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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310727885.0 (22)申请日 2013.12.26 (73)专利权人 中国科学院昆明动物研究所 地址 650223 云南省昆明市五华区教场东 路32号 专利权人 江西农业大学 (72)发明人 张亚平黄路生谢海兵任军 艾华水徐丹 (74)专利代理机构 昆明今威专利商标代理有限 公司 53115 代理人 杨宏珍 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (56)对比文件 CN 101768642 A,2010.0。
2、7.07, CN 101440399 A,2009.05.27, CN 101481740 A,2009.07.15, CN 102080081 A,2011.06.01, CN 102084847 A,2011.06.08, WO 2007133075 A2,2007.11.22, WO 2006036975 A2,2006.04.06, KR 20090111193 A,2009.10.26, 张淑君等.猪产仔数分子标记及其效应分 析. 生物技术通讯 .2003,36-40. 雷雪芹等.猪产仔性状的分子标记研究与 QTLs定位. 洛阳农业高等专科学校学报 .2001, 263-266. 审。
3、查员 汪未申 (54)发明名称 猪6号染色体上一个与产仔数相关的分子标 记 (57)摘要 本发明涉及与猪产仔数性状相关的分子标 记， 具体涉及猪6号染色体上一个与产仔数相关 的分子标记及其引物， 属生物技术领域。 该分子 标 记 位 点 为 基 因 组 版 本 N C B I B u i l d Sscrofa10.2的Chr6:103465181； 该位点的等位 基因为T和C， 有C/C、 T/C和T/T三种基因型， 该位 点及其侧翼序列如SEQIDNO:1所示。 扩增该分 子标记位点的引物及延伸引物为： Chr6-3-PCRU： 5 -AAAAACAGTCGTGTGCCCT-3 ； Chr。
4、6-3- PCRL： 5 -ATACTATCTGCATGTATAGAGGAA CTTAAA-3 ； Chr6-3-SNPU： 5 -GACTGACTGACT GACTGACTTTCAGTGTCTCATGTAGAATCA TCA-3 。 带有C/C基因型的猪产仔数高于T/C和T/ T基因型。 本发明的有益效果在于： 运用全基因组 重测序方法， 能够快速、 批量地筛选与性状相关 的分子标记或候选基因， Chr6:103465181这个位 点能够作为遗传标记用于猪的遗传育种提高母 猪的产仔数。 权利要求书1页 说明书4页 序列表2页 附图1页 CN 103757002 B 2016.08.17 CN。
5、 103757002 B 1/1 页 2 1.一种检测猪 6 号染色体上一个与产仔数相关的分子标记中 SNP 位点的引物， 其特征 在于 ： 所述引物包括 PCR 扩增引物以及延伸引物， 其中 PCR 扩增引物的核苷酸序列如下所 示 ： Chr6-3-PCRU ： 5 -AAA AAC AGT CGT GTG CCC T-3 ； Chr6-3-PCRL ： 5 -ATA CTA TCT GCA TGT ATA GAG GAA CTT AAA-3 ； 延伸引物的核苷酸序列如下所示 ： Chr6-3-SNPU ： 5 -GAC TGA CTG ACT GAC TGA CTT TCA GTG TCT。
6、 CAT GTA GAA TCA TCA-3 ， 所述猪为白色杜洛克 二花脸猪杂交资源群 F2 代母猪， 所述 SNP 位点为基因组版本 NCBI Sscrofal10.2 的 Chr6: 103465181, 该位点的等位基因为 T 和 C， 有 C/C、 T/C 和 T/T 三种基因型， 带有 C/C 基因型 的猪产仔数高于带有 T/C 和 T/T 基因型的猪， 其中等位基因 C 为提高猪产仔数的有益等位 基因。 2.权利要求 1 所述的引物在检测猪 6 号染色体上一个与产仔数相关的分子标记中 SNP 位点的应用 , 其特征在于 ： 所述猪为白色杜洛克 二花脸猪杂交资源群 F2 代母猪， 。
