1株葡糖醋杆菌及其筛选纯化方法.pdf

本发明公开了1株葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter sp.)及筛选纯化方法。其特点是以残次水果为原材料，用放线菌酮抑制霉菌等真菌的生长，以此采取平板富集培养、梯度稀释平板涂布、初筛、复筛等方法进行筛选和纯化，得到1株产细菌纤维素的菌株。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》第九版的描述，做生理生化特征及16S rDNA序列分析，确定该菌株为新种。本发明得到的菌株碳源和氮源选择范围广，在pH值为6.5和常温下时细菌纤维素产量最高，且比一般的产纤维素细菌的产量要高，在细菌纤维素的工业化生产方面具有很好的实施前景。

1、  1株葡糖醋杆菌，其特征在于：该菌株名称为葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter sp.)G-29，CCTCC NO：M208234。

2、  根据权利要求1所述葡糖醋杆菌菌株，其特征在于：
(1)形态特征：本发明菌株为革兰氏阴性菌，菌体为杆状，两端圆钝，菌宽0.6-0.8μm，菌长2.0-3.2μm，不形成芽孢，无鞭毛，不运动，菌落乳白色圆隆，有弹性，可在固体平板上滑动，时间久的话边缘会变得不整齐，不产色素，菌苔胶质状，易整块儿挑取，破碎难；
(2)生理生化特征：

注：(+)代表弱阳性
(3)分子同源性分析：做16S rDNA分析，发现本发明菌株与中间葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter intermedius)同源性最高，达99％以上，但两者生化特征差异较大，本发明菌株不能在在3％乙醇和5％乙酸中生长，而中间葡糖醋杆菌可以；本发明所述菌株能很好地利用蔗糖，而绝大多数中间葡糖醋杆菌不可以利用蔗糖；菌体形态上也有差异，中间葡糖醋杆菌一般长为2μm，而本发明所述菌株长度为3.2μm。

3、  根据权利要求2所述葡糖醋杆菌菌株的筛选纯化方法，其特征在于筛选纯化中从液体到固体培养时一定要将纤维素膜先经生理盐水浸泡，因为培养液中菌体含量极少，绝大部分菌体都包含在纤维素膜里面，直接从培养液中接种很少成功，筛选纯化方法的步骤如下：
(1)富集培养：以残次水果的伤残处为原料，接种于含50mg/L放线菌酮和5％乙醇中的富集培养基中，置于30℃恒温培养箱培养5天，有凝胶膜出现者为阳性；
(2)平板涂布：将凝胶膜取出放入灭过菌的生理盐水中浸泡1天，溶液经梯度稀释后平板涂布，并置于恒温培养箱30℃培养5天后挑取单菌落在BSH液体培养基中重新培养5天；
(3)初筛：将步骤(2)所产的膜取出放入灭过菌的生理盐水中浸泡1天，取浸提液平板划线后置于恒温培养箱30℃培养5天，挑取生长的单菌落转接入斜面培养基中，30℃培养3天；
(4)复筛：将培养3天的斜面转接入BSH液体培养基中重新培养，有凝胶膜出现者为阳性，将阳性菌株编号并保藏；
(5)细菌纤维素的鉴定：要筛选能够产纤维素的细菌，一定要做产物的鉴定，主要方法：纤维素酶水解法、染色法，还有红外光谱分析，三者均为阳性，确定筛选是成功的；
(6)生理生化特征和16S rDNA分析：生理生化特征和16S rDNA分析，确定筛选菌株的种类。

4、  根据权利要求3所述葡糖醋杆菌的筛选方法，其特征在于，富集培养基：葡萄糖3％，酵母膏0.5％；乙酸钠0.2％，CaCO₃1％，用乙酸调pH至4.5，灭菌后加入5％乙醇和放线菌酮50mg/L；BSH培养基：葡萄糖2％，酵母提取物1％，柠檬酸0.1％，Na₂HPO₄·12H₂O0.5％，琼脂2％，pH 6.2。

