一种高效基因克隆方法 技术领域：
本发明是一种高效的基因克隆方法，适合于扩增基因组DNA和PCR产物，属于基因工程与分子生物学领域。
背景技术：
基因克隆技术是在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接，转入宿主细胞获得大量拷贝的过程，基本步骤为，制备目的DNA片段，用DNA连接酶连接DNA片段和载体，制成DNA重组体，将DNA重组体导入宿主细胞，筛选、鉴定。
目前，细菌基因组文库构建与真核、原核基因筛选等经常使用粘性末端克隆，T-末端克隆，平末端克隆等克隆方法。任海霞，王三英在《WP2深海细菌基因组文库的构建和克隆子测序比对分析》中报道了一种以BamH l酶切的pUC19为载体，通过与限制性内切酶Sau3A I酶切的WP2深海细菌DNA片段连接，电击转化感受态细胞E.coli DH5α的文库构建方法，该方法为粘性末端克隆。中国专利：一种基因克隆的高效方法。授权公告号(CN 118526C)公布了一种利用粘性末端克隆基因的方法。但是，粘性末端克隆法连接效率相对较低，同时必须向目的DNA片段引入酶切位点，造成了步骤上的相对繁琐。同时，载体的去磷酸化效率难以保证，稳定性不高。平末端连接法连接效率更差，只能用于单个基因克隆，很少用于基因文库构建。
目前，最为方便快捷的DNA克隆方法为A-T克隆法。市场上销售的T载体试剂盒主要是pUC18(pUC19)的衍生载体，即在pUC18(pUC19)的基础上通过添加限制性酶切序列后，经过不同生物酶修饰后得到的可以进行A-T克隆地载体，如TAKARA(Japan)在其A-T克隆载体使用说明书中公布的：在pUC18(pUC19)的多克隆位点中引入EcoR V酶切位点后，利用限制性内切酶EcoR V进行完全酶切，再利用末端转移酶在两侧的3’端加T产生。
发明内容：
本发明的目的是应用生物化学，分子生物学技术，提供一种能够简便，高效克隆细菌基因组DNA，PCR产物的方法，以解决基因克隆中繁琐程序。
本发明是这样实现的，选择pUC18(pUC19)质粒作为载体，采用Sal I酶切完全酶切产生5’端突出3个碱基的粘性末端
5’ ATGCCTGCAGG 3’
3’ TACGGACGTCCAGCT 5’
载体完全酶切后用Klenow酶补加碱基T、C、G，使载体片段末端5’端突出碱基T
5’ ATGCCTGCAGGTCG 3’
3’ TACGGACGTCCAGCT 5’
细菌基因组DNA采用限制性内切酶酶切或超声波酶切方法，断裂成DNA片段长度小于10kb的片段。细菌基因组DNA片段，PCR产物用Taq酶补平并在3’端加碱基A。
用上述方法修饰过的载体与DNA片段(PCR产物)通过A-T碱基末端互补而连接起来，经过转化大肠杆菌后蓝白斑互补筛选克隆基因。
本发明的原理是利用碱基互补配对的原则，使克隆载体与DNA片段产生能相互匹配的碱基末端，进行A-T克隆，极大地提高了克隆效率，同时进行蓝白斑筛选，便于基因的筛选。
具体实施方式：
实施例一 细菌基因组文库构建
(1)将小麦叶片浸入含0.05％吐温20的灭菌水中，摇床振荡30分钟，中间取出摇晃均匀。
(2)把含上述微生物的洗脱液10倍梯度无菌水稀释，不同稀释度分别在LB固体培养基上(1％蛋白胨，0.05％酵母膏，0.05％Nacl，1.5％琼脂粉)30℃下培养48小时，挑取单菌落并在LB固体培养基上划线分离纯化三次。
(3)分别挑取单菌落在LB液体培养基上(1％蛋白胨，0.05％酵母膏，0.05％Nacl)30℃下，于恒温振荡器上200转/分钟培养24小时，8000转/分钟收集菌体，采用上海生工生产的基因组DNA提取试剂盒(货号：SK120101)提取各自的基因组。
(4)将细菌基因组DNA利用Sau3A I酶切，酶切完全后补平并在DNA3’末端加上碱基A，50μl体系构成为1×PCR buffer，2.5mM MgCl2，200μM of each dNTP，2.5 units of TaKaRa Taq DNApolymerase and 10ng genomic DNA，反应条件为72℃ 10min。
(5)将pUC18(pUC19)质粒利用Sal I双酶切，酶切完全后在DNA3’末端加上碱基T、C、G，50μl体系构成为1×PCR buffer，2.5mM MgCl2，200μM of dCTP，dTTP，dGTP，2.5 unitsof TaKaRa Klenow酶和10ng质粒DNA.反应条件为72℃ 10min。
(6)将第四步、第五步制备的载体与DNA片段进行酶连，并转化入大肠杆菌DH5α感受态中，在涂有X-Gal，IPTG，Amp的LB平板上挑选白色菌落。
实施例二：细菌16SrDNA基因克隆
1.将小麦叶片浸入含0.05％吐温20的灭菌水中，摇床振荡30分钟，中间取出摇晃均匀。
2.把含上述微生物的洗脱液10倍梯度无菌水稀释，不同稀释度分别在LB固体培养基上(1％蛋白胨；0.5％酵母膏，0.5％Nacl，1.5％琼脂粉)30℃下培养48小时，挑取单菌落并在LB固体培养基上划线分离纯化三次。
3.挑取单菌落在LB液体培养基上(1％蛋白胨，0.05％酵母膏，0.05％Nacl)30℃下，于恒温振荡器上200转/分钟培养24小时，8000转/分钟收集菌体，采用上海生工生产的基因组DNA提取试剂盒(货号：SK120101)提取各自的基因组。
4.以上述基因组为模板，以细菌16S通用引物F38，R1401为引物，PCR扩增16S基因片段。PCR程序为94℃ 5min，94℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 2min，72℃ 10min，35个循环。
5.将pUC18(pUC19)质粒利用Sal I双酶切，酶切完全后在DNA3’末端加上碱基T、C、G，50μl体系构成为1×PCR buffer，2.5mM MgCl2，200μM of dCTP，dTTP，dGTP，2.5 units of TaKaRa Klenow酶与10ng质粒DNA，反应条件为72℃ 10min。
6.将第四步、第五步制备的载体与PCR产物进行酶连，并转化入大肠杆菌DH5α感受态中，在涂有X-Gal，IPTG，Amp的LB平板上挑选白色菌落。