7、所述 SNP 位点为基因组版本 NCBI Sscrofal10.2 的 Chr6: 103465181, 该位点的等位基因为 T 和 C， 有 C/C、 T/C 和 T/T 三种基因型， 带有 C/C 基因型的猪产仔数高于带有 T/C 和 T/T 基因 型的猪， 其中等位基因 C 为提高猪产仔数的有益等位基因。 权 利 要 求 书 CN 103757002 B 2 1/4 页 3 猪 6 号染色体上一个与产仔数相关的分子标记 技术领域 ： 0001 本发明涉及与猪产仔数性状相关的分子标记， 具体涉及猪 6 号染色体上一个与产 仔数相关的分子标记及其引物， 属生物技术领域。 背景技术 ： 000。
8、2 猪的产仔数性状是猪繁殖性状的主要组成部分， 提高猪产仔数对提高养猪业的总 体经济效益意义重大。但产仔数属于遗传力很低的数量性状， 难以用常规育种技术进行遗 传改良。我国的太湖猪以高产而闻名， 窝产仔数比大多数其它中国地方猪种以及国外猪种 的窝产仔数多 4-5 头 （ 中国猪品种志 张仲葛主编， 上海科技出版社， 1986） 。二花脸猪是太 湖猪的一种， 是世界上繁殖力最高的猪种。 太湖猪中与高产仔数相关的多态位点， 能够作为 遗传标记用于提高母猪的产仔数。 0003 国内外研究人员采用全基因组扫描和候选基因的方法对产仔数性状进行 QTL 定 位及候选基因的研究。 Li等人(Li,K.,J.。
9、Ren,et al.Anim Genet.2009.40(6):963-966)利 用覆盖了猪 19 条染色体的 183 个微卫星标记对与猪产仔数相关的总产仔数， 产活仔数， 产 死仔数进行 QTL（Quantitative Trait Locus, 数量性状基因座） 定位。他们研究了 299 个 杜洛克猪与中国二花脸猪杂交的 F2代， 在 6， 7， 8 和 15 号染色体上定位了与总产仔数， 产活 仔数和产死仔数相关的 QTL。 0004 Rothschild 等 (Rothischild,M.,Jacobson,D.et al.Proc Natl Acad Sci U S A.1996.。
10、93(1):201-205) 通过候选基因法， 利用包括中国梅山系太湖猪在内的两个极端品 种杂交， 发现 1 号染色体上雌激素受体座位的一个基因 (ESR) 与高产仔数主效基因连锁。 通过雌激素受体基因座位的 RFLPs 分析， 认为具有 3.7kb 条带的纯合型母猪 (BB 型 ) 比具 有 4.3kb 条带的纯合型母猪 (AA 型 ) 初产时要多 2.3 头 (P0.01)， 每胎平均多产 1.5 头 (P0.01)。目前已报道与产仔数相关的基因还有 OPN(US6410227B1)， PRLR(Tomas,A.,J. Casellas,et al._J Anim Sci.2006.84(。
11、8):1991-1998)， FSH(Zhao,Y.Li N,et al.Sci China C Life Sci.1998.41(6):664-668) 和 RBP4(Spotter,A.,S.Muller,et al.Reprod Domest Anim.2009.44(1):100-105) 等。 0005 应用 QTL 定位方法能够定位与性状紧密连锁的区域， 但是需要研究几代家系的很 多个体， 周期长， 费时费力， 在一般的实验室无法完成， 而且有些 QTL 定位很宽泛。利用候选 基因法对性状进行研究， 相对来说简单直接， 但是利用候选基因法主要研究的是外显子区 域的突变， 而很多发挥。
12、重要功能的突变很可能在内含子或者其它功能区域 ； 有些复杂性状 是受到多基因调控的 ； 不能检出所有的 QTL， 而且有些用候选基因法研究的基因并没有找 到 QTL 的定位。 0006 随着技术的发展和成熟， 基因组及基因注释越来越完善。由于测序技术的快速发 展， 测序成本的降低， 能够利用全基因组测序或者转录组测序对性状相关基因或突变位点 进行批量筛选。本发明选择二花脸猪 （太湖猪的一种） ， 藏猪， 巴马香猪， 莱芜猪， 滇南小耳猪 等 5 个中国地方猪种以及野猪进行了全基因组重测序。希望从中筛选出与高产仔数相关的 说 明 书 CN 103757002 B 3 2/4 页 4 SNPs（s。