1株葡糖醋杆菌及其筛选纯化方法
技术领域
本发明涉及1株葡糖醋杆菌及筛选纯化方法。
本发明得到的菌株已于2008年11月21日在中国典型培养物保藏中心保藏，编号：CCTCC NO：M208234，名称：葡糖醋杆菌G-29(Gluconacetobacter sp.)。
葡糖醋杆菌G-29是由残次青李中分离得到，根据分离该菌株的样品来源的名称和该菌株的编号命名为G-29。
背景技术
关于细菌纤维素，国外已经有120年的研究历史了，而中国从上世纪八十年代才开始起步。细菌纤维素和植物纤维素一样，都是由葡萄糖基通过β-1，4-糖苷键连接起来的大分子。植物纤维素是造纸、纺织、生物降解材料、医药、食品添加剂等工业的重要生产原料，但由于植物中木质素、半纤维素等的存在，使得高纯度纤维素的提取、精制成为工业领域的一项重大技术难题。而细菌纤维素由于具有纯度高、结晶度高、机械强度高、吸水量高及生物相容性好等优点，越来越成为科学界研究的热点。目前细菌纤维素已经成功应用于食品工业、化妆品业、造纸工业、声音振动膜、液晶材料、人造皮肤、药物载体、重金属离子吸收及生物降解材料等众多领域。
国内关于细菌纤维素产生菌的研究主要集中在木葡糖醋杆菌上(Gluconacetobacterxylinus)，关于其它产纤维素的细菌研究很少，在一定程度上制约了国内细菌纤维素的开发与应用。筛选不同新菌株为生产细菌纤维素不仅可以提供更多的原料，还能进一步丰富我国的菌种资源。是很重要的微生物类群，其菌体、菌落在外观和生理生化方面与醋杆菌、葡糖杆菌、葡糖酸杆菌非常相似，不借助DNA分析很难把它们区分。细菌纤维素具有纯度高、结晶度高、机械强度高、吸水量高及生物相容性好等优点，研究和开发细菌纤维素制品日益成为食品、造纸、声音振动膜、医用材料、污水治理及生物降解材料等领域的热点。近年，我国关于产纤维素细菌的分类划分非常混乱，依然沿用旧的命名法，关于其次级代谢产物--纤维素的研究主要停留在理论研究方面，还没有用于工业生产方面。关于葡糖醋杆菌属这方面的研究，尤其是关于中间葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter intermedius)的研究较少，本发明筛选得到的菌株与中间葡糖醋杆菌在16S rDNA分子序列比较，同源性高达99％，但它们的生理生化特征明显不一样，确定G-29为新菌种，丰富了我国的细菌菌种资源。
发明内容
本发明的目的是提供1株葡糖醋杆菌，并在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M208234；本发明的另一目的是提供葡糖醋杆菌的筛选纯化方法。
本发明的目的有以下技术措施实现
葡糖醋杆菌的筛选纯化方法包括以下步骤：
(1)富集培养
以残次水果的伤残处为原料，接种于含50mg/L放线菌酮和5％乙醇中的富集培养集中，置于恒温培养箱30℃培养5天，有凝胶膜出现者为阳性，并及时挑取培养过程中出现的凝胶膜，转入灭过菌的生理盐水中浸提1天；
(2)平板涂布
将步骤(1)得到的浸提液梯度稀释后涂布于BSH固体平板上并置于置于恒温培养箱30℃培养5天，挑单菌落重新接入BSH液体培养基中培养5天；
(3)初筛：将步骤(2)所产的膜取出放入灭过菌的生理盐水中浸泡1天，取浸提液平板划线置于恒温培养箱30℃培养5天，挑取生长的单菌落转接入斜面培养基中置于恒温培养箱30℃培养3天；
(4)复筛：将培养3天的斜面转接入BSH液体培养基中重新培养，有凝胶膜出现者为阳性，将阳性菌株编号并保藏；
(5)细菌纤维素的鉴定：要筛选能够产纤维素的细菌，一定要做产物的鉴定，主要方法：纤维素酶水解法、染色法，还有红外光谱分析，三者均为阳性，确定筛选是成功的；
(6)生理生化特征和16S rDNA分析：生理生化特征和16S rDNA分析，确定筛选菌株的种类。
以此经过上述6个筛选步骤，筛选得到纯菌株，将所得菌株分别在光学显微镜(革兰氏染色后)及电子显微镜下观察细菌，其形态特征：本发明菌株为革兰氏阴性菌，菌体为杆状，两端圆钝，菌宽0.6-0.8μm，菌长2.0-3.2μm(而中间葡糖醋杆菌一般只有2μm)，不形成芽孢，无鞭毛，不运动，菌落乳白色圆隆，有弹性，可在固体平板上滑动，时间久的话边缘会变得不整齐，不产色素，菌苔胶质状，易整块儿挑取，破碎难。固体和液体培养时均不产色素，产物纤维素分层叠加，能够在30％的葡萄糖培养基中生长，可以利用明胶，能够很好的利用蔗糖，能够将乳酸盐转化为纤维素，不能转化葡萄糖生酮，不能在含3％乙醇和5％乙酸的培养基中生长，培养时产酸量少，因此纤维素的产量较高。经16S rDNA分子鉴定，与中间葡糖醋杆菌的16S rDNA分子同源性最高，达99％以上，但生理生化特征差异显著。
