明采用一般线性模型（GLM）分析了SNP位点对猪总产仔数、产活仔数的影响。全部统计分析采用SAS软件进行。模型如下：

Yijklm=u+Ai+Gj+Bk+Pl+eijklm

其中Yijklm为猪总产仔数或产活仔数，u为群体均值，Ai为第i个个体的加性效应，Gj为第j个SNP位点基因型的固定效应，Bk为批次效应（k=1,2,3,4），Pl为随机效应（l=1,2,3）。

分析结果发现Chr5:32282098这个SNP位点跟产仔数有显著相关性（如图1所示）。带有T/T基因型的F2代母猪的产仔数比带有C/C基因型的母猪平均多1.1779（P=0.0312），带有T/T基因型的F2代母猪的产仔数比带有T/C基因型的母猪平均多0.9466（P=0.0753），从图1看出，带有C/C基因型的母猪产仔数最低。T为提高猪产仔数的有益等位基因。

从SNP位点与产仔数相关性分析看出，Chr5:32282098这个SNP位点能够作为分子标记应用于分子标记辅助选择（MAS）来提高母猪的产仔数。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院昆明动物研究所

江西农业大学

<120> 猪5号染色体上一个与产仔数相关的SNP位点及其引物

<130> 7

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 601

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 1