13、ingle nucleotide polymorphisms, 单核苷酸多态性） 位点作为遗传标记用于猪的 遗传育种， 以提高母猪的产仔数。 发明内容 ： 0007 本发明的目的是提供猪 6 号染色体上一个与产仔数相关的分子标记及其引物。 0008 本发明选择了二花脸猪 （太湖猪的一种） ， 藏猪， 巴马香猪， 莱芜猪， 及滇南小耳 猪 5 个中国地方猪种以及野猪进行了全基因组重测序。6 个猪种的重测序个体数分别为 11 个， 11 个， 9 个， 10 个， 10 个和 10 个。重测序数据跟参考基因组 （NCBI Build Sscrofa 10.2） 进行比对， 利用 SAMTools 。
14、软件进行 SNPs 位点的提取。发明人比较了二花脸猪与其 它 5 个猪种， 在 6 号染色体上发现一个 SNP 位点 （基因组版本 NCBI Build Sscrofa 10.2 的 Chr6:103465181） 可能与猪的产仔数相关。该位点的等位基因为 T 和 C， 有 C/C、 T/C 和 T/T 三种基因型。该位点及其侧翼序列 （SEQ ID NO:1） 为 ： 0009 0010 0011 筛选到该位点后， 发明人以猪的 DNA 为模板扩增包含该位点在内的核苷酸序列片 段并进行测序， 对该位点进行验证和相关性分析。其中发明人选择的个体是白色杜洛克 二花脸猪 （太湖猪的一种） 的 F2。
15、 后代。结果发现该位点与猪产仔数有显著相关性。 0012 本发明的有益效果在于 ： 运用全基因组重测序方法， 能够快速、 批量地筛选与性状 相关的分子标记或候选基因， 基因组版本NCBI Build Sscrofa 10.2的Chr6:103465181这 个位点能够作为遗传标记用于猪的遗传育种提高母猪的产仔数。 附图说明 ： 0013 图 1 ： 白色杜洛克 二花脸 F2代母猪资源群中 Chr6:103465181 位点 3 种基因型 的产仔数比较 （* 表示两种基因型产仔数比较时， 0.01 P 0.05 ； * 表示 P 0.01） 。 说 明 书 CN 103757002 B 4 3/。
16、4 页 5 具体实施方案 ： 0014 （1） SNP 位点的群体分布特征 0015 本发明选择了二花脸猪 （太湖猪的一种） ， 藏猪， 巴马香猪， 莱芜猪， 及滇南小耳 猪 5 个中国地方猪种以及野猪进行了全基因组重测序。6 个猪种的重测序个体数分别为 11 个， 11 个， 9 个， 10 个， 10 个和 10 个。重测序数据跟参考基因组 （NCBI Build Sscrofa 10.2） 进行比对， 利用 SAMTools 软件进行 SNPs 位点的提取。发明人比较了二花脸猪与其 它 5 个猪种， 在 6 号染色体上发现一个 SNP 位点 （基因组版本 NCBI Build Sscro。
17、fa 10.2 的 Chr6:103465181） 可能与猪的产仔数相关。从重测序的分析结果来看， 其它 4 个中国地方猪 种和野猪中该位点等位基因 T 的频率平均为 92% 以上， 而在二花脸猪中等位基因 C 的频率 为 100%。 0016 （2） SNP 位点的鉴定 0017 在引物设计网站设计 SNAPSHOT 引物， 包括一对 PCR 扩增引物 （Chr6-3-PCRU ： 5 -AAA AAC AGT CGT GTG CCC T-3 ； Chr6-3-PCRL ： 5 -ATA CTA TCT GCA TGT ATA GAG GAA CTT AAA-3 ）和延伸引物 （Chr6-3。
18、-SNPU ： 5 -GAC TGA CTG ACT GAC TGA CTT TCA GTG TCT CAT GTA GAA TCA TCA-3 ） 。该位点与其它 11 个位点共 24 条 （12 对）引物各 取 1l 混合为新的多重 PCR 引物池。首先进行 12 重 PCR 反应， 反应体系所用试剂为 ： 多 重 PCR 引物池 (6.25M each)8l、 dNTP(10mM each)8l、 10PCR Buffer II 116l、 MgCl2(25mM Stock)234l、 Fast Start Taq(5U/l)24l 和 ddH2O 460l， 将以上试剂 混合液 8.5。