本发明的上述方法分离得到了1种菌株，根据《伯杰氏细菌鉴定手册》第9版描述，并作16S rDNA序列比对分析，确定该菌株属于葡糖醋杆菌属，且与中间葡糖醋杆菌很接近。目前我国关于葡糖醋杆菌的研究很少，还没有关于中间葡糖醋杆菌的报道，因此我们筛选的菌种在一定程度上弥补了我国在这方面的空白，进一步丰富了我国的细菌菌种资源。
细菌纤维素在国外已成功应用于食品工业、造纸工业、医药工业、电子工业和环境保护方面，并取得了很大的很好的经济效益；我国开始在这方面的研究也越来越多，并取得了一些成就，如将细菌纤维素用于美容面膜、重金属离子吸收等，但目前主要停留在基础理论研究水平上，还没有真正的形成产业化。造成这种情况的主要原因就是细菌纤维素的产量相对较低，一般情况下每升BSH培养基只能产几克干燥的细菌纤维素，造成这种情况的主要原因是培养条件并非最优和菌株的种类，其中最重要原因是原始菌株的限制。我们筛选得到的菌株产酸相对较少，能够在含高浓度糖的情况下生长，并且能够分解胶，转化乳酸盐为纤维素，氮源和碳源选择范围相对较宽，并且pH值为6.5、温度20℃-33℃下的条件下细菌纤维素产量最高，在配制培养基的时候基本上不需要调节PH值，这在一定程度上又可以节约很多能源。因此，我们认为CCTCC NO：M208234菌株在理论研究和工业生产中具有极其重要的价值，对推动细菌纤维素工业生产有很好的实施前景。
附图说明
图1是菌株CCTCC NO：M208234的扫描电镜图
图2是菌株CCTCC NO：M208234所产纤维素的电镜扫描图
图1和图2的放大倍数均为5000倍
图3是菌株CCTCC NO：M208234所产纤维素的红外光谱分析图
具体实施方式
下面通过实施实例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容做出一些非本质的改进或调整。
实施例
葡糖醋杆菌菌株的筛选纯化方法包括以下步骤：
(1)富集培养
取残次水果的伤残处，接种于含50mg/L放线菌酮和5％乙醇中的富集培养集中，置30℃恒温培养箱中培养5天，及时挑取培养过程中出现的凝胶膜，转入灭过菌的生理盐水中浸提1天；
(2)平板涂布
将步骤(1)得到的浸提液梯度稀释后涂布于BSH固体平板上，并置于恒温培养箱30℃培养5天，挑单菌落重新接入BSH液体培养基中；
(3)初筛：将步骤(2)所产的膜取出放入灭过菌的生理盐水中浸泡1天，取浸提液平板划线培养5天，挑取生长的单菌落转接入斜面培养基培养；
(4)复筛：将上述培养3天的斜面转接入BSH液体培养基中重新培养，有凝胶膜出现者为阳性，将阳性菌株编号并保藏；
(5)细菌纤维素的鉴定：要筛选能够产纤维素的细菌，一定要做产物的鉴定，主要方法：纤维素酶水解法、染色法，还有红外光谱分析。
a、染色法：参照植物纤维素定性染色的方法
挑取单层薄膜(并用干燥滤纸作参考对照)置于载玻片上，烘干后上滴加66.5％的硫酸，再滴加等量的碘化钾溶液显色，若薄膜最后的颜色呈蓝黑色为纤维素；
b、采用纤维素酶水解法
精确称取0.1g纤维素酶粉末溶于25mL柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液(pH4.8)，在50℃下保温0.5h，然后称取0.05g的薄膜粉末，在50℃下水解40h。若水解后水解液透明澄清，则为阳性；
c、红外分光光度仪进行红外光谱测试
取干燥薄膜，压缩后厚度不超过3微米，若所测干燥薄膜的在不同波长下的吸收峰值与纤维素一致，则确定产物薄膜的主要成分就是纤维素，否则不是。
三者均为阳性，确定筛选是成功的。
(6)生理生化特征和16S rDNA分析：
生理生化特征(如表1所示)，16S rDNA分析(详见SEQUENCE LISTING)，
确认该菌株为新菌种。
表1 G-29的生理生化特征

注：(+)代表弱阳性
SEQUENCE LISTING
<110>四川大学生命科学学院
<120>1株葡糖醋杆菌及其筛选纯化方法
<160>1
<170>EditSeq 5.0221.0
<210>1
<211>1450
<212>DNA
<213>Gluconacetobacter sp.
<220>
<221>allele
<222>(1)…(1450)
<223>16S rDNA序列
<400>1