19、l 和 1.5l DNA(50ng/l) 混合成 10l 体系进行 12 重 PCR 扩增反应。扩 增反应条件为 ： 94 4min ； 94 30s， 55 30s， 72 1min， 共 40 个循环。下一步进行 PCR 反应纯化， 所需试剂为 ： Exo I(10U/l)60l、 SAP(1U/l)130l、 10SAPBuffer 35l 和 ddH2O 125l， 在每个样品的 PCR 产物中加入 3.5l 上述纯化混合液离心后按以下程 序进行反应 ： 37 40min， 96 10min。然后进行单碱基延伸反应， 所需试剂为 ： SNAPSHOT Multiplex ready r。
20、eaction Mix 100l、 延伸引物池 (6.25M each， 12 条延伸引物各取 1l混合)8l、 5Sequencing Buffer 200l和ddH2O 300l， 将以上试剂混合液6l 和4l的纯化产物混合成10l体系进行延伸反应。 延伸反应条件为 ： 96 10s， 50 5s， 60 30s， 共25个循环。 接着进行延伸反应产物的纯化， 所需试剂为 ： SAP(1U/l)120l、 10SAP Buffer 70l和ddH2O 140l， 在每个样品的延伸反应产物中加入上述3.3l纯 化混合液离心后按以下程序进行反应 ： 37 40min， 75 20min， 4保。
21、存备用。 每个样品取 5-4l上述纯化后的SNAPSHOT反应产物和5-6l的高纯甲酰胺(Hi-Di Formamide)混合 成 10l 体系离心后上样于 ABI 3730XL 测序仪进行基因分型， 使用 GeneMarker 软件分析 分型结果。 0018 ( 注 ： 以上 4 个步骤的反应试剂混合液用量均为 100 个样品所需试剂量， 从单碱基 延伸反应开始， 需要避光进行。) 0019 （3） 白色杜洛克 二花脸繁殖性能杂交资源群构建 0020 后续的验证实验所用资源群个体样品及其性状数据由江西农业大学动物生物技 术国家重点实验室培育基地提供。 0021 1998年12月， 在江西农业。
22、大学科研猪场将从江苏省3个二花脸猪保种场购买的二 花脸母猪进行场间血缘的交叉配种。2001 年 1 月根据亲本产仔性能， 从 3 头公猪和 11 头母 说 明 书 CN 103757002 B 5 4/4 页 6 猪的纯繁后代中选择了 17 头二花脸母猪作为资源群体的祖代母本。把 Sygen PIC 公司惠 赠的 2 头优质白色杜洛克公猪作为资源家系的祖代父本。将这 2 头白色杜洛克和 17 头二 花脸猪杂交产生的 F1代个体进行配种， 避免全同胞交配， 且每头公猪通常与同一头母猪配 种， 以获得大样本的 F2半同胞家系。2003 年 1 月、 3 月和 6 月， 项目组分别将第 1 批和第 。
23、2 批 F2母猪送往江西省宜春市畜牧良种场 （59 头） 、 江西省国营红星种猪场 （52 头） 和江西上 犹县四元杂交猪场 （118 头） 用于母猪繁殖性状的测定。 0022 （4） SNP 位点在杂交资源群 F2代母猪群体的基因分型 0023 按照上述步骤(2)所述的方法， 以192个白色杜洛克二花脸猪杂交资源群F2代 母猪个体 DNA 为模板检测该 SNP 位点的基因型。F2代资源群个体中 187 个个体成功分型， 3 种基因型 C/C， T/C 和 T/T 的个体数分别是 39， 88 和 60。 0024 （5） SNP 位点对产仔数性状的调控效应 0025 在 F2代资源群个体中，。
24、 带有 C/C 基因型个体的平均产仔数为 11.5541， 标准差为 0.9051 ； 带有 T/C 基因型个体的平均产仔数为 10.8831， 标准差为 0.8526 ； 带有 T/T 基因型 个体的平均产仔数为 10.3249， 标准差为 0.8692。 0026 本发明采用一般线性模型 （GLM） 分析了 SNP 位点对猪总产仔数、 产活仔数的影响。 全部统计分析采用 SAS 软件进行。模型如下 ： 0027 Yijklm=u+Ai+Gj+Bk+Pl+eijklm 0028 其中 Yijklm为猪总产仔数或产活仔数， u 为群体均值， A i为第 i 个个体的加性效 应， Gj为第 j 。
25、个 SNP 位点基因型的固定效应， B k为批次效应 （k=1,2,3,4） ， Pl为随机效应 （l=1,2,3） 。 0029 分析结果发现 Chr6:103465181 这个 SNP 位点跟产仔数有显著相关性 （如图 1 所示） 。带有 C/C 基因型的 F2代母猪的产仔数比带有 T/T 基因型的母猪平均多 1.2292 （P=0.0277） ； 虽然带有 C/C 基因型的 F2代母猪的产仔数与带有 T/C 基因型的母猪没有显著 性差异， 但是带有 C/C 基因型的 F2代母猪的产仔数比带有 T/C 基因型的母猪平均多 0.671。 从图 1 看出， 带有 T/T 基因型的母猪产仔数最低。
26、。C 为提高猪产仔数的有益等位基因。 0030 从 SNP 位点与产仔数相关性分析看出， Chr6:103465181 这个 SNP 位点能够作为分 子标记应用于分子标记辅助选择 （MAS） 来提高母猪的产仔数。 说 明 书 CN 103757002 B 6 1/2 页 7 SEQUENCE LISTING 中国科学院昆明动物研究所 江西农业大学 猪 6 号染色体上一个与猪产仔数相关的分子标记 7 1 PatentIn version 3.5 1 601 DNA Sus scrofa 1 agctgggtca tcagtcacaa agttatctgc atgtagagga tacttcatt。
27、a ttgttctatg 60 gggctccaat taagtaggac atgataaaca gcgatcaagt tgacgatcca tccaaatatt 120 cagcaattac cacaacccat gaccatgaaa ggaacatggg cctctctgct tcctccacag 180 gtgaaggttg acaggaatga aagatttact tcaaacagcc tctgagcatc ttgctcctta 240 tcaagtctcc tcgaaaaaca gtcgtgtgcc ctcaattcag tgtctcatgt agaatcatca 300 tgag。
28、ttaatg ctgattttaa gttcctctat acatgcagat agtatgacac taatgcaatg 360 atatcccatg aaaaaaagga tcatgatagg tttttattca ctttcagagc tgctaggaag 420 tcttcgtcat tgcatcagat tttaggccca agctcagaga gataaccacg tctaagtaca 480 ggacttagga gaagtacaaa tcattgcatt gattttcata ttgatgcaga catgcttagc 540 ctctaccaca acgagggaga tg。
29、cagcactc cacaggaatg ataggtgttt tcagatcttc 600 a 601 SEQUENCE LISTING 中国科学院昆明动物研究所 江西农业大学 猪 6 号染色体上一个与产仔数相关的分子标记 7 3 PatentIn version 3.5 1 19 DNA Sus scrofa 1 aaaaacagtc gtgtgccct 19 2 30 序 列 表 CN 103757002 B 7 2/2 页 8 DNA Sus scrofa 2 atactatctg catgtataga ggaacttaaa 30 3 45 DNA Sus scrofa 3 gactgactga ctgactgact ttcagtgtct catgtagaat catca 45 序 列 表 CN 103757002 B 8 1/1 页 9 图 1 说 明 书 附 图 CN 103757002 B 